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문제 정의
- 본 연구에서는 대부분이 가축사료로 이용되고 있는 농산부산물인 미강을 이용한 부가가치가 높은 화장품 원료를 개발하기 위하여 Bacillus subtilis를 이용한 발효공법에 의한 미강 발효추출물의 항산화 효과, 지질 과산화 억제효과와 tyrosinase 활성저해효과를 확인하였다. 실험결과 Bacillus subtilis를 이용하여 발효시킨 미강발효추출물의 항산화 활성 측정 시 표준물질 vitamin C와 비교하여 DPPH 소거에서의 효과는 확연히 높은 효과를 나타내지 않았지만 발효를 하지 않은 미강추출물과 비교 시에는 더 높은 소거활성을 나타내었다.
- 이에 본 연구에서는 쌀의 도정 부산물인 미강의 발효추출물을 이용해 항산화능과 미백과 관련있는 mushroom tyrosinase활성 저해 효과를 측정함으로써 미백 효과를 가진 화장품 소재를 개발하고자 한다.
제안 방법
- 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) 1 mM 50 µL와 esterase (600 unit/mL) 50 µL를 혼합한 뒤 37 ℃에서 20 min 간 반응시켜 2',7'-dichlorodihydro-fluorescein (DCFH) solution을 만든 후 DCF측정법을 사용하여서 평가하였다[21].
- 자동산화가 잘되는 물질인 리놀산을 이용하여 자동산화를 억제하는 정도를 실험한 것으로 10 mM 리놀산 용액[22]과 시료를 첨가한 후 4 ℃에서 24 h 방치하였다. 상기의 혼합액에 75 % 에탄올을 첨가하여 교반한 후 40% 티오시안산암모늄용액과 20 mM 염화 제 1철을 첨가하여 3 min간 방치한 후 발색시켜 UVIKON-XS로 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 미백효과의 경우 멜라닌 생성에 관여하는 mushroom tyrosinase 활성 저해능의 효과를 통하여 확인하였는데 미강의 발효추출물의 mushroom tyrosinase 활성 저해능 측정 시 100, 1 µL/mL 농도에서 표준물질 vitamin C 보다 뛰어난 mushroom tyrosinase 활성 저해능이 나타나 것으로 미백효과를 확인할 수 있었으며 미강추출물과 미강발효추출물의 유의적인 차이가 나타났다. 이러한 결과로부터 미강이 발효에 의해 항산화 및 미백 효과의 증진을 확인하였다. 이를 기초로 하여 미강의 발효추출물을 이용 시 항산화 활성과 미백 효능에 우수한 화장품의 소재로서 이용이 될 수 있다고 사료된다.
- 자동산화가 잘되는 물질인 리놀산을 이용하여 자동산화를 억제하는 정도를 실험한 것으로 10 mM 리놀산 용액[22]과 시료를 첨가한 후 4 ℃에서 24 h 방치하였다. 상기의 혼합액에 75 % 에탄올을 첨가하여 교반한 후 40% 티오시안산암모늄용액과 20 mM 염화 제 1철을 첨가하여 3 min간 방치한 후 발색시켜 UVIKON-XS로 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 효소활성 측정에는 96 well plate에 각 시료 15 µL를 넣고 0.1 M 인산완충용액(pH 6.86) 150 µL과 1.5 mM L-티로신 용액 25 µL와 2,380 unit/mL mushroom tyrosinase 7 µL를 각각 넣어 UVIKON-XS로 490 nm에서 흡광도를 측정한 후 30 ℃에서 10 min 반응 후 UVIKONXS로 490 nm에서 흡광도를 측정하였고 대조군에는 시료를 넣지 않은 96 well plate에 0.05 M 인산완충 용액(pH 6.86) 150 µL과 1.5 mM L-티로신 용액 25 µL와 2,380 unit/ML와 mushroom tyrosinase 7 µL를 각각 넣어 UVIKON-XS로 490 nm에서 흡광도를 측정한 후 30 ℃에서 10 min 반응 효소활성 저해능은 반응 시간에 변화된 초기 흡광도의 변화 값을 측정하였고 tyrosinase 활성 저해능은 다음과 같이 계산하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 미강은 부산 사상 홈플러스에서 구입하여 사용하였다. Bacillus subtilis는 균주은행에서 구입하였다. 미강 20 g에 멸균수 200 mL을 혼합하여 Bacillus subtilis를 600 nm 흡광도가 1.
- 0일 때 1 %를 접종하여 40 ℃에서 36 h 동안 고체발효하였다. 미강발효시료에 80 % ethanol을 4 h 동안 침지 후 상등액을 채취하여 40 ℃에서 농축시킨 미강발효추출물(RFB)과 미강 20 g에 80 % ethanol을 4 h 동안 침지 후 상등액을 채취하여 40 ℃에서 농축하여 발효시키지 않은 미강 추출물(RB)을 실험에 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 미강은 부산 사상 홈플러스에서 구입하여 사용하였다. Bacillus subtilis는 균주은행에서 구입하였다.
데이터처리
- RFB군과 RB군의 차이에 대한 유의성은 t-test로 검증하였고, 유의성은 p < 0.05로 하였다.
- 01, in two-sided student's t-test. a, b, c, d, e, f, g, h, I, j are different group by one-way ANOVA with post-hoc test.
- 01 in two-sided student's t-test. a, b, c, d, e, f, g, h, i are different group by one-way ANOVA with post-hoc test.
- 본 실험에 대한 모든 실험 결과는 평균치와 표준편차로 나타내었고, 통계적 유의성은 SPSS를 이용한 one-way ANOVA로 검정하였으며, 사후 검증은 Dumcan's posthoc test를 실시하였다.
이론/모형
- DCFDA (1 mM) 50 µL와 esterase (600 unit/mL) 50µL를 혼합한 뒤 37 ℃에서 20 min간 반응시켜 DCFH solution을 만들어 DCF 측정법을 이용하여 실시하였다[20].
성능/효과
- 100, 1 µL/mL의 농도에서 표준물질 vitamin C보다 더 높은 tyrosinase 활성 저해효과가 나타났다.
- DPPH결과는 Figure 1에 나타내었으며 RFB는 100 > 10 > 1 µL/mL 순으로 각각 61, 53, 47 %의 농도 의존적인 자유라디칼 소거 활성을 보였다. RB와 RFB은 모든 농도에서 자유라디칼 소거 활성의 유의적인 차이를 보였으나 표준물질로 사용된 vitamin C보다는 다소 소거능이 떨어지는 것으로 나타났다.
- RFB는 100 > 10 > 1 µL/mL 순으로 각각 62, 59, 57 %의 농도 의존적인 지질과산화 억제효과가 나타났다.
- RFB는 100 > 10 > 1 µL/mL 순으로 각각 89, 72, 61 %의 농도 의존적인 superoxide radical 소거 활성을 보였으며 RFB은 같은 농도의 표준물질인 vitamin C와 RB에 비하여 각각의 동일농도에서 가장 높은 superoxide radical 소거 활성을 나타내어 발효과정을 통해 RB보다 항산화 활성이 증가하는 것으로 나타났다.
- RFB는 100 > 10 >1 µL/mL 순으로 각각 82, 78, 55 %의 우수한 hydroxyl radical 소거효과를 나타내며, 표준물질 vitamin C와 RB에 비하여 매우 높은 항산화 능을 보였다.
- 실험결과 Bacillus subtilis를 이용하여 발효시킨 미강발효추출물의 항산화 활성 측정 시 표준물질 vitamin C와 비교하여 DPPH 소거에서의 효과는 확연히 높은 효과를 나타내지 않았지만 발효를 하지 않은 미강추출물과 비교 시에는 더 높은 소거활성을 나타내었다. 그리고 superoxide radical, hydroxyl radical 소거작용의 경우 표준물질 vitamin C보다 더 우수한 항산화능을 확인할 수 있었으며 미강추출물과의 유의적인 차이를 확인할 수 있었다. 또한 linoleic acid를 이용한 지방산산화 억제 활성 측정 실험 결과 에서도 발효에 의한 지방산 산화억제활성이 증가됨을 확인할 수 있었다.
- 그리고 superoxide radical, hydroxyl radical 소거작용의 경우 표준물질 vitamin C보다 더 우수한 항산화능을 확인할 수 있었으며 미강추출물과의 유의적인 차이를 확인할 수 있었다. 또한 linoleic acid를 이용한 지방산산화 억제 활성 측정 실험 결과 에서도 발효에 의한 지방산 산화억제활성이 증가됨을 확인할 수 있었다. 미백효과의 경우 멜라닌 생성에 관여하는 mushroom tyrosinase 활성 저해능의 효과를 통하여 확인하였는데 미강의 발효추출물의 mushroom tyrosinase 활성 저해능 측정 시 100, 1 µL/mL 농도에서 표준물질 vitamin C 보다 뛰어난 mushroom tyrosinase 활성 저해능이 나타나 것으로 미백효과를 확인할 수 있었으며 미강추출물과 미강발효추출물의 유의적인 차이가 나타났다.
- 또한 linoleic acid를 이용한 지방산산화 억제 활성 측정 실험 결과 에서도 발효에 의한 지방산 산화억제활성이 증가됨을 확인할 수 있었다. 미백효과의 경우 멜라닌 생성에 관여하는 mushroom tyrosinase 활성 저해능의 효과를 통하여 확인하였는데 미강의 발효추출물의 mushroom tyrosinase 활성 저해능 측정 시 100, 1 µL/mL 농도에서 표준물질 vitamin C 보다 뛰어난 mushroom tyrosinase 활성 저해능이 나타나 것으로 미백효과를 확인할 수 있었으며 미강추출물과 미강발효추출물의 유의적인 차이가 나타났다. 이러한 결과로부터 미강이 발효에 의해 항산화 및 미백 효과의 증진을 확인하였다.
- 본 연구에서는 대부분이 가축사료로 이용되고 있는 농산부산물인 미강을 이용한 부가가치가 높은 화장품 원료를 개발하기 위하여 Bacillus subtilis를 이용한 발효공법에 의한 미강 발효추출물의 항산화 효과, 지질 과산화 억제효과와 tyrosinase 활성저해효과를 확인하였다. 실험결과 Bacillus subtilis를 이용하여 발효시킨 미강발효추출물의 항산화 활성 측정 시 표준물질 vitamin C와 비교하여 DPPH 소거에서의 효과는 확연히 높은 효과를 나타내지 않았지만 발효를 하지 않은 미강추출물과 비교 시에는 더 높은 소거활성을 나타내었다. 그리고 superoxide radical, hydroxyl radical 소거작용의 경우 표준물질 vitamin C보다 더 우수한 항산화능을 확인할 수 있었으며 미강추출물과의 유의적인 차이를 확인할 수 있었다.
- 표준물질 vitamin C의 농도가 100 µL/mL일 때 RFB에서 이보다 더 낮은 농도 10 µL/mL에서 7 % 더 높은 hydroxyl radical 소거효과를 나타내었으며 다른 라디칼 소거활성에 비해 강한 hydroxyl radical 소거효과를 보였다.
후속연구
- 이러한 결과로부터 미강이 발효에 의해 항산화 및 미백 효과의 증진을 확인하였다. 이를 기초로 하여 미강의 발효추출물을 이용 시 항산화 활성과 미백 효능에 우수한 화장품의 소재로서 이용이 될 수 있다고 사료된다.
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