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문제 정의
- 본 연구는 RBL-2H3 세포를 이용한 제 1형 알러지 반응에 초점을 맞추어 in vitro 항알러지 활성을 조사하였다. 초기반응을 유도하는 탈과립으로 인한 β-hexosaminidase 분비와 후기반응을 유도하는 사이토카인의 생산과 mRNA 발현에 미치는 유근피 추출물의 억제효과를 살펴보았다.
- 유근피를 이용한 알러지 질환에 관한 연구는 아나필락시스, 비염, 천식 등이 발표되었다8-10). 본 연구에서는 RBL-2H3 비만세포를 이용하여 제 1형 알러지 반응에서 초기반응과 후기반응의 억제 효과를 조사하였다.
제안 방법
- Microplate reader(Molecular Devices Co. Ltd., USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 누출된 IL-4와 TNF-α의 양을 계산하였다.
- RT-PCR kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 45℃에서 30 분, 94℃에서 5 분간 반응시킨 후 94℃에서 30 초간 denaturation시키고, 55℃에서 30 초간 annealing시킨 다음, 72℃에서 1 분간 extension시키는 cycle을 32 회 반복한 뒤, 마지막 extension은 72℃에서 5 분간 PCR machine(GeneAmp, PCR system 9700, USA)에서 수행하였다. 각 PCR products는 2% agarose gel에 loading하여 100 V 조건에서 30 분간 전기영동을 통하여 분석하였다.
- RBL-2H3 cells를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 48 well plate (Corning, USA)에 5 × 104 cells/ml의 세포수가 되도록 분주하여 37℃ 5% CO2 incubator에서 24 시간 배양하였다. UD를 농도별 (0, 0.5, 1, 2 및 4 mg/ml)로 처리한 후 1 시간 동안 반응시켰다. 배양액을 제거 한 후 5 mg/ml의 MTT를 각 well에 넣고 잘 섞어 준 후 4 시간 37℃ incubator에서 배양한 후 tetrazolium bromide salt를 제거하고 DMSO를 150 μl씩 분주하여 well에 생성된 formazin이 잘 녹을 수 있게 충분히 흔들어 모두 녹인 후 microplate reader (Molecular Devices, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 평균값과 표준 편차를 구하였다.
- RT-PCR kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 45℃에서 30 분, 94℃에서 5 분간 반응시킨 후 94℃에서 30 초간 denaturation시키고, 55℃에서 30 초간 annealing시킨 다음, 72℃에서 1 분간 extension시키는 cycle을 32 회 반복한 뒤, 마지막 extension은 72℃에서 5 분간 PCR machine(GeneAmp, PCR system 9700, USA)에서 수행하였다. 각 PCR products는 2% agarose gel에 loading하여 100 V 조건에서 30 분간 전기영동을 통하여 분석하였다. 각각의 primer의 염기서열은 다음과 같다(Table 1).
- 그 후 UD (0, 0.5, 1, 2 및 4 mg/ml)를 처리하여 1 시간 동안 37℃ 5% CO2 incubator에서 배양한 후 DNP-HSA (10 μg/ml)를 처리한 후 4 시간 동안 반응시키고 ice bath에서 10 분 동안 방치한 후 반응을 종결시켰다.
- 배양액을 제거 한 후 5 mg/ml의 MTT를 각 well에 넣고 잘 섞어 준 후 4 시간 37℃ incubator에서 배양한 후 tetrazolium bromide salt를 제거하고 DMSO를 150 μl씩 분주하여 well에 생성된 formazin이 잘 녹을 수 있게 충분히 흔들어 모두 녹인 후 microplate reader (Molecular Devices, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 평균값과 표준 편차를 구하였다.
- 본 실험에서 UD (0.5, 1, 2, and 4 mg/ml) 농도에 따른 RBL-2H3 비만세포에 대한 독성을 MTT법을 사용하여 조사하였다. 그 결과 UD는 모든 농도에서 세포독성은 관찰되지 않았고, 2, and 4 mg/ml의 농도에서 세포성장을 촉진시키는 것으로 나타났다(Fig.
- 알러지 초기반응의 지표인 탈과립에 대한 억제 효과를 살펴보기 위하여 β-hexosaminidase의 분비를 세가지 방법을 사용하여 측정하였다. 비면역학적 반응으로 UD 처리 후 PMA와 A23187로 자극하였으며, 면역반응으로 항원-항체 결합단계와 항체-수용체 결합단계에서 측정하기 위하여 UD를 IgE 감작단계와 항원자극단계에서 처리하였다.
- 5 μg/ml)로 감작하고 37℃ 5% CO2incubator에서 24시간 배양한다. 새로운 DMEM 배지로 교환한 후 UD를 농도별 (0, 1, 2 및 4 mg/ml)로 세포에 처리하였다. 1 시간 동안 배양한 후 PBS로 2 번 세척한 다음 DNP-HSA(10 μg/ml)로 자극한 후 1 시간 동안 배양하였다.
- 알러지 초기반응의 지표인 탈과립에 대한 억제 효과를 살펴보기 위하여 β-hexosaminidase의 분비를 세가지 방법을 사용하여 측정하였다.
- 초기반응을 유도하는 탈과립으로 인한 β-hexosaminidase 분비와 후기반응을 유도하는 사이토카인의 생산과 mRNA 발현에 미치는 유근피 추출물의 억제효과를 살펴보았다.
- 항원-항체 결합단계에서 β-hexosaminidase의 분비에 미치는 영향을 측정하기 위하여 RBL-2H3 cells를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 48 well plate (Corning, USA)에 5 × 105 cells/ml의 세포수가 되도록 분주하였다.
대상 데이터
- RBL-2H3 (rat basophilic leukemia cell line)은 한국세포주은행 (Korea Cell Line Bank, KCLB)에서 분양받아 배양하였다. 세포의 배양을 위하여 10% heat-inactivated FBS (Gibco BRL, USA)과 1% penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL, USA)을 포함한 DMEM (Gibco BRL, USA) 배양액에서 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 anti-dinitrophenyl (DNP) immunoglobulin E (IgE), DNP-HSA는 Sigma(USA)로부터, Dulbecco's modification Eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin, streptomycin 및 trypsin-EDTA solution은 Gibco BRL로부터, tetrazolium bromide salt (MTT) 및 dimethylsulfoxide(DMSO)는 Amresco로부터, Interleukin (IL)-4와 tumor necrosis factor alpha (TNF-α) kit는 BD Biosciences Pharmingen으로부터, RT-PCR kit(AccuPower RT/PCR PreMix)는 Bioneer로부터 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 유근피 (Ulmus davidiana : UD)는 갑당약초 (홍천, 강원도)에서 구입하여 사용하였다. UD 600 g을 증류수로 水洗하여 4 L의 증류수를 加하여 6 시간 동안 가열 추출하였다.
- RBL-2H3 (rat basophilic leukemia cell line)은 한국세포주은행 (Korea Cell Line Bank, KCLB)에서 분양받아 배양하였다. 세포의 배양을 위하여 10% heat-inactivated FBS (Gibco BRL, USA)과 1% penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL, USA)을 포함한 DMEM (Gibco BRL, USA) 배양액에서 배양하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였고, 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 0.
데이터처리
- 成績은 SPSS 17.0K for Windows 통계 프로그램 패키지를 사용하여 평균치 ± 표준편차로 나타내었고 유의수준은 P<0.05로 하였다.
- 05로 하였다. 각 실험군 간의 통계학적 분석은 one way-ANOVA와 Dunett test 검정을 실시하였다.
이론/모형
- IL-4 (A) and TNF-α (B) concentration was measured from cell supernatant using ELISA method.
- RBL-2H3 세포의 생존 및 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT법을 사용하였다11). RBL-2H3 cells를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 48 well plate (Corning, USA)에 5 × 104 cells/ml의 세포수가 되도록 분주하여 37℃ 5% CO2 incubator에서 24 시간 배양하였다.
성능/효과
- PMA+A23187자극에 의한 β-hexosaminidase 분비에 미치는 UD의 억제효과를 살펴본 결과 0.5 mg/ml 농도에서 61.82±3.81%, 1 mg/ml 농도에서 95.10±14.34%, 2 mg/ml 농도에서 105.60±3.84%, 4 mg/ml 농도에서 121.70±22.43%로 나타나 농도의존적으로 유의성있는 효과를 나타내었다(Fig. 2A).
- RBL-2H3 cells에서의 IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, GM-CSF, TNF-α와 COX-2 mRNA의 발현에 대해 조사한 결과, 아무런 처리를 하지 않은 세포에 비해 항원으로 자극한 세포에서 mRNA의 발현량이 현저하게 증가하였으며, UD (1, 2, and 4 mg/ml)를 처리한 세포에서 mRNA의 발현이 감소하는 것으로 나타났다.
- RBL-2H3 세포의 생존 및 증식에 미치는 영향을 알아본 결과 UD를 처리하지 않은 세포는 0.58±0.02의 흡광도를 나타내었고, UD를 농도별(0.5, 1, 2, and 4 mg/ml)로 처리한 세포에서 각각 0.57±0.02 (98%), 0.81±0.04 (140%), 1.18±0.03 (203%), 1.35±0.04 (233%)의 흡광도를 나타내어 농도 의존적으로 세포생존 및 증식이 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 1).
- 결론적으로 UD는 비만세포의 활성을 효과적으로 억제하여 제 1형 알러지의 초기반응과 후기반응을 조절하였다. 비면역학적 또는 면역학적 경로를 통한 비만세포 탈과립을 효과적으로 억제하여 초기 화학적 매개물질의 방출을 감소시켰고, 비만 세포 자체에서 생산된 IL-4와 TNF-α을 감소시켰다.
- 5, 1, 2, and 4 mg/ml) 농도에 따른 RBL-2H3 비만세포에 대한 독성을 MTT법을 사용하여 조사하였다. 그 결과 UD는 모든 농도에서 세포독성은 관찰되지 않았고, 2, and 4 mg/ml의 농도에서 세포성장을 촉진시키는 것으로 나타났다(Fig. 1).
- 또한 RBL-2H3 cells에서 분비된 TNF-α의 양은 아무런 처리를 하지 않은 세포에서 5.35±0.72 pg/ml이었으며, 항원으로 자극한 세포에서 21.58±2.38 pg/ml로 아무런 처리를 하지 않은 세포에 비해 유의한 (p<0.05) 증가를 나타내었다.
- 또한 UD가 Th2 반응을 지속시키는 사이토카인의 생성을 억제하는지 조사한 결과 IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, GM-CSF 및 TNF-α mRNA의 발현을 억제하였고, 특히 IL-5, IL-13과 GM-CSF mRNA의 발현은 UD (1, 2, and 4 mg/ml) 모든 농도에서 현저하게 감소시켰다(Fig. 4).
- 또한 UD는 IgE 매개 면역자극에서 항원-항체 결합과 항체-수용체 결합을 모두 제어함으로써 β-hexosaminidase의 분비를 억제하는 것으로 나타났다(Fig. 2B, 2C).
- 본 실험에서 UD가 IgE 매개 알러지 반응에서 cyclooxygenase 활성을 억제하는지 조사한 결과 COX2 mRNA의 발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 특히 2 mg/ml과 4 mg/ml의 농도에서 현저하게 억제하였다.
- 본 실험에서 UD는 IgE 매개 알러지 반응에서 IL-4와 TNF-α의 생산을 억제하는 것을 확인하였다(Fig. 3A, 3B).
- 본 실험에서 UD는 비면역학적 자극에 대해 β-hexosaminidase의 분비를 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다 (Fig. 2A).
- 결론적으로 UD는 비만세포의 활성을 효과적으로 억제하여 제 1형 알러지의 초기반응과 후기반응을 조절하였다. 비면역학적 또는 면역학적 경로를 통한 비만세포 탈과립을 효과적으로 억제하여 초기 화학적 매개물질의 방출을 감소시켰고, 비만 세포 자체에서 생산된 IL-4와 TNF-α을 감소시켰다. 또한 지방성분의 매개물질과 후기 Th2 사이토카인 mRNA의 발현을 감소시켰다.
- RBL-2H3 cells에서의 IL-3, IL-4, IL-5, IL-13, GM-CSF, TNF-α와 COX-2 mRNA의 발현에 대해 조사한 결과, 아무런 처리를 하지 않은 세포에 비해 항원으로 자극한 세포에서 mRNA의 발현량이 현저하게 증가하였으며, UD (1, 2, and 4 mg/ml)를 처리한 세포에서 mRNA의 발현이 감소하는 것으로 나타났다. 특히 IL-5, IL-13, GM-CSF와 COX2 mRNA의 발현은 UD (1, 2, and 4 mg/ml) 모든 농도에서 현저하게 감소시키는 것으로 나타났다(Fig. 4).
- 항원-항체 결합단계에서 β-hexosaminidase 분비에 미치는 UD의 억제효과를 살펴본 결과 0.5 mg/ml 농도에서 14.41±3.89%, 1 mg/ml 농도에서 22.46±9.′ # 墻, 2 mg/ml 농도에서 38.81±11.73%, 4 mg/ml 농도에서 44.48±4.00%로 나타나 농도의존적으로 유의성있는 효과를 나타내었다(Fig. 2B).
- 항체-수용체 결합단계에서 β-hexosaminidase 분비에 미치는 UD의 억제효과를 살펴본 결과 0.5 mg/ml 농도에서 28.79±8.61%, 1 mg/ml 농도에서 20.12±5.09%, 2 mg/ml 농도에서 47.52±9.05%, 4 mg/ml 농도에서 88.40±3.96%로 나타나 모든 농도에서 유의성있는 효과를 나타내었다(Fig. 2C).
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