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문제 정의
- pylori에 감염된 위상피세포에서 발현이 증가하는 것으로 관찰된 14-3-3에 대해 연구하고자 하였다. 14-3-3은 다른 단백질과의 결합 및 해리를 통하여 세포대사에 관여하므로, 본 연구에서는 H. pylori 감염시 14-3-3과의 결합이 증가하거나 혹은 감소하는 단백질을 규명하고자 하였다.
- 본 연구에서는 선행 연구에서 H. pylori에 감염된 위상피세포에서 발현이 증가하는 것으로 관찰된 14-3-3에 대해 연구하고자 하였다. 14-3-3은 다른 단백질과의 결합 및 해리를 통하여 세포대사에 관여하므로, 본 연구에서는 H.
제안 방법
- 14-3-3 σ에 결합한 단백질을 분리추출하기 위해 면역침전법을 실시하였다.
- 그 후 각각의 1차 항체를 포함한 TBST에 막을 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 1차 항체와 반응이 끝난 막을 다시 horseradish peroxidase-conjugated 2차 항체에 반응시킨 후 ECL system(Amersham)을 이용하여 단백질의 발현 정도를 측정하였다. 막을 항 actin 항체와 다시 반응시켜 일정한 양의 단백질을 사용하였는지 확인하였다.
- 그 후 Melanie 프로그램(Swiss Institute of Bioinformatics, Geneva, Switzerland) 을 이용하여 변화된 단백질 spot을 선별하였다. H. pylori 처치시 14-3-3에 대한 결합이 1.5배 이상 증가 혹은 감소한 spot을 분리하여 추후 분석을 하였다. Coomassie brilliant blue G-250으로 spot을 가시화한 겔의 표본을 Fig.
- H. pylori가 위상피세포의 14-3-3 단백질 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 AGS 세포에 H. pylori를 1:300의 비율로 처리한 후 웨스턴블롯 실험을 통해 14-3-3의 단백질 양을 분석하였다. 그 결과 포유류에 존재하는 14-3-3의 7가지 아이소형 중 σ형의 발현이 H.
- H. pylori를 처치한 세포(H. pylori 군)와 처치하지 않은 세포(None군)에서 14-3-3 σ에 결합한 단백질을 분리하여 전기영동을 실시하였다(Fig. 2).
- H. pylori에 감염된 AGS세포의 단백질 발현 변화를 살펴보기 위해 웨스턴 블롯을 실시하였다. AGS세포에 H.
- 이를 원심분리하여 전체 단백질을 얻은 후 8～30 ㎍의 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드겔에서 전기영동하였다. 겔에 있는 단백질을 Hybond-PVDF막(Amersham Inc., IL, USA)으로 옮기고 5% 탈지분유를 포함한 TBST 차단완충액으로 차단하였다. 그 후 각각의 1차 항체를 포함한 TBST에 막을 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다.
- 1차원 등전점 전기영동을 위해 단백질 3 ㎎과 재수화 용액을 혼합한 후 IPG strip(pH5-8, BioRad)에 넣고 하룻밤 동안 재수화시켰다. 그 후 60,000 VH, 20℃에서 1차원 전기영동을한 후 IPG strip을 20 ㎎/㎖ DTT와 25 ㎎/㎖ iodoacetamide를 함유한 평형 완충용액(6M urea, 150mM Tris-HCl pH 8.8, 2% SDS, 30% glycerol, 2% DTT)에 각각 15분간 담가 반응을 시켰다. 완충반응이 끝난 IPG strip을 11% SDS-폴리아크릴아미드겔(1.
- 염색된 겔은 GS 690 Imaging densitometer(Bio-Rad)로 스캔하여 디지털화하였다. 그 후 Melanie 프로그램(Swiss Institute of Bioinformatics, Geneva, Switzerland) 을 이용하여 변화된 단백질 spot을 선별하였다. H.
- 시료를 MALDI-TOF/Q-TOF에 주입하여 펩타이드의 질량값을 분석하였다. 그 후 생물정보학 기법을 이용하여 질량값 측정분석을 통해 얻어진 데이터로부터 단백질을 동정하였다. 생물정보학 분석을 위해서는 Protein Prospector의 MS-Fit module을 이용하였다 (http://prospector.
- 1차 항체와 반응이 끝난 막을 다시 horseradish peroxidase-conjugated 2차 항체에 반응시킨 후 ECL system(Amersham)을 이용하여 단백질의 발현 정도를 측정하였다. 막을 항 actin 항체와 다시 반응시켜 일정한 양의 단백질을 사용하였는지 확인하였다.
- Matrix는 α-cyano-4-hydroxy-trans-cinnamic acid 용액을 사용하였다. 시료를 MALDI-TOF/Q-TOF에 주입하여 펩타이드의 질량값을 분석하였다. 그 후 생물정보학 기법을 이용하여 질량값 측정분석을 통해 얻어진 데이터로부터 단백질을 동정하였다.
- 완충반응이 끝난 IPG strip을 11% SDS-폴리아크릴아미드겔(1.5 ㎜, 20×20 ㎝)에 놓고 하룻밤 동안 2차원 전기영동을 하였다.
- pylori 처치 시 14-3-3에 대한 결합이 증가 혹은 감소한 spot을 겔에서 잘라 튜브에 넣고 in-gel digestion을 실시하였다. 우선 125mM ammonium과 acetonitrile(1:1, v/v)의 혼합액으로 겔을 세척한 후 진공건조하였다. 건조된 겔 조각에 0.
- 15M NaCl, 1% NP-40, 1 ㎍/㎖ 단백질 분해효소 억제제)을 넣어 균질화하였다. 이를 원심분리하여 전체 단백질을 얻은 후 8～30 ㎍의 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드겔에서 전기영동하였다. 겔에 있는 단백질을 Hybond-PVDF막(Amersham Inc.
- pylori는 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 초콜릿 우무 평판(Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA)에 접종하여 무산소배양통(BBL Campy PouchⓇ System, Becton Dickinson Microbiology Systems)을 이용하여 미세 산소 환경에서 배양하였다.
- 한편, H. pylori 처치 후 3시간에 14-3-3 σ형의 발현이 가장 큰 변화를 보였으므로 H. pylori 처치 후 3시간에 세포를 수확하여 추후 실험을 하였다.
대상 데이터
- 인간 위상피세포 AGS(위 선암종, ATCC CRL 1739)는 American Type Culture Collection에서 구입하였다. 10% FBS, 2 g/ℓ 중탄산염나트륨, 1% 항생제를 첨가한 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.
- NCTC 11367 균주의 H. pylori는 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 초콜릿 우무 평판(Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA)에 접종하여 무산소배양통(BBL Campy PouchⓇ System, Becton Dickinson Microbiology Systems)을 이용하여 미세 산소 환경에서 배양하였다.
- 인간 위상피세포 AGS(위 선암종, ATCC CRL 1739)는 American Type Culture Collection에서 구입하였다. 10% FBS, 2 g/ℓ 중탄산염나트륨, 1% 항생제를 첨가한 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.
이론/모형
- 2% carrier ampholyte, 5mM tributyl-phosphate)을 넣고 교반한 후 원심분리하여 상층액을 취하였다. Bradford protein assay(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 단백질을 정량하였다.
- 그 후 생물정보학 기법을 이용하여 질량값 측정분석을 통해 얻어진 데이터로부터 단백질을 동정하였다. 생물정보학 분석을 위해서는 Protein Prospector의 MS-Fit module을 이용하였다 (http://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form= msfitstandard).
성능/효과
- 2차원 전기영동 후 얻은 겔을 비교한 결과, None군에 비해 H. pylori군에서 14-3-3 σ에 대한 결합이 1.5배 이상 증가한 단백질이 발견되었다(Fig. 3, Table 1).
- WD-repeat 단백질의 중요성은 암과의 상관성에 의해서도 입증된다. WD-repeat 단백질의 일종인 hWIPI-2와 hWIPI-4는 정상조직과 비교 시, 췌장암과 신장암 조직에서 발현이 저하 되어 있는 것으로 나타났다. hWIPI-1도 이들 조직에서 감소된 양상을 보였지만 피부암과 자궁경부암 조직 샘플에서는 오히려 상승하였다고 한다(Proikas-Cezanne 등 2004).
- 그 결과 포유류에 존재하는 14-3-3의 7가지 아이소형 중 σ형의 발현이 H. pylori 처치 후 3시간에 증가하는 것을 관찰하였다.
- 그러나 H. pylori 처치 후 6시간에는 기저 수준으로 돌아왔으며, 처치 시간이 길어질수록 14-3-3 σ형의 양이 점차 감소함을 관찰할 수 있었다(Fig. 1).
- Skp2가 증가한 경우 세포주기가 촉진되고 세포자멸사가 억제되는데, 이는 모두 암 발생 증가로 이어질 수 있다. 따라서 본 연구결과는 14-3-3과 Skp2 간 결합의 변화가 H. pylori 감염 시 위암 발생이 증가하는 하나의 기전이 될 수 있다는 것을 시사한다. 그러나 이에 대해서는 더 많은 연구가 필요하다.
- 본 연구에서 H. pylori 감염 시 AGS 세포에서 Skp2와 14-3-3의 결합이 증가하는 것으로 드러났는데, 이는 Skp2 단백질 양의 증가로 이어질 수 있다. Skp2가 증가한 경우 세포주기가 촉진되고 세포자멸사가 억제되는데, 이는 모두 암 발생 증가로 이어질 수 있다.
- pylori 감염에 따른 위상피세포의 반응을 정확하게 파악하는 것이 우선이다. 본 연구의 결과는 H. pylori 감염에 대한 반응으로 위상피세포에서 일어나는 세포신호전달에서 14-3-3과 14-3-3결합단백질이 중요한 역할을 담당할 것이라는 것을 보여준다. 그러나 이들이 정확히 어떤 역할을 하는지에 대해서는 더 많은 연구가 필요하다.
- 이들은 추후 연구를 통해 중간엽세포가 평활근세포로 분화 되는 과정에서 중간엽세포는 hnRNP H의 발현을 감소시키며, 이는 α-액틴, 데스민, 미오신과 같은 평활근세포에 특이적인 단백질의 발현 증가로 이어진다는 사실을 밝혀냈다(Liu 등 2001). 이들의 연구 결과는 hnRNP H가 유전자의 발현을 조절하고 이를 통해 세포의 분화를 조절한다는 것을 보여준다.
- 프로테오믹스 기법을 이용하여 분석한 결과, 이 단백질은 S-phase kinase-associated protein 2 isoform 2(Skp 2, I1)로 밝혀졌다. 측정된 pI는 7.9이고, 분자량은 약 46.6kDa으로 분석되었다. 반면, H.
후속연구
- AGS 세포에 H. pylori를 처치했을 때 14-3-3의 아이소형중 σ형의 발현이 가장 뚜렷하게 변화하므로 추후의 연구에서는 14-3-3 σ형에 한정하여 실험하였다.
- pylori 감염 시 Skp2가 위 세포 내 신호전달에 관여하는 것으로 보인다. 그러나 H. pylori 를 처치한 AGS 세포에서 p27은 감소하지만 Skp2의 수준은 변화가 없었다는 연구결과도 있으므로(Eguchi 등 2003) H. pylori 감염 시 Skp2의 역할에 대해서는 좀 더 연구가 필요하다.
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