[국내논문]배합사료의 다양한 첨가제가 넙치(Paralichthys olivaceus) 치어의 성장, 혈액 성상, 지방산 조성, 유전자 발현 및 조직 성상에 미치는 영향 Effects of Dietary Inclusion of Various Additives on Growth Performance, Hematological Parameters, Fatty Acid Composition, Gene Expression and Histopathological Changes in Juvenile Olive Flounder Paralichthys olivaceus원문보기
This feeding experiment was conducted to investigate the effects of dietary inclusion of various additives on growth performance, hematological parameters, fatty acid composition, gene expression and histopathological changes in juvenile olive flounder (Paralichthys olivaceus). Eleven isonitrogenous...
This feeding experiment was conducted to investigate the effects of dietary inclusion of various additives on growth performance, hematological parameters, fatty acid composition, gene expression and histopathological changes in juvenile olive flounder (Paralichthys olivaceus). Eleven isonitrogenous (49% crude protein) and isolipidic (10% crude lipid) experimental diets were formulated: no additives (Con); 5% kelp meal (Ke); 10% krill meal (Kr); 1% garlic powder (Ga); 1% citrus meal (Ci); 3% onion powder (On); 1% ginger powder (Gi); 1% mugwort powder (Mu); 1% licorice powder (Li); 1% wasabi powder (Wa); and a mixture (Mix) of these additives. Three replicate groups of juvenile flounder (average weight of 8.5 g) were fed one of the experimental diets to visual satiety twice a day for 15 weeks. The dietary inclusion of additives did not affect survival, weight gain, specific growth rate feed efficiency, daily feed intake, daily protein intake, protein efficiency ratio, hepatosomatic index and visceralsomatic index of the fish. Plasma triglyceride levels were significantly lower in fish fed the Ke, Ga, On, Gi, Mu, Li, and Mix diets than in fish fed the control diet. Plasma glucose, glutamic oxaloacetic transaminase and total cholesterol did not differ among dietary treatments. No significant difference was observed in fatty acid composition and lipid content of the dorsal muscle in fish fed the experimental diets. Myosin gene expression did not differ significantly among treatments after 5 weeks but was significantly lower in fish fed the Kr, Ci, Li, and Mix diets than in control group after 15 weeks. Histopathological analysis showed mild gill hyperplasia and mild necrosis of liver parenchymal cells in several individuals of each experimental group. These conditions were also observed in the control group and were not thought to be related to the inclusion of feed additives. The present findings indicate that the dietary inclusion of additives did not affect growth performance, fatty acid composition, gene expression, and histopathological changes in juvenile flounder. However, plasma triglyceride content may be reduced by supplementation with 5% kelp meal, 3% onion powder, 1% garlic powder, 1% ginger powder, 1% mugwort powder, and the additive mixture.
This feeding experiment was conducted to investigate the effects of dietary inclusion of various additives on growth performance, hematological parameters, fatty acid composition, gene expression and histopathological changes in juvenile olive flounder (Paralichthys olivaceus). Eleven isonitrogenous (49% crude protein) and isolipidic (10% crude lipid) experimental diets were formulated: no additives (Con); 5% kelp meal (Ke); 10% krill meal (Kr); 1% garlic powder (Ga); 1% citrus meal (Ci); 3% onion powder (On); 1% ginger powder (Gi); 1% mugwort powder (Mu); 1% licorice powder (Li); 1% wasabi powder (Wa); and a mixture (Mix) of these additives. Three replicate groups of juvenile flounder (average weight of 8.5 g) were fed one of the experimental diets to visual satiety twice a day for 15 weeks. The dietary inclusion of additives did not affect survival, weight gain, specific growth rate feed efficiency, daily feed intake, daily protein intake, protein efficiency ratio, hepatosomatic index and visceralsomatic index of the fish. Plasma triglyceride levels were significantly lower in fish fed the Ke, Ga, On, Gi, Mu, Li, and Mix diets than in fish fed the control diet. Plasma glucose, glutamic oxaloacetic transaminase and total cholesterol did not differ among dietary treatments. No significant difference was observed in fatty acid composition and lipid content of the dorsal muscle in fish fed the experimental diets. Myosin gene expression did not differ significantly among treatments after 5 weeks but was significantly lower in fish fed the Kr, Ci, Li, and Mix diets than in control group after 15 weeks. Histopathological analysis showed mild gill hyperplasia and mild necrosis of liver parenchymal cells in several individuals of each experimental group. These conditions were also observed in the control group and were not thought to be related to the inclusion of feed additives. The present findings indicate that the dietary inclusion of additives did not affect growth performance, fatty acid composition, gene expression, and histopathological changes in juvenile flounder. However, plasma triglyceride content may be reduced by supplementation with 5% kelp meal, 3% onion powder, 1% garlic powder, 1% ginger powder, 1% mugwort powder, and the additive mixture.
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문제 정의
본 연구에서는 기존에 수행된 넙치의 영양소 이용성에 관한 연구결과들을 토대로 배합사료를 설계하여 다양한 첨가제가 넙치 치어의 성장, 혈액 성상, 지방산 조성, 유전자 발현 및 조직 성상에 미치는 영향을 조사하고자 수행하였다.
제안 방법
Real-time PCR은 SyBr green premix (Takara) 10 μL, cDNA 2 μL 및 Primer 각각 10 pM을 사용하여 ABI 7200 실시간 중합효소 연쇄 반응기를 사용하여 측정하였다.
각 수조마다 약하게 폭기시켜 산소를 공급하였고, 여과된 자연해수를 각 실험수조마다 분당 2 L로 조절하여 흘려주었으며, 사육기간 동안의 수온은 20.9±1.2℃(평균±표준편차)였다.
gi154782721) 유전자를 사용하였다 (Table 2). 각각의 유전자는 매회 반응 시마다 dissociation curve를 확인하여 프라이머의 비특이적 결합 및 genomic DNA 오염을 확인하였다. Real-time PCR로 측정된 Ct값은 HSC70 유전자의 Ct값을 사용 하여 normalize하였으며, 2-ΔΔCt (Kenneth et al.
2℃(평균±표준편차)였다. 그리고 사료공급 1시간 후, 사육수를 환수시켜 배설물과 사료찌꺼기를 제거해 주었으며, 각 수조에서 죽은 개체는 매일 제거해 주었다.
실험사료의 주요 단백질원으로 어분과 대두박, 탄수화물 원으로 소맥분 그리고 지질원으로 오징어간유, 아마인유 및 대두유를 각각 사용하였다 (Table 1). 다양한 첨가제의 효과를 조사하기 위하여 대조사료 (Con)의 어분 대신 10% 크릴 (Kr), 소맥분 대신 5% 켈프 (Ke), 3% 양파 (On) 그리고 마늘 (Ga), 감귤 (Ci), 생강 (Gi), 약쑥 (Mu), 감초 (Li) 및 와사비 (Wa)를 각각 1%씩 분말형태로 첨가하여 넙치의 영양소 요구량 (CP 50%, CL 10%)을 충족시키는 (Kim et al., 2004; Lee and Kim, 2005) 총 11종류의 실험사료를 설계하였다. 이와 같이 설계된 원료들을 잘 혼합한 후 원료 100 g 당 물 40 g 정도를 첨가하여 moist pellet 제조기로 압출성형 하였다.
보관하던 조직을 액체질소 하에서 분쇄한 후 Trizol reagent (Invitrogen)를 사용하여 total RNA를 분리, 4 μg의 RNA를 Oligo-dT 프라이머를 사용하여 mRNA만을 cDNA로 합성한후 Real-time PCR 분석에 사용하였다.
, 2006) 등 어류의 근육 성장에 잠재적인 생화학적 marker로 사용되고 있다. 본 연구에서는 각 첨가제에 따른 넙치 치어의 성장을 myosin mRNA의 발현을 통하여 확인하였다 (Fig. 1과 Fig. 2). 첨가제를 함유한 사료를 공급한 5주 후에는 실험구간에 유의한 차이를 보이지 않았으나 (P>0.
실험사료 공급에 따른 넙치 각 장기의 병리조직학적 변화를 관찰하기 위해, 실험 개시 이전에 무작위로 5마리를 채집 하여 MS-222 200 ppm에 마취시킨 후 방혈하여 Bouin's solution (포화 picric acid 수용액: 포르말린 원액: 빙초산 = 15: 5: 1) 고정액에 하루 이상 고정하였다. 사육실험 5주 및 15주 후 각 처리구별로 5마리씩 무작위로 채집하여 동일한 방법으로 처리하였다. 이후, 탈수 및 포매 과정을 거쳐 5 ㎛두께의 파라핀 절편을 각 장기별로 제작하여 Hematoxylin and Eosin 염색을 한 후 광학현미경으로 관찰하였다.
사육실험 시작시와 종료시에는 측정 전일 절식시킨 후 MS-222 100 ppm 수용액에 마취시켜 수조에 수용된 모든 실험어의 무게를 측정하였다. 실험사료 및 근육의 조단백질 (N×6.
실험사료 공급에 따른 넙치 각 장기의 병리조직학적 변화를 관찰하기 위해, 실험 개시 이전에 무작위로 5마리를 채집 하여 MS-222 200 ppm에 마취시킨 후 방혈하여 Bouin's solution (포화 picric acid 수용액: 포르말린 원액: 빙초산 = 15: 5: 1) 고정액에 하루 이상 고정하였다.
실험사료 및 근육의 조단백질 (N×6.25)은 Auto Kjeldahl system (Buchi, Flawil, Switzerland)을 사용하여 분석하였고, 조지방은 ether를 사용하여 추출하였으며, 수분은 105℃ dry oven에서 6시간 동안 건조 후 측정하였고, 조회분은 600℃ 회화로에서 4시간 동안 태운 후 정량하였다.
23 g 전후의 실험어를 무작위로 선별하여 총 33개의 수조 (50 L 사각수조)에 40마리씩 3반복으로 수용하여 15주간 사육실험 하였다. 실험사료는 1일 2회 (09:00 h, 17:00 h) 실험어가 먹을 때 까지 만복으로 공급하였다. 각 수조마다 약하게 폭기시켜 산소를 공급하였고, 여과된 자연해수를 각 실험수조마다 분당 2 L로 조절하여 흘려주었으며, 사육기간 동안의 수온은 20.
, 2004; Lee and Kim, 2005) 총 11종류의 실험사료를 설계하였다. 이와 같이 설계된 원료들을 잘 혼합한 후 원료 100 g 당 물 40 g 정도를 첨가하여 moist pellet 제조기로 압출성형 하였다. 제조된 실험사료는 실온에서 24시간 건조한 후, -30℃에서 보관하면서 넙치에게 공급하였다.
사육실험 5주 및 15주 후 각 처리구별로 5마리씩 무작위로 채집하여 동일한 방법으로 처리하였다. 이후, 탈수 및 포매 과정을 거쳐 5 ㎛두께의 파라핀 절편을 각 장기별로 제작하여 Hematoxylin and Eosin 염색을 한 후 광학현미경으로 관찰하였다.
평균체중 8.8±0.23 g 전후의 실험어를 무작위로 선별하여 총 33개의 수조 (50 L 사각수조)에 40마리씩 3반복으로 수용하여 15주간 사육실험 하였다.
이때, injector와 detector (FID) 온도는 260℃로 각각 설정하였으며, 표준 지방산으로 37개 지방산 혼합물 (PUFA 37 Component FAME Mix, Supelco)을 사용하였다. 혈액의 성상 변화를 조사하기 위해 각 실험구당 넙치를 5마리씩 무작위로 추출하여 헤파린이 처리된 3 ml 주사기로 실험어의 미부 혈관에서 채혈하였으며, 원심분리 (3,500 rpm, 10분)하여 얻은 혈장을 동결보존 (-70℃)하였다. 혈장내 total protein은 biuret법으로, glucose는 효소법으로, glutamic oxaloacetic transaminase (GOT)는 kinetic UV법으로, total cholesterol은 COD-POD법을 사용하여 각각 분석하였다.
대상 데이터
Real-time PCR은 SyBr green premix (Takara) 10 μL, cDNA 2 μL 및 Primer 각각 10 pM을 사용하여 ABI 7200 실시간 중합효소 연쇄 반응기를 사용하여 측정하였다. 발현분석에는 myosin (NCBI GenBank Accession No. gi5018506) 유전자와 house keeping 유전자인 HSC70 (heat shock cognate 70, NCBI GenBank Accession No. gi154782721) 유전자를 사용하였다 (Table 2). 각각의 유전자는 매회 반응 시마다 dissociation curve를 확인하여 프라이머의 비특이적 결합 및 genomic DNA 오염을 확인하였다.
실험사료의 주요 단백질원으로 어분과 대두박, 탄수화물 원으로 소맥분 그리고 지질원으로 오징어간유, 아마인유 및 대두유를 각각 사용하였다 (Table 1). 다양한 첨가제의 효과를 조사하기 위하여 대조사료 (Con)의 어분 대신 10% 크릴 (Kr), 소맥분 대신 5% 켈프 (Ke), 3% 양파 (On) 그리고 마늘 (Ga), 감귤 (Ci), 생강 (Gi), 약쑥 (Mu), 감초 (Li) 및 와사비 (Wa)를 각각 1%씩 분말형태로 첨가하여 넙치의 영양소 요구량 (CP 50%, CL 10%)을 충족시키는 (Kim et al.
전북 고창의 개인 양식장에서 생산된 넙치 치어를 구입하여 강릉원주대학교 해양생물연구교육센터로 수송한 후 상품 사료로 2주간 예비 사육하였다. 평균체중 8.
데이터처리
성장, 사료 이용효율, 어체 일반성분, 혈액성상 및 지방산 조성을 One-way ANOVA-test를 실시한 후, Duncan's multiple range test (Duncan, 1955)로 평균간의 유의성 (P<0.05)을 검정하였다.
05)을 검정하였다. 유전자 발현에서 측정된 데이터는 non-parametric Mann-Whitney test를 실시하여 대조사료 공급구와 첨가제 공급구 사이의 유의적인 차이를 확인하였다. 통계분석은 P<0.
Real-time PCR로 측정된 Ct값은 HSC70 유전자의 Ct값을 사용 하여 normalize하였으며, 2-ΔΔCt (Kenneth et al., 2001) 분석법을 사용하여 대조사료와 첨가제 함유 사료와의 발현차이를 fold change로 나타내었다.
지방산 분석은 Folch et al. (1957)의 방법에 따라 클로로포름과 메탄올 혼합액 (2:1)으로 총 지질을 추출하여 14% BF3-MeOH (Sigma, St Louis, MO, USA) 용액으로 지방산을 methylation 시킨 후, capillary column (SPTM-2560, 100 m × 0.25 mm i.d., film thickness 0.20 μm, Supelco, Bellefonte, PA, USA) 이 장착된 gas chromatograph (HP-6890N, Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA)로 지방산을 분석하였다.
혈액의 성상 변화를 조사하기 위해 각 실험구당 넙치를 5마리씩 무작위로 추출하여 헤파린이 처리된 3 ml 주사기로 실험어의 미부 혈관에서 채혈하였으며, 원심분리 (3,500 rpm, 10분)하여 얻은 혈장을 동결보존 (-70℃)하였다. 혈장내 total protein은 biuret법으로, glucose는 효소법으로, glutamic oxaloacetic transaminase (GOT)는 kinetic UV법으로, total cholesterol은 COD-POD법을 사용하여 각각 분석하였다.
성능/효과
Triglyceride 함량은 Ke, Ga, On, Gi, MU, Li 및 Mix 공급구가 Con 공급구보다 유의하게 낮았으며 (P<0.05), glucose, GOT 및 cholesterol 함량은 사료 첨가제에 영향을 받지 않았다 (P<0.05).
일부 실험군의 개체에서 아가미 상피세포의 미약한 증상이 관찰되었으나 특정 첨가제 투여군에서만 관찰되지는 않았으며, 유사한 소견이 대조군에서도 관찰되었다. 또한, 대부분의 실험군에서 일부 개체의 간세포에서 미약한 괴사가 관찰되었으나, 이는 사료 첨가제의 종류와 관계없이 채집한 모든 실험군의 일부 개체에서 관찰되었으며, 대조군의 일부 개체에서도 동일한 소견이 관찰되었다(Fig. 3). 사료첨가제를 장기간 양식어류에게 투여하였을 경우, 종류에 따라서 간장에 병리조직학적 변화를 유발하는 사실이 보고되어 있다.
, 1986)시 오히려 성장에 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타나 첨가 농도에 따른 상반된 연구결과가 보고된 바 있다. 또한, 일일사료섭취율이 차이를 보이지 않은 것으로 보아 본 연구에 사용된 첨가제의 농도가 넙치 치어의 기호성 향상에도 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 그리고 사료 첨가제의 효능은 대상종과 사료조성에 따라 다르게 영향을 미칠 수 있기 때문이다 (Lindsay et al.
이러한 병리조직학적 변화는 첨가량의 조절에 따라 회복이 가능한 가역적 변화로 알려져 있다. 본 연구의 일부 개체에서 관찰된 간 실질세포의 미약한 괴사는 대조군에서도 관찰된 것으로 보아 특정 사료첨가제의 과다 투여에 의한 것은 아닌 것으로 판단된다.
사료 첨가제 투여군 별로 각 장기의 조직표본을 광학현미경으로 관찰한 결과, 첨가제 투여에 따른 특징적인 조직의 이상은 관찰되지 않았다. 일부 실험군의 개체에서 아가미 상피세포의 미약한 증상이 관찰되었으나 특정 첨가제 투여군에서만 관찰되지는 않았으며, 유사한 소견이 대조군에서도 관찰되었다.
생존율, 증중율, 일간성장율, 비만도, 간 중량지수 및 장 중량지수는 모든 실험구간에 유의한 차이가 없었다 (P>0.05).
이상의 결과들로 보아, 본 연구에 사용된 첨가제들은 넙치치어의 성장, 사료 이용성, 성장 유전자 발현 및 조직 성상에는 영향을 미치지 않았으나, 켈프 5%, 양파 3%, 그리고 마늘, 생강, 약쑥 및 혼합물의 1% 첨가는 혈장내 중성지질 함량을 감소시키는데 유용하게 사용될 것으로 판단되며, 이러한 결과는 넙치치어 배합사료의 품질개선을 위한 사료 조성시 유익한 정보로 이용될 수 있을 것이다.
첨가제를 함유한 사료를 공급한 5주 후에는 실험구간에 유의한 차이를 보이지 않았으나 (P>0.05), 15주 후, Kr, Ci, Li 및 Mix 공급구에서 Con 공급구보다 myosin 유전자의 발현이 유의적으로 감소하였다(P<0.05).
후속연구
현재 성장과 사료 이용성에 중점을 두고 수행되어 오던 연구들이 어류의 면역 저항성과 육질의 품질 개선을 함께 고려하는 방향으로 전환되고 있으며, 이는 배합사료의 품질 개선을 위한 또 하나의 과제를 제시하고 있다. 이처럼 대상종의 성장이나 사료효율 뿐 아니라 면역생리 효능을 향상시킬 수 있는 배합사료의 조성비를 지속적으로 개선하고 값비싼 영양소의 첨가수준을 최소화하는 등 배합사료의 품질 개선을 위한 연구는 지속되어야 한다.
이처럼 본 연구에 사용된 첨가제들은 유용한 생리활성 물질을 함유하고 있기는 하지만, 첨가 농도, 대상종 및 사료 조성에 따라 효능이 다르게 작용할 수 있기 때문에 첨가제 사용시 이에 대한 고려가 수반되어야 할 것이다.
이것은 첨가제들이 함유하고 있는 특정 생리활성물질이 지질합성에 관여하는 효소의 활성을 억제 또는 감소시켰기 때문으로 생각된다. 하지만, 아직까지 정상범위에 해당하는 혈액성상의 값들이 어종별로 확립되어 있지 않기 때문에 사용된 첨가제의 효능을 혈액학적으로 정확히 파악하기는 어려울 뿐 아니라, 어류의 혈중 성분이 환경조건이나 건강상태에 따라 달라질 수 있으므로 혈액의 화학성분을 분석하기 위해서는 이에 대한 고려가 필요할 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
우리나라의 해수어류 양식 생산량은 어떠한 추세를 보이는가?
우리나라의 해수어류 양식 생산량은 꾸준히 증가되고 있는 실정이다. 특히 넙치는 1970년대 이후로 종묘생산과 양식 기술이 확립되면서 양식 생산량이 현저히 증가되었으며, 현재 경제적 가치와 소비자의 선호도가 가장 높은 어종으로 인식되고 있다.
배합사료의 품질 개선에 도움이 되는 요소들은 무엇이 있는가?
어류의 성장을 증진시키거나 육질 개선을 위한 연구의 일환으로 효능이 있는 것으로 알려진 물질이나 원료를 배합사료에 첨가하여 대상 어류의 성장, 사료효율, 면역능력 및 체조성 등에 대한 개선 가능성을 조사하는 것은 배합사료 품질향상에 도움이 될 수 있다. 최근 각종 사료 첨가제를 사용하여성장, 사료효율 및 항병력을 향상시키려는 노력은 어류 양식 분야에서도 활발하게 시도되고 있으며, 다양한 식물, 광물, 미생물 또는 이들의 추출물을 각종 어류에게 투여하여 사료첨가제로서의 효과를 알아보려는 연구가 진행되고 있다(Fernández-Navarro et al.
넙치의 인식은 어떠한가?
우리나라의 해수어류 양식 생산량은 꾸준히 증가되고 있는 실정이다. 특히 넙치는 1970년대 이후로 종묘생산과 양식 기술이 확립되면서 양식 생산량이 현저히 증가되었으며, 현재 경제적 가치와 소비자의 선호도가 가장 높은 어종으로 인식되고 있다. 지금까지 넙치의 효율적이고 안정적인 양식 경영을 위해 기호성과 영양 요구량을 만족시킬 수 있는 배합 사료 조성비에 관한 연구가 중점적으로 수행되어 왔으며 (Lee et al.
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