국내 육성 추파 품종인 '영산' 유채의 자엽 부착 잎자루 부위를 이용하여 재분화와 형질전환의 효율 증진에 영향을 주는 요인을 살펴보았다. 줄기 형성율은 NAA 0.5 mg/L와 Kinetin 2~4mg/L가 혼용 첨가된 배지에서 61~71%로 가장 양호하였다. 또한 질산은(Silver nitrate) 5~9 mg/L 첨가는 재분화에 필수적이었고, $GA_3$ 0.01 mg/L 첨가는 재분화에 긍정적인 영향을 주는 것으로 관찰되었다. 아그로박테리움의 Strain 종류, 공동배양 시간, 그리고 형질전환체 초기 선발시 항생제 농도 조절(저${\rightarrow}$고농도)에 따른 '영산' 유채의 형질전환 효율을 살펴본 결과, 아그로박테리움의 Strain 선정이 가장 중요한 요인으로 조사되었다. 특히, EHA105 succinamopine strain을 사용하였을 때 형질전환 효율이 26.8%로 가장 효과적이었다. Bar 유전자와 GUS 유전자가 내재된 형질전환체는 제초제 '바스타' 살포시 생존하고, X-Gluc으로 염색되었다. 그리고 Southern 분석을 통해 후대로 유전자가 안정적으로 유전됨을 확인하였다.
국내 육성 추파 품종인 '영산' 유채의 자엽 부착 잎자루 부위를 이용하여 재분화와 형질전환의 효율 증진에 영향을 주는 요인을 살펴보았다. 줄기 형성율은 NAA 0.5 mg/L와 Kinetin 2~4mg/L가 혼용 첨가된 배지에서 61~71%로 가장 양호하였다. 또한 질산은(Silver nitrate) 5~9 mg/L 첨가는 재분화에 필수적이었고, $GA_3$ 0.01 mg/L 첨가는 재분화에 긍정적인 영향을 주는 것으로 관찰되었다. 아그로박테리움의 Strain 종류, 공동배양 시간, 그리고 형질전환체 초기 선발시 항생제 농도 조절(저${\rightarrow}$고농도)에 따른 '영산' 유채의 형질전환 효율을 살펴본 결과, 아그로박테리움의 Strain 선정이 가장 중요한 요인으로 조사되었다. 특히, EHA105 succinamopine strain을 사용하였을 때 형질전환 효율이 26.8%로 가장 효과적이었다. Bar 유전자와 GUS 유전자가 내재된 형질전환체는 제초제 '바스타' 살포시 생존하고, X-Gluc으로 염색되었다. 그리고 Southern 분석을 통해 후대로 유전자가 안정적으로 유전됨을 확인하였다.
To improve genetic transformation of Brassica napus winter cultivar 'Youngsan', factors influencing shoot regeneration and transformation from cotyledonary petioles were investigated. Shoot induction was enhanced in the combination of 0.5 mg/L NAA and 2~4 mg/L kinetin. Silver nitrate was essential f...
To improve genetic transformation of Brassica napus winter cultivar 'Youngsan', factors influencing shoot regeneration and transformation from cotyledonary petioles were investigated. Shoot induction was enhanced in the combination of 0.5 mg/L NAA and 2~4 mg/L kinetin. Silver nitrate was essential for successful shoot regeneration, ranging from 5 to 9 mg/L. The addition of $GA_3$ promoted plant regeneration. Among the tested Agrobacterium strains, co-cultivation times, and antibiotic selection regimes, choice of appropriate Agrobacterium strain was the most critical factor for efficient transformation of B. napus cv. 'Youngsan'. The EHA105 succinamopine strain was the most efficient and the maximum transformation efficiency was 26.8%. Transgenic shoots were selected on 10 mg/L phosphinothricin (PPT) containing media. The transgenic plants expressing bar and gus genes were resistant for commercial herbicide "Basta" and stained with X-Gluc. Southern blot hybridization indicated that the presence of one to three gus gene copies per genome and inheritance of the gus gene into the $T_1$ generation.
To improve genetic transformation of Brassica napus winter cultivar 'Youngsan', factors influencing shoot regeneration and transformation from cotyledonary petioles were investigated. Shoot induction was enhanced in the combination of 0.5 mg/L NAA and 2~4 mg/L kinetin. Silver nitrate was essential for successful shoot regeneration, ranging from 5 to 9 mg/L. The addition of $GA_3$ promoted plant regeneration. Among the tested Agrobacterium strains, co-cultivation times, and antibiotic selection regimes, choice of appropriate Agrobacterium strain was the most critical factor for efficient transformation of B. napus cv. 'Youngsan'. The EHA105 succinamopine strain was the most efficient and the maximum transformation efficiency was 26.8%. Transgenic shoots were selected on 10 mg/L phosphinothricin (PPT) containing media. The transgenic plants expressing bar and gus genes were resistant for commercial herbicide "Basta" and stained with X-Gluc. Southern blot hybridization indicated that the presence of one to three gus gene copies per genome and inheritance of the gus gene into the $T_1$ generation.
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문제 정의
따라서, 본 연구는 ‘영산’ 품종의 형질전환 효율 향상을 위해 재분화가 잘 되는 식물생장호르몬 조건을 구명하였다.
제안 방법
MS배지[Murashig와 Skoog, 1962]에 설탕(삼양사)을 농도에 맞게 첨가한 후 pH를 5.7로 조정한 후, 배지 응고제를 해당 농도에 맞게 첨가하고 고압 멸균하였다. 식물생장호르몬, Acetosyringone 및 질산은(AgNO3)은 보통 1000배액으로 만든 후 여과 살균하였고, 배지를 대략 60℃로 식힌 후 적정량을 첨가하였다.
Probe는 GUS 유전자의 일부(Forward: 5'-AACCACGCGTCTGTTGACTGGCAGGTG-3'; Reverse: 5'-CCACGCTTGGGTGGTTTTTGTCACGCG-3', 625 bp)와 Ready-To-GoTM (GE Healthcare, Piscataway, NJ)와 방사선동위원소(γ-32P-labelled deoxyribonucleoside triphosphate)을 사용하여 만들었다.
그래서 우리는 공동배양이 끝난 ‘영산’ 유채의 절편을 PPT가 첨가되지 않은 배지에서 1주일간 배양한 후, PPT 5 mg/L가 첨가된 선발배지에서 배양하다가 줄기가 형성되고 나면 PPT 10 mg/L가 첨가된 선발배지로 옮겨 배양하면서 완전 재분화 개체를 획득하였다.
그리고 ‘영산’ 품종의 유전자형과 상호반응이 높은 아그로박테리움 계통(Strain)과 농도 조건을 조사하였다.
65℃가 유지되는 배양기에서 40 rpm 속도로 회전하며 밤새 Hybridization 하였다. 세척과정(2X SSC/0.1% SDS, 10분간 2반복; 0.2X SSC/0.1% SDS, 10분간 2반복)을 거친 후 X-ray 필름에 노출시켜 확인하였다.
Jefferson[1987]의 방법에 준하여, 형질전환 처리과정을 거친 식물절편(Cotyledonary petiole)의 끝부분에서 캘러스가 형성되는 배양 4주째에 GUS 활성을 조사하였다. 식물 절편을 GUS 염색약(1 mM X-gluc, 100 mM Phosphate buffer, 1 mM Potassium ferricyanide, 1 mM Potassium ferrocyanide)에 담근 후, 37℃가 유지되는 항온기에서 24시간 반응하였다. 잎자루 끝부분에 형성된 캘러스 또는 비대조직에 푸른색 반점(Spot)이 있으면 그 식물개체는 GUS 활성이 있다고 판단하였으며, 이 때 반점의 강약은 따로 구분하지 않았다.
영산 유채의 자엽 부착 잎자루 부위(Cortyledonary petiole)를 아그로박테리움에 감염시킨 후 GUS 염색을 통해 형질전환 유무를 판단하여 형질전환효율을 살펴보았다(Fig. 1a). 형질전환 과정에서 사용한 배지는 Table 3과 같다.
형질전환 과정을 거쳐 재분화 된 식물체로부터 분리한 Genomic DNA 10 µg을 Hind III(식물체 핵내로 삽입되는 Border내에 존재하는 단일 제한효소)로 처리하였다.
대상 데이터
농촌진흥청 국립식량과학원 바이오에너지작물센타에서 육성한 고정종(OP; Open pollination)인 ‘영산’을 분양 받아 실험에 사용하였다.
상이한 Opine과 Tiplasmid를 갖는 Agrobacterium tumefaciens 3종이 사용되었고, 여기에는 pCAMBIA3301 운반체가 내포되었다(Table 2). pCAMBIA3301은 phosphinothricin (PPT)에 저항성을 나타나는 Bar 유전자와 β-glucuronidase (Gus) 유전자를 포함하며, 각 각의 유전자는 양방향의 Cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S 프로모터에 의해 작동한다.
형질전환 과정에서 사용한 배지는 Table 3과 같다.영산 유채의 형질전환 효율 향상을 위해 서로 다른 Opine과 Ti-plasmid를 가지고 있는 3종의 아그로박테리움을 사용하였다(Table 2). Table 5의 결과를 보면, 아그로박테리움 계통 중 Succinamopine 을 갖는 EHA105가 영산 유채에 형질전환을 가장 잘 되게 하였고, 아그로박테리움의 농도가 높으면 높을수록 형질전환율이 평균 10% 대에서 평균 20%대로 증가하는 것으로 조사되었다.
우리는 국내 육성 품종 중 올레인산 함량이 높아 바이오디젤 원료로 사용하기에 적합하고, 수량성이 좋은 ‘영산’ 품종을 선정하여 형질전환 하였다.
데이터처리
모든 실험은 독립적으로 최소 3번 이상 수행되었으며, 매 실험마다 처리별 최소 2반복 이상하였다. 식물생장호르몬 처리간 평균값의 유의성은 Duncan의 다중검정으로 확인하였고, 아그로박테리움의 Strain과 농도별 처리간 평균값의 유의성은 Student의 t-검정으로 확인하였다.
이론/모형
Jefferson[1987]의 방법에 준하여, 형질전환 처리과정을 거친 식물절편(Cotyledonary petiole)의 끝부분에서 캘러스가 형성되는 배양 4주째에 GUS 활성을 조사하였다. 식물 절편을 GUS 염색약(1 mM X-gluc, 100 mM Phosphate buffer, 1 mM Potassium ferricyanide, 1 mM Potassium ferrocyanide)에 담근 후, 37℃가 유지되는 항온기에서 24시간 반응하였다.
성능/효과
‘영산’ 유채의 재분화를 향상시키기 위해 여러 종류의 식물생장호르몬을 단독 또는 혼용하여 처리한 결과, Auxin과 Cytokinin을 혼용(1-naphthaleneacetic acid (NAA)와 6-benzylaminopurine (BAP) 또는 NAA와 Kinetin) 첨가하였을 때 재분화가 잘 되는 것을 관찰하였으며(Table 3), 2,4-D, Zeatin 그리고 Indole-3-acetic acid (IAA) 첨가는 재분화에 효과가 없는 것으로 관찰되었다(Data not shown).
AgNO3 첨가가 재분화에 미치는 영향을 살펴보면 줄기 재분화에는 AgNO3 가 반드시 필요하였다(Table 4). AgNO3의 경우 농도는 적어도 5 mg/L 이상이 적합하였고, 최고 9 mg/L까지 첨가하여 재분화가 이루어지는 것을 관찰하였으며, 농도와 재분화율이 비례하는 상관관계는 관찰되지 않았다. 이 외에도 GA3를 0.
2). Bar 유전자가 들어간 후대 형질전환체는 유묘기(본엽 1-2매)에 0.5% 바스타액제(글루포시네이트암모늄액제)를 살포하여 약해가 전혀 없는 개체임을 확인하였다(Data not shown). Bar 유전자가 들어있는 후대 형질전환체 내 GUS 유전자는 Southern 분석을 통해 개체별 1~3 copy가 존재하는 것을 확인하였다(Fig.
Brassica 속(屬) 작물인 ‘영산’ 유채 또한 AgNO3가 첨가되어야 만 재분화가 이루어졌으며, GA3 첨가는 재분화에 긍정적인 효과가 있는 것으로 조사되었으나, 필수적인 요인은 아닌 것으로 사료된다.
영산 유채의 형질전환 효율 향상을 위해 서로 다른 Opine과 Ti-plasmid를 가지고 있는 3종의 아그로박테리움을 사용하였다(Table 2). Table 5의 결과를 보면, 아그로박테리움 계통 중 Succinamopine 을 갖는 EHA105가 영산 유채에 형질전환을 가장 잘 되게 하였고, 아그로박테리움의 농도가 높으면 높을수록 형질전환율이 평균 10% 대에서 평균 20%대로 증가하는 것으로 조사되었다. Nopaline을 갖는 GV3101은 농도 0.
공동배양기간에 따른 ‘영산’ 유채의 형질전환 효율을 살펴본 결과 큰 차이가 없는 것으로 조사되었으며, 우리 실험실에서는 실험여건에 따라 2~4일정도 공동배양하고 있다.
그래서 우리는 공동배양이 끝난 ‘영산’ 유채의 절편을 PPT가 첨가되지 않은 배지에서 1주일간 배양한 후, PPT 5 mg/L가 첨가된 선발배지에서 배양하다가 줄기가 형성되고 나면 PPT 10 mg/L가 첨가된 선발배지로 옮겨 배양하면서 완전 재분화 개체를 획득하였다. 그러나 이렇게 하여 얻어진 개체의 형질전환 유무를 검정한 결과, 평균 50% 이상이 비형질전환체로 확인되었으며, 형질전환 효율에 있어서도 초기단계에서부터 PPT 10 mg/L가 첨가된 선발배지에서 배양한 처리군과 큰 차이가 없는 것으로 나타났다.
모든 실험은 독립적으로 최소 3번 이상 수행되었으며, 매 실험마다 처리별 최소 2반복 이상하였다. 식물생장호르몬 처리간 평균값의 유의성은 Duncan의 다중검정으로 확인하였고, 아그로박테리움의 Strain과 농도별 처리간 평균값의 유의성은 Student의 t-검정으로 확인하였다.
본 실험에서 ‘영산’ 유채는 Succinamopine type을 갖는 EHA105에 가장 민감하게 반응하였으며, 농도가 높을수록 형질전환이 잘 되는 경향을 보인 반면, Octopine type의 LBA4404는 ‘영산’ 유채의 형질전환에 사용하기가 적합하지 않은 것으로 사료되었다.
본 실험에서는 ‘영산’ 유채의 경우 NAA와 BAP의 혼용보다 NAA와 Kinetin의 혼용 첨가구에서 재분화가 더 잘되는 것을 알 수 있었다.
AgNO3의 경우 농도는 적어도 5 mg/L 이상이 적합하였고, 최고 9 mg/L까지 첨가하여 재분화가 이루어지는 것을 관찰하였으며, 농도와 재분화율이 비례하는 상관관계는 관찰되지 않았다. 이 외에도 GA3를 0.01 mg/L첨가할 경우 재분화에 긍정적인 효과가 있는 것으로 조사되었으며, 농도를 0.05 mg/L 이상 첨가하면 재분화율이 감소하는 부정적인 효과가 관찰되었다.
재료부위에 따른 형질전환 효율은 하배축≥자엽 부착 잎자루>자엽 순으로 조사되었으나, 하배축의 경우 캘러스로부터 줄기가 형성되는 데 소요된 배양 일수가 30~120일 정도로 길고, 변이 폭이 큰 특징이 있는 반면, 자엽 부착 잎자루는 평균 30~60일 정도로 짧고, 비교적 변이 폭이 작아 ‘영산’ 유채의 형질전환 재료로 사용하기에 적합하다고 판단하였다.
1a-c). 재분화된 형질전환체는 순화과정을 거쳐 원예용 상토가 담긴 포트로 이식되어 온실에서 육성되었고, 개화 및 종자형성에 이르기까지 정상적으로 생육하는 것을 관찰 하였다(Fig. 1d,e). 형질전환된 Bar 유전자와 GUS 유전자가 후대(T1세대)로 유전되는 것을 확인하였다(Fig.
처리구 4~6에서는 노란색의 캘러스가 다른 처리구에 비하여 많이 발생하였으며, 이 캘러스는 줄기로 재분화가 되지 않고 계속 캘러스 상태로 유지하다가 결국 갈색으로 변하며 조직이 괴사하는 특징을 보였다. 줄기형성은 BAP가 첨가된 처리구에 비해 Kinetin이 첨가된 처리구가 더 양호하였다. 특히, 처리구 7~9에 해당하는 NAA 0.
‘영산’ 유채의 재분화를 향상시키기 위해 여러 종류의 식물생장호르몬을 단독 또는 혼용하여 처리한 결과, Auxin과 Cytokinin을 혼용(1-naphthaleneacetic acid (NAA)와 6-benzylaminopurine (BAP) 또는 NAA와 Kinetin) 첨가하였을 때 재분화가 잘 되는 것을 관찰하였으며(Table 3), 2,4-D, Zeatin 그리고 Indole-3-acetic acid (IAA) 첨가는 재분화에 효과가 없는 것으로 관찰되었다(Data not shown). 캘러스는 전반적으로 모든 처리구에서 잘 형성되었으며, 캘러스 색 또한 대체적으로 녹색을 띄었다. 처리구 4~6에서는 노란색의 캘러스가 다른 처리구에 비하여 많이 발생하였으며, 이 캘러스는 줄기로 재분화가 되지 않고 계속 캘러스 상태로 유지하다가 결국 갈색으로 변하며 조직이 괴사하는 특징을 보였다.
줄기형성은 BAP가 첨가된 처리구에 비해 Kinetin이 첨가된 처리구가 더 양호하였다. 특히, 처리구 7~9에 해당하는 NAA 0.5 mg/L 첨가구가 NAA 1.0 mg/L 첨가구보다 줄기형성율이 좋았다. 개체당 형성되는 줄기수는 전반적으로 평균 1~2개 정도 형성되었고, 처리간 큰 차이는 없는 것으로 간주하였다.
1d,e). 형질전환된 Bar 유전자와 GUS 유전자가 후대(T1세대)로 유전되는 것을 확인하였다(Fig. 2). Bar 유전자가 들어간 후대 형질전환체는 유묘기(본엽 1-2매)에 0.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
유채의 활용범위는?
유채의 활용범위를 살펴보면, 종자기름은 식용유 및 바이오디젤 원료로 쓰이며, 꽃은 지역 축제 행사를 통해 관광자원으로 이용되고 있으며, 최근 박(粕)은 동물사료로 사용되고 있다.
국내 육성 품종 중 영산 품종의 장점은?
우리는 국내 육성 품종 중 올레인산 함량이 높아 바이오디젤 원료로 사용하기에 적합하고, 수량성이 좋은 ‘영산’ 품종을 선정하여 형질전환 하였다. Bhalla와 Singh[2008]의 방법에 준하여 형질전환을 한 결과, 형질전환 효율이 0.
아그로박테리움의 Strain 중 가장 형질전환 효율 증진에 효과적인 것은?
아그로박테리움의 Strain 종류, 공동배양 시간, 그리고 형질전환체 초기 선발시 항생제 농도 조절(저${\rightarrow}$고농도)에 따른 '영산' 유채의 형질전환 효율을 살펴본 결과, 아그로박테리움의 Strain 선정이 가장 중요한 요인으로 조사되었다. 특히, EHA105 succinamopine strain을 사용하였을 때 형질전환 효율이 26.8%로 가장 효과적이었다. Bar 유전자와 GUS 유전자가 내재된 형질전환체는 제초제 '바스타' 살포시 생존하고, X-Gluc으로 염색되었다.
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