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문제 정의
- 따라서, 본 연구는 TNF-α로 산화적 스트레스를 유발시킨 human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)에 녹차씨껍질 EtOAC 추출물을 처리하여 세포부착분자와 염증매개인자에 미치는 영향을 분석하여 녹차씨껍질의 동맥경화 예방 성분으로서의 가능성을 알아보고자 하였다.
- 본 연구는 TNF-α로 자극된 HUVEC에서 녹차씨껍질 EtOAC 추출물이 초기 동맥경화 과정에 중요한 역할을 하는 염증매개인자와 세포부착물질에 미치는 영향을 분석하였다.
제안 방법
- TNF-α로 자극한 HUVECs에서 녹차씨껍질 EtOAC 추출물이 cell adhesion molucule(CAM)의 생성에 미치는 효과를 동맥경화의 제1초기 현상을 나타내는 VCAM-1과 MCP1의 수준으로 확인하였다.
- 녹차씨껍질 분말의 10배의 주정을 가해 80±5ºC에서 4시간 동안 추출하여 감압여과한 후 evaporator를 사용하여 건고시켜 에탄올(EtOH) 추출물을 조제하였다.
- 본 연구에서 사용한 에틸아세테이트(EtOAC) 추출물은 다음과 같이 추출하였다. 녹차씨껍질 분획추출물 조제는 EtOH 추출물 10 g을 증류수 500 mL을 가해 용해시킨 후 석유에테르 500 mL을 가하여 혼합한 후 PE층인 위층을 회수하였으며 같은 방법으로 2회 반복 추출하였다. 남은 물층에 에틸아세테이트(EtOAC) 500 mL을 가하여 혼합한 후 EtOAC층인 위층을 회수하였으며 같은 방법으로 2회 반복 추출하였다.
- 녹차씨껍질(green tea seed coat, GTSC)은 녹차씨를 둘러싸고 있는 가장 바깥부분으로 깨끗하게 세척한 후 50±5ºC에서 3일간 열풍 건조하여 40 mesh로 분쇄하였다.
- 면역세포의 대표적인 염증인자인 PGE2 생성 저해 효과는 PGE2 assay kit(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 ELISA 분석을 하였다.
- 세포부착물질인 VCAM-1과 MCP-1 생성 저해 효과는 VCAM-1과 MCP-1 assay kit(R&D Systems, Inc.)을 사용하여 ELISA 분석을 하였다.
- 염증인자로 염증성 cytokine인 TNF-α 생성 억제 효과는 TNF-α assay kit(R&D Systems, Inc.)을 사용하여 ELISA 분석을 하였다.
- 침전물에 새로운 배지를 넣어서 cell count하여 세포를, 24-well plate(1×106 cells/well)에 주입하여 24시간 동안 CO2 incubator에서 배양한 후, 농도별로 조제한 녹차씨껍질 EtOAC 추출물(0～100 μg/mL)을 처리하여 2시간 배양한 후 산화적 손상을 유발하기 위해 TNF-α(10 ng/mL)를 첨가하고 20시간 배양하여 실험에 이용하였다.
대상 데이터
- (MC 1133, Seoul, Korea)에서 구입하여 passage 3～7번까지 사용하였으며, EMB-2 Bullet kit를 이용하여 37ºC, 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
- 남은 물층에 부탄올(BuOH) 500 mL을 가하여 혼합한 후 BuOH층인 위층을 회수하였으며 같은 방법으로 2회 반복 추출하였으며 남은 하층은 물층으로 하였다. EtOH 추출물 10 g 당 PE 분획층 2.499 g, EtOAC 분획층 3.365 g, BuOH 분획층 2.355 g, H2O 분획층 0.668 g으로 EtOAC 추출물의 회수율이 가장 높은 수준인 녹차씨껍질 EtOAC 추출물을 시료로 사용하였다. 본 연구에서 사용한 녹차씨껍질 EtOAC 추출물의 catechin류, caffeic acid, tannic acid의 함량을 HPLC를 사용하여 분석한 결과 EGC(1146.
- 본 연구에서 사용한 녹차씨껍질은 2009년 경남 화동소재 일송제다에서 구입하여 사용하였다. 녹차씨껍질(green tea seed coat, GTSC)은 녹차씨를 둘러싸고 있는 가장 바깥부분으로 깨끗하게 세척한 후 50±5ºC에서 3일간 열풍 건조하여 40 mesh로 분쇄하였다.
- 64%이었다. 본 연구에서 사용한 에틸아세테이트(EtOAC) 추출물은 다음과 같이 추출하였다. 녹차씨껍질 분획추출물 조제는 EtOH 추출물 10 g을 증류수 500 mL을 가해 용해시킨 후 석유에테르 500 mL을 가하여 혼합한 후 PE층인 위층을 회수하였으며 같은 방법으로 2회 반복 추출하였다.
데이터처리
- 통계분석은 SPSS software(Version 15.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 분석하였으며 모든 결과는 mean±SE로 표시하였고 각 군 간의 유의성은 one-way ANOVA와 Duncan's multiple range test로 p<0.05 수준에서 검정하였다.
이론/모형
- Nitric oxide(NO) 생성 정도는 Green 등의 방법(20)으로 NO 생성의 지표인 배지에 생성된 nitrite 양을 측정하여 결정하였다. 100 μL의 배지 상등액에 50 μL의 1% sulphanilamide(in 5% phosphoric acid)와 50 μL의 0.
- 세포 생존율은 MTT 방법(19)으로 분석하였다. 24 well의 배지를 제거하고, 1 mg/mL 농도가 되도록 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)를 첨가한 후, 4시간 동안 배양하였다.
- 총 항산화능은 Erel(21)의 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazaline-6-sulfonic acid)(ABTS) radical cation decolorization assay로 분석하여 mM trolox equivalent antioxidant capacity(TEAC)로 표시하였다.
성능/효과
- 100μg/mL 농도에서는 녹차씨껍질 EtOAC 추출물은 세포독성을 보이지 않았으며 염증매개인자인 TNF-α 수준 및 세포부착물질인 VCAM-1과 MCP-1의 생성을 억제하였다.
- Fig. 2에서 보듯이 TNF-α로 산화적 스트레스를 유발시킨 HUVEC에서의 NO의 생성능은 녹차씨껍질 EtOAC 추출물을 처리한 군에서 control군에 비해 유의적으로(p<0.05) 증가하여 untreated의 수준과 유사하였으며, HUVEC에서 녹차씨껍질 EtOAC 추출물은 NO를 소량 증가시키는 것을 알 수 있었으나 농도의존적인 효과를 나타내진 않았다.
- 또한 녹차씨껍질 EtOAC 추출물을 50 μg/mL 이상의 농도로 처리하였을 때 untreated군과 유사한 수준을 보였다. MCP-1의 농도는 Fig. 6에서와 같이 control군에 비해 녹차씨껍질 EtOAC 추출물을 처리하였을 때 농도 의존적으로 MCP-1의 수준을 현저하게 감소시키는 것으로 나타났다.
- TNF-α만 처리한 control군에 비해 녹차씨껍질 EtOAC 추출물을 처리한 군에서 TNF-α 수준이 현저하게 감소하여 녹차씨껍질 EtOAC 추출물이 염증성 cytokine인 TNF-α의 생성을 저해하는 것으로 나타났다.
- TNF-α로 자극한 HUVECs에서 녹차씨껍질 EtOAC 추출물이 cell adhesion molucule(CAM)의 생성에 미치는 효과를 동맥경화의 제1초기 현상을 나타내는 VCAM-1과 MCP1의 수준으로 확인하였다. VCAM-1의 농도는 Fig. 5에서 보는 바와 같이 control군에서 가장 높은 수준을 보였으며 녹차씨껍질 EtOAC 추출물을 처리하였을 때 농도 의존적으로 VCAM-1의 수준을 감소시키는 것으로 나타났다. 또한 녹차씨껍질 EtOAC 추출물을 50 μg/mL 이상의 농도로 처리하였을 때 untreated군과 유사한 수준을 보였다.
- 녹차씨껍질 EtOAC 추출물을 처리한 군에서는 control군에 비해 유의적으로(p<0.05) 높은 수준으로 나타나 녹차씨껍질 EtOAC 추출물은 총 항산화능을 증가시켜 활성산소를 소거하는 기능을 가지는 것으로 보인다.
- 녹차씨껍질 EtOAC 추출물의 NO 생성능은 TNF-α만을 처리한 control군에 비해 증가시키는 것을 알 수 있었다.
- 녹차씨껍질 EtOAC 추출물의 세포독성을 세포 생존율로 확인한 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같으며 본 연구에서 처리한 농도 수준 0～100 μg/mL에서 세포 생존율은 TNF-α 대조군과 차이를 보이지 않았으며 따라서 녹차씨껍질 EtOAC층은 세포 독성을 가지지 않는 것으로 나타났다.
- 녹차씨껍질 EtOAC 추출물이 HUVEC에서 TNF-α의 생성에 미치는 효과는 Fig. 4와 같으며 control군의 TNF-α 수준은 untreated군에 비해 유의적으로(p<0.05) 증가하였다.
- 따라서 녹차씨껍질 EtOAC 추출물에 의해 총 항산화능의 수준이 증가하는 것은 항산화 기능이 향상됨을 보여주는 것이며, TNF-α에 의한 산화적 스트레스를 저하하는 효과가 있는 것을 보여준다 하겠다.
- 따라서 녹차씨껍질 EtOAC 추출물은 동맥경화 유발에 중요한 인자인 TNF-α 생성을 억제시켜 TNF-α로 산화적 스트레스를 유발한 HUVEC에서 동맥경화를 저해하는 것으로 보인다.
- 따라서 녹차씨껍질 EtOAC 추출물의 처리는 TNF-α로 산화적 스트레스를 유발시킨 HUVEC에서 농도 의존적으로 세포부착물질인 VCAM-1과 MCP-1의 생성을 억제하는 것으로 보아 녹차씨껍질 EtOAC 추출물이 동맥경화를 유발시키는 인자인 CAMs의 생성을 효과적으로 감소시켜 동맥경화 초기 반응을 억제할 수 있을 것으로 사료된다.
- 따라서 녹차씨껍질 EtOAC 추출물이 HUVEC에서 TNFα로 인한 산화적 스트레스 유발 시 NO 생성을 증가시켜 혈관확장과 혈소판 응집을 억제하여 혈류의 흐름을 원활하게 하여 순환기 질환으로부터 인체를 보호해 줄 것으로 보인다.
- 따라서 본 연구의 결과 TNF-α로 유도된 HUVEC에서 녹차씨껍질 EtOAC 추출물의 처리는 control군에 비해 PGE2의 수준을 다소 낮추어 주는 경향을 보였으나 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
- 또한 녹차씨껍질 EtOAC 추출물을 50 μg/mL 이상의 농도로 처리하였을 때 untreated군과 유사한 수준을 보였다.
- 본 연구에서 사용한 녹차씨껍질 EtOAC 추출물의 catechin류, caffeic acid, tannic acid의 함량을 HPLC를 사용하여 분석한 결과 EGC(1146.5±11.01μg/g), tannic acid(967.0±32.24 μg/g), EC(70.9±4.39 μg/g), gallic acid(47.6±1.03 μg/g), caffeic acid(37.7±1.46 μg/g), ECG(35.5±3.19 μg/g), EGCG(15.5±0.09 μg/g)가 함유되어 있었다.
- 100μg/mL 농도에서는 녹차씨껍질 EtOAC 추출물은 세포독성을 보이지 않았으며 염증매개인자인 TNF-α 수준 및 세포부착물질인 VCAM-1과 MCP-1의 생성을 억제하였다. 뿐만 아니라, 녹차씨껍질 EtOAC 추출물은 총 항산화능은 증가되는 경향을 보였다. 이상의 결과에서, 녹차씨껍질 EtOAC 추출물은 HUVEC에서 TNF-α로 인한 총 항산화능의 수준을 향상시켜 염증생성인자인 TNF-α 수준 및 세포부착물질인 VCAM-1과 MCP-1의 생성을 억제하여 동맥경화 초기반응을 억제하는데 기여할 것으로 사료된다.
후속연구
- 뿐만 아니라, 녹차씨껍질 EtOAC 추출물은 총 항산화능은 증가되는 경향을 보였다. 이상의 결과에서, 녹차씨껍질 EtOAC 추출물은 HUVEC에서 TNF-α로 인한 총 항산화능의 수준을 향상시켜 염증생성인자인 TNF-α 수준 및 세포부착물질인 VCAM-1과 MCP-1의 생성을 억제하여 동맥경화 초기반응을 억제하는데 기여할 것으로 사료된다.
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