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문제 정의
- 따라서 본 연구는 젖소의 생산성에 지대한 영향을 미치는 것으로 알려진 백혈병의 원인균인 BLV 감염에 대한 젖소목장별 실태를 파악하고, PCR기법과 ELISA기법간의 BLV 진단에 대한 정확도를 비교 검토하여 이들 기법에 대한 진단정보를 제공하는데 필요한 기초자료를 얻고자 하는데 있다.
- 본 연구는 젖소의 생산성에 지대한 영향을 미치는 것으로 알려진 소 백혈병의 원인균인 bovine leukemia virus (BLV)의 감염에 대한 목장의 실태를 파악하고, PCR기법과 ELISA기법 간의 BLV 감염진단에 대한 정확도를 비교하고자 수행하였다. 공시재료는 충청남북도 소재의 5개 젖소목장(U, S, T, C 및 D)의 홀스타인종 젖소 193두의 혈액으로 부터 BLV유전자 및 혈청을 분석하여 얻어진 결과는 다음과 같다.
제안 방법
- BLV 각 유전자들의 PCR 증폭은 50 ng genomic DNA에 1× buffer, 1.5 mM MgCl2 buffer, 0.2 mM dNTP, 각 gene 의 forward와 reverse oligonucleotide primer 각각 10 pmol, 1.5 units AmpliTaq Gold DNA polymerase(Applied Biosystems, USA)와 멸균수를 첨가하여 총 25 ㎕ 용량으로 반응하였다.
- 젖소의 BLV 감염여부를 확인하기위한 BLV provirus의 gag, pol 및 env gene의 PCR 증폭은 Sagata 등(1985)이 보고한 primer를 사용하였으며 DNA의 확인을 위해 internal control로 GAPDH를 사용하였다(Table 1).
- PCR 반응조건은 최초 denaturation으로 95℃에서 10분간 반응시킨 후, 95℃에서 1분, 61℃에서 30초, 72℃에서 30초를 34회 반복하였으며, 각 cycle마다 2초씩 증가하였고 마지막으로 55℃에서 2분, 72℃에서 4분간 반응한 후 4℃에서 종료하였다. 증폭된 각각의 PCR product들은 2% agarose gel에 전기 영동하여 증폭여부 및 크기를 확인하였다.
- 불활성화 된 BLV 항원(+Ag)과 대조항원(-Ag)이 교대로 코팅된 96 well plate에 10배 희석한 (pH 5.5∼6.0) 세척·희석액 (CHEKIT-washing & dilution solution, CWDs) 180 ㎕를 분주한 후 가검 혈청과 양성 및 음성대조혈청을 각각 well에 20 ㎕씩 첨가하여 10배 희석하였다.
- 발색을 위해 chromogen substrate를 200 ㎕씩 분주하고 실온에서 10∼30분간 정치한 후 spectrophotometer(Spectra Rainbow, Teacan, USA)로 405 nm 파장에서 optical density(OD) 값을 측정하여 양성대조혈청의 순흡광도(Net extinction, NE)가 0.4이상일 때 stop solution을 50 ㎕씩 분주하여 반응을 중지시킨 후 OD값을 측정하였다.
대상 데이터
- Genomic DNA 추출은 DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN, Germany)를 이용하였으며 추출된 DNA는 4℃에 보관하여 사용하였다.
- 본 연구에 이용된 공시동물은 충청남북도 소재 5개 목장(U, S, T, C, 및 D)의 1산 이상의 홀스타인종 젖소 총 193두를 이용하였다. 혈액채취는 젖소의 경정맥에서 3 ㎖의 혈액을 EDTA가 함유된 진공채혈관 (Vacumtainer tube with EDTA)에 채취하였다.
- 본 연구에 이용된 공시동물은 충청남북도 소재 5개 목장(U, S, T, C, 및 D)의 1산 이상의 홀스타인종 젖소 총 193두를 이용하였다. 혈액채취는 젖소의 경정맥에서 3 ㎖의 혈액을 EDTA가 함유된 진공채혈관 (Vacumtainer tube with EDTA)에 채취하였다. Genomic DNA 추출은 DNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN, Germany)를 이용하였으며 추출된 DNA는 4℃에 보관하여 사용하였다.
- 본 연구는 젖소의 생산성에 지대한 영향을 미치는 것으로 알려진 소 백혈병의 원인균인 bovine leukemia virus (BLV)의 감염에 대한 목장의 실태를 파악하고, PCR기법과 ELISA기법 간의 BLV 감염진단에 대한 정확도를 비교하고자 수행하였다. 공시재료는 충청남북도 소재의 5개 젖소목장(U, S, T, C 및 D)의 홀스타인종 젖소 193두의 혈액으로 부터 BLV유전자 및 혈청을 분석하여 얻어진 결과는 다음과 같다.
데이터처리
- PCR과 ELISA 기법간의 BLV 진단율의 일치의 정도를 알아보기 위해 Kappa통계량을 사용하였으며, 두 BLV 진단기법에 대한 일치의 정도인 Kappa치는 -1.0(완전불일치), 0.0(우연일치) 그리고 +1.0(완전일치)까지의 범주를 갖는다. 검사법사이의 kappa치는 0.
이론/모형
- ELISA 기법을 이용한 BLV 감염을 진단하기 위한 BLV 항체는 혈청 및 혈장용 CHEKIT-Leucotest kit(Dr. Bommeli AG., Switzerland)를 사용하여 측정하였다. 불활성화 된 BLV 항원(+Ag)과 대조항원(-Ag)이 교대로 코팅된 96 well plate에 10배 희석한 (pH 5.
- 홀스타인종 젖소 BLV 유전자의 증폭 및 감염유무를 확인하기 위하여 BLV gag, pol 및 env 유전자를 PCR 기법을 이용하여 증폭한 결과는 Fig. 1에 나타낸 바와 같다.
성능/효과
- Fig. 1에서 보는 바와 같이 BLV gag, pol 및 env 유전자의 증폭산물이 lane 1과 2에서 각각 226 bp, 596 bp 및 434 bp의 크기로 잘 증폭되었음을 확인할 수 있었다. 이는 Sagata 등(1985)이 보고한 BLV gag, pol 및 env 유전자의 증폭양상이 각각 226 bp, 596 bp 및 434 bp라고 보고한 결과와 잘 일치하였다.
- 한편, 젖소 목장별로 BLV 감염률을 비교하여 보면 S목장이 조사두수 36두 중 29두가 BLV에 감염되어 80.55%로 가장 낮은 감염 률을 보여 U목장의 100% 간에는 유의적인 차이(P<0.05)를보였으나 T, C 및 D목장의 BLV 감염률의 범위는 84.84∼91.30%로 이들 젖소목장 간에는 유의적인 차이가 인정되지 않았다.
- 한편, 젖소 목장별 BLV 양성률을 비교하여 보면 S목장은 조사두수 36두 중 8두가 BLV 양성으로 22.22%의 양성률을 보여 다른 목장들과는 유의적인 차이 (P<0.05)로 낮은 양성률을 보였다.
- 이는 Sagata 등(1985)이 보고한 BLV gag, pol 및 env 유전자의 증폭양상이 각각 226 bp, 596 bp 및 434 bp라고 보고한 결과와 잘 일치하였다. 또한, 이들 유전자의 증폭산물이 BLV 유전자와 일치되는 것인지를 확인하기 위해 BLV 각 유전자를 sequencing하여 NCBI에 보고된 BLV sequence 와 비교한 결과 BLV gag, pol 및 env 유전자의 sequence 와 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 젖소의 BLV 감염 여부의 진단은 PCR기법에 의한 이들 유전자의 증폭과 전기영동양상에 의거 BLV 유전자의 종류와 신속한 BLV 감염여부의 확인이 가능함을 알 수 있었다.
- 또한, 이들 유전자의 증폭산물이 BLV 유전자와 일치되는 것인지를 확인하기 위해 BLV 각 유전자를 sequencing하여 NCBI에 보고된 BLV sequence 와 비교한 결과 BLV gag, pol 및 env 유전자의 sequence 와 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 젖소의 BLV 감염 여부의 진단은 PCR기법에 의한 이들 유전자의 증폭과 전기영동양상에 의거 BLV 유전자의 종류와 신속한 BLV 감염여부의 확인이 가능함을 알 수 있었다.
- 5개 목장(U, S, T, C 및 D) 193두에 대한 PCR 기법에 의한 BLV 감염여부를 진단한 결과 168두의 젖소가 BLV에 감염된 것으로 확인되어 평균 87.05%의 매우 높은 감염률을 보였다. 한편, ELISA 기법에 의한 BLV 감염여부의 진단결과는 5개 목장 총 193두 중 BLV 양성(+)이 122두이고 음성(-)이 71두로 BLV 양성률은 63.
- 05%의 매우 높은 감염률을 보였다. 한편, ELISA 기법에 의한 BLV 감염여부의 진단결과는 5개 목장 총 193두 중 BLV 양성(+)이 122두이고 음성(-)이 71두로 BLV 양성률은 63.21%로 이는 PCR 기법의 BLV 감염률 87.05%보다 낮은 수치를 보였다.
- 2%, 지역별 BLV 감염률의 범위 50∼70% 보다는 PCR기법의 경우에는 아주 높은 감염률을 보인 반면 ELISA 기법은 다소 높은 수치를 보였다(서, 2004). PCR기법에 의한 젖소목장별로 BLV 감염진단 결과를 살펴보면 U, S, T, C 및 D 목장의 BLV 감염 률은 각각 100, 80.55, 84.46, 91.30 및 84.84%로 각 목장의 BLV 감염률은 대체로 높은 수준을 보였다. 한편, 젖소 목장별로 BLV 감염률을 비교하여 보면 S목장이 조사두수 36두 중 29두가 BLV에 감염되어 80.
- 30%로 이들 젖소목장 간에는 유의적인 차이가 인정되지 않았다. 그리고 ELISA 기법에 의한 젖소목장별 BLV 감염진단 결과를 살펴보면 U, S, T, C, 및 D목장의 BLV 양성 률은 각각 75.00, 22.22, 59.61, 86.95 및 77.27%로 S목장을 제외하고 다른 목장들은 대체로 높은 수준의 BLV 양성 률을 보였다. 한편, 젖소 목장별 BLV 양성률을 비교하여 보면 S목장은 조사두수 36두 중 8두가 BLV 양성으로 22.
- 이와 같이 젖소목장 간에 BLV 감염률에 차이를 보이는 것은 목장관리에 있어서 목장주의 질병에 대한 방역 및 위생관리 등과 밀접한 관계가 있는 것으로 생각된다. 또한, PCR 기법과 ELISA 기법에 의한 BLV 진단 결과는 조사된 5개 목장 총 193두에 대한 BLV 감염진단 분포에 있어서 BLV 양성우 두수는 각각 168두와 122두로 양성률은 각각 87.05%와 63.21%로서 두 기법 간에 23.84%의 차이를 보였다. 이와 같은 결과는 ELISA 기법의 경우 젖소에서 BLV가 감염된 후 일정기간의 잠복기가 지나야만 생성되는 항체의 유무로 판단하기 때문에 BLV에 감염되었어도 일정기간이 지나지 않은 경우에는 항체가 생성되지 않아 BLV 음성(-)으로 판정될 수 있다.
- PCR과 ELISA 기법에 의한 5개목장의 BLV진단 감염율의 법위는 각각 80.55∼100%와 22.22∼86.95%로 두 기법 모두 5개 목장 간에 유의차인 차이를 보였다(P<0.05).
- PCR 기법과 ELISA 기법 간의 BLV 진단율의 일치도를 알아보기 위한 Kappa statistics를 분석한 결과는 Table 3과 같다. PCR 기법과 ELISA 기법 간의 목장별 BLV진단 양성율에 대한 일치도인 Kappa 통계치는 S, U 및 D목장이 각각 -0.005, 0.000 및 0.093의 아주 낮은 수치로 두 BLV 진단기법 간에 극히 미약한 일치의 정도를 보였다. 그러나 C 및 D목장의 경우 Kappa 통계치는 각각 0.
- 093의 아주 낮은 수치로 두 BLV 진단기법 간에 극히 미약한 일치의 정도를 보였다. 그러나 C 및 D목장의 경우 Kappa 통계치는 각각 0.452 및 0.633으로 중등도의 일치와 상당한 일치를 보여 두 기법 간에 BLV 양성율 진단에 상당한 일치를 보였다. 한편, 5개 젖소목장의 Kappa 통계치의 평균은 0.
- 633으로 중등도의 일치와 상당한 일치를 보여 두 기법 간에 BLV 양성율 진단에 상당한 일치를 보였다. 한편, 5개 젖소목장의 Kappa 통계치의 평균은 0.246으로 PCR 기법과 ELISA 기법 간의 BLV감염진단율의 일치도는 다소 낮은 약간의 일치를 보였다. 이러한 결과는 ELISA 기법은 BLV항체 생성유무에 의한 진단기법으로 BLV가 감염된 후 일정기간의 잠복기가 지나야만 항체가 생성되기 때문에 BLV에 감염되었어도 일정기간이 지나지 않은 경우에는 항체가 생성되지 않아 BLV음성(-)으로 판정될 수 있기 때문인 것으로 사료 된다.
- 그러나 PCR기법은 젖소에 감염된 BLV 유전자를 직접 증폭시켜 진단하는 기법으로 ELISA기법으로는 진단하기 어려운 BLV 감염 초기에도 진단이 가능하여 비교적 빠른 시간과 높은 정확성으로 감염우를 진단할 수 있기 때문인 것으로 판단된다. 따라서 PCR 기법과 ELISA 기법 간의 BLV감염진단율의 일치도가 낮은 것으로 판단되어 젖소의 BLV감염진단시 ELISA 기법에 비하여 PCR기법을 이용하는 것이 진단율의 정확도를 증대시킬 수 있을 것으로 사료 된다.
- 젖소에 감염된 BLV유전자를 PCR기법을 이용하여 증폭한 결과 gag, pol 및 env 유전자가 각각 226bp, 596bp 및 434 bp로 잘 증폭되었음을 확인할 수 있었다. PCR과 ELISA 기법에 의한 5개목장의 BLV진단 감염율의 법위는 각각 80.
- 05). 또한, PCR과 LIASA기법에 대한 5개목장의 BLV진단 감염율의 평균은 각각 87.05%와 63.21%로 PCR기법이 23.84%가 높았다. PCR과 LIASA기법간의 BLV진단 감염율에 대한 Kappa Statistics에 의한 평균 일치도는 0.
- 84%가 높았다. PCR과 LIASA기법간의 BLV진단 감염율에 대한 Kappa Statistics에 의한 평균 일치도는 0.246으로 두 기법간에 약간의 일치만을 보였다. 따라서 홀스타인종 젖소에 있어서 PCR기법이 ELISA기법보다 BLV감염진단의 정확도를 증대시킬 수 있을 것으로 사료된다.
- 246으로 두 기법간에 약간의 일치만을 보였다. 따라서 홀스타인종 젖소에 있어서 PCR기법이 ELISA기법보다 BLV감염진단의 정확도를 증대시킬 수 있을 것으로 사료된다.
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