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문제 정의
- 본 연구에서는 우수한 AChE 저해활성을 가지는 화합물의 발굴에 활용하고자 scopoletin을 리드화합물로 하여 coumarin 유도체들의 구조-활성관계에 대한 자료를 확보하고자 하였다. 먼저, 효소 결합부위에서 H-bond donor로 작용할 수 있는 hydroxy가 AChE의 저해활성에 미치는 영향을 파악하고자 coumarin 구조에 hydroxy를 갖는 화합물과 hydroxy를 methylation시킨 화합물을 각각 합성하고 이들의 AChE 저해활성을 비교하였다.
- 본 연구에서는 coumarin 유도체의 구조 변화가 AChE 저해활성에 어떠한 영향을 미치는 지를 조사하기 위해서 총 10종의 coumarin 유도체의 AChE 저해활성을 측정하고 구조-활성 관계를 도출하였다. 그 결과, coumarin 구조의 7번 위치(R2)의 hydroxy는 효소 저해활성을 갖기 위해서 필수적이며 6번 위치 (R1)의 hydroxy는 효소 저해활성에 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었다.
제안 방법
- 6,7-Dihydroxychroman-2-one (2i) − Acetic acid(2 ml)에 esculetin(2c, 50 mg, 0.28 mmol)을 녹인 후, 10% Pd/C(15 mg)를 적가하고, 화합물 2h의 제조방법과 유사한 방법으로 정제하여 목적화합물 2i(7 mg, 14%)를 얻었다.
- 본 연구에서는 우수한 AChE 저해활성을 가지는 화합물의 발굴에 활용하고자 scopoletin을 리드화합물로 하여 coumarin 유도체들의 구조-활성관계에 대한 자료를 확보하고자 하였다. 먼저, 효소 결합부위에서 H-bond donor로 작용할 수 있는 hydroxy가 AChE의 저해활성에 미치는 영향을 파악하고자 coumarin 구조에 hydroxy를 갖는 화합물과 hydroxy를 methylation시킨 화합물을 각각 합성하고 이들의 AChE 저해활성을 비교하였다. 또한, galantamine-효소 결합의 hydrophobic 부분과 유사하게 작용할 것이라 생각되는 3번~4번 탄소 이중결합의 중요성을 알아보기 위해 이중결합이 단일결합으로 바뀐 coumarin 화합물들을 합성한 후 AChE 저해활성을 비교하였다.
- 먼저, 효소 결합부위에서 H-bond donor로 작용할 수 있는 hydroxy가 AChE의 저해활성에 미치는 영향을 파악하고자 coumarin 구조에 hydroxy를 갖는 화합물과 hydroxy를 methylation시킨 화합물을 각각 합성하고 이들의 AChE 저해활성을 비교하였다. 또한, galantamine-효소 결합의 hydrophobic 부분과 유사하게 작용할 것이라 생각되는 3번~4번 탄소 이중결합의 중요성을 알아보기 위해 이중결합이 단일결합으로 바뀐 coumarin 화합물들을 합성한 후 AChE 저해활성을 비교하였다. 위 과정을 통해 도출된 coumarin 유도체의 구조와 이들의 활성과의 상관관계는 향후 AD 치료제 후보물질로서의 새로운 coumarin 화합물의 연구 및 발굴 과정에 활용될 것으로 보인다.
- 의해 발표된 방법에14) 기초한 colorimetric assay에 의하여 측정하였다. 효소의 추출을 위해서 수컷 ICR mice(25~30 g)의 뇌를 적출하여 질량을 측정하고, 질량의 20 mg/ml가 되는 양의 phosphate buffer(pH 8.0, 0.1 M)를 넣은 후 Teflon homogenizer(Eyela, Japan)을 이용하여 균질화시킨다. 이어 4℃에서 20분간 14,000 rpm으로 원심분리 과정을 진행한 후, 상층액을 효소 자원으로 사용한다.
- , Korea)를 이용하여 410 nm 파장에서의 흡광도를 측정한다. 측정된 흡광도를 통해 약물이 포함된 용액과 약물이 포함되지 않은 blank 군을 비교하여 각 약물 용액의 농도마다 저해력(%)을 계산하였고, 이 값은 Graphpad Prism 5.00을 이용하여 IC50을 구하는데 사용하였다.
대상 데이터
- NMR spectra는 Bruker Avance 400 spectrometers(400 MHz)를 사용하여 얻었으며, chemical shift는 tetramethylsilane(TMS)을 내부 표준물질로 사용하고 δ 값으로 표시하였다. 분석용 thin layer chromatography(TLC)는 Machery-Nagel polygram SIL/UV plates(두께 0.20 mm)를 도포한 것을 사용하였으며, 유기화합물의 확인을 위해 254 nm와 365 nm의 자외선 또는 phosphomolybdic acid(PMA) 5% ethanol 용액을 발색제로 사용하였다. 화합물의 정제를 위한 flash column chromatography는 Kiesegel 60(230~400 mesh, Merck)를 사용하였다.
- 화합물의 정제를 위한 flash column chromatography는 Kiesegel 60(230~400 mesh, Merck)를 사용하였다. 실험에 사용한 대부분의 용매와 시약 및 scopoletin(2a), umbelliferone(2b), esculetin(2c), daphnetin(2d), coumarin(2e)은 Aldrich사 등에서 구입하여 사용하였으며, 정제가 필요한 용매는 기존의 알려진 방법대로 정제하여 사용하였다.
- 이어 4℃에서 20분간 14,000 rpm으로 원심분리 과정을 진행한 후, 상층액을 효소 자원으로 사용한다. Coumarin 유도체는 증류수 또는 소량의 DMSO로 녹인 후, 희석하여 각 화합물마다 다양한 농도의 약물 용액을 준비하였다. 저해활성 측정반응은 tube 마다 0.
- 연구에 포함된 화합물 중 구입 가능한 화합물을 제외한 화합물 2f~2j는 합성하여 사용하였다. 목적 화합물 2f와 2g는 Scheme 1에 따라 methylation 반응을 진행하여 합성하였다.
이론/모형
- et al.의해 발표된 방법에14) 기초한 colorimetric assay에 의하여 측정하였다. 효소의 추출을 위해서 수컷 ICR mice(25~30 g)의 뇌를 적출하여 질량을 측정하고, 질량의 20 mg/ml가 되는 양의 phosphate buffer(pH 8.
성능/효과
- 5) 이에 현재까지 콜린성 치료제들이 많이 개발되었으며, 이들은 초기·중기 AD 환자의 증상을 완화하는 것으로 알려져 있다.6) 콜린성 치료제들은 비록 단기적인 증상완화에 도움을 줄 뿐 질병의 진행을 조절하지는 못하는 것으로 여겨지고 있지만 현 상황에서 콜린성 치료제들은 AD 치료에 여전히 중요한 역할을 담당하고 있다.
- 07 µM)보다는 저해활성이 우수하지는 않지만, ex vivo 실험에서는 galantamine과 유사한 수준으로 ACh의 농도를 증가시키는 것이 확인되었다.13)따라서 scopoletin보다 AChE 저해활성이 우수한 coumarin 화합물들은 in vivo에서 ACh 농도의 감소를 더욱 효과적으로 늦출 수 있을 것으로 보인다.
- 3번~4번 탄소위치에 단일결합을 갖는 목적 화합물 2h~2j는 Scheme 2에 따라 수소화 반응을 통해 환원시켜 얻을 수 있었다.16) 화합물 2h, 2i와 2j는 각각 화합물 2a(scopoletin), 2c(esculetin) 및 2g를 acetic acid를 용매로 사용하고 Pd/C(10%) 촉매와 수소 기체 하에서 수소화 반응을 진행하여 각각 21%, 14% 및 43%의 수율로 합성할 수 있었다.
- 화합물들의 AChE 저해활성을 비교한 결과, coumarin 구조의 7번 위치(R2)의 hydroxy와 3번~4번 위치의 탄소 이중결합이 AChE 저해활성에 중요한 역할을 하고 있다고 판단되었다. Hydroxy가 methylation 되거나 혹은 없는 화합물 2e, 2f 및 2g는 1,000 µg/ml 이하의 농도에서 AChE 저해활성을 나타내지 않은 것에 비해 hydroxy가 하나 이상 존재하는 화합물 2a~2d는 IC50이 19~98 µg/ml의 범위에서 AChE 저해활성을 나타냈다.
- 화합물 2a~2g 및 2b~2f의 경우에는 7번 위치(R2)에 hydroxy를 갖는 화합물 2a(IC50=19.46 µg/ml) 및 2b(IC50=98.42 µg/ml)가 AChE 저해 활성을 나타내는 것에 비해, 동일한 구조에 7번 위치(R2)의 hydroxy가 methylation된 화합물 2f 및 2g는 1000 µg/ml 이하의 농도에서 저해활성을 나타내지 않기 때문에 7번 위치(R2)의 hydroxy는 AChE 저해활성을 위해 필수적인 부분으로 판단되었다.
- 전체 화합물 중에서는 AChE 저해활성에 중요한 부위를 모두 갖는 화합물 2a(scopoletin, IC50=19.46 µg/ml)가 가장 우수한 저해활성을 나타내었다.
- 00 µg/ml)보다 저해활성이 우수하였다. 따라서 6번 위치(R1)의 hydroxy는 비극성인 알킬기를 도입하면 AChE 저해활성이 증가할 것으로 보이며, 앞으로 새로운 화합물의 설계 시 변화를 줄 수 있는 부분이라고 판단된다.
- 본 연구에서는 coumarin 유도체의 구조 변화가 AChE 저해활성에 어떠한 영향을 미치는 지를 조사하기 위해서 총 10종의 coumarin 유도체의 AChE 저해활성을 측정하고 구조-활성 관계를 도출하였다. 그 결과, coumarin 구조의 7번 위치(R2)의 hydroxy는 효소 저해활성을 갖기 위해서 필수적이며 6번 위치 (R1)의 hydroxy는 효소 저해활성에 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었다. 그리고 coumarin 구조의 3번~4번 탄소 이중결합은 단일결합으로 바뀔 시 효소 저해활성을 잃는 것을 관찰할 수 있었다.
- 그 결과, coumarin 구조의 7번 위치(R2)의 hydroxy는 효소 저해활성을 갖기 위해서 필수적이며 6번 위치 (R1)의 hydroxy는 효소 저해활성에 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었다. 그리고 coumarin 구조의 3번~4번 탄소 이중결합은 단일결합으로 바뀔 시 효소 저해활성을 잃는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 새로운 coumarin 화합물의 설계 시 7번 위치(R2)의 hydroxy와 3번-4번 탄소 이중결합은 반드시 유지되어야 하며, 6번 위치(R1)의 hydroxy는 변화가 가능한 부분이라고 생각된다.
- 13) 나아가 실제 in vitro 상에서 scopoletin(IC50=169.5 µM)은 비록 galantamine(IC50=1.07 µM)보다는 저해활성이 우수하지는 않지만, ex vivo 실험에서는 galantamine과 유사한 수준으로 ACh의 농도를 증가시키는 것이 확인되었다.
후속연구
- 또한, galantamine-효소 결합의 hydrophobic 부분과 유사하게 작용할 것이라 생각되는 3번~4번 탄소 이중결합의 중요성을 알아보기 위해 이중결합이 단일결합으로 바뀐 coumarin 화합물들을 합성한 후 AChE 저해활성을 비교하였다. 위 과정을 통해 도출된 coumarin 유도체의 구조와 이들의 활성과의 상관관계는 향후 AD 치료제 후보물질로서의 새로운 coumarin 화합물의 연구 및 발굴 과정에 활용될 것으로 보인다.
- 따라서 새로운 coumarin 화합물의 설계 시 7번 위치(R2)의 hydroxy와 3번-4번 탄소 이중결합은 반드시 유지되어야 하며, 6번 위치(R1)의 hydroxy는 변화가 가능한 부분이라고 생각된다. 이와 같은 연구결과는 앞으로 더 우수한 AChE 저해활성을 갖는 coumarin 화합물의 발굴을 위한 연구에 활용될 수 있을 것이다.
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