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문제 정의
- 한약은 여러 약물의 혼합을 통해 전체적인 뇌기능 향상을 도모할 수 있어 한가지 처방이 기억력과 집중력을 동시에 향상 시킬 수 있을 것으로 예상하였다. 이에 연구자는 총아100으로 기억력 및 집중력과 관련하여 생쥐 및 흰 쥐의 행동실험을 동시에 수행하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하고자 한다.
제안 방법
- 200 ㎎/㎏ 의 농도로 10일간 소식자(sonde)를 이용하여 경구로 투여하였다.
- 4일째에는 Laursen & Belknap8)이 설정한 절차에 따라서 amyloid-β를 생쥐의 정수리(Bregma)에 주입(intracerebroventricular injection;ICV)하였다.
- 먹이는 clove향기가 있는 자기에만 배치하고, 향기에 따라 먹이를 찾도록 조작하였다. SD단계가 종료되면 다음 단계로 넘어가는데, 이 단계부터는 각 단계 안에서 2과정으로 다시 나누어, 일차적으로 표에 제시된 처음 조건을 5회 연속으로 성공하면 조건을 뒤집어서 다시 실험하였으며, 이 과정을 한 단계로 설정하였다. 다음 단계는 Compound discrimination(CD) 단계로서, SD 단계와 동일한 향기를 사용하였으며, clove향기가 있는 곳에 먹이를 배치하였고, 눈에 보이는 재질을 톱밥대신 볼모양의 솜털과 털실로 나누었다.
- 실험하는 과정에서도 한약은 계속 투여하였다. 각 군당 10마리 정도로 나누었으며, 대조군(사료와 물을 제공), 증류수군(치매 유발, 사료와 물을 제공 먹은 군), 저농도군(치매 유발, 사료와 물, 저농도 총아100제공), 고농도군(치매 유발, 사료와 물, 고농도 총아100제공)으로 나누어 실험하였다.
- 각 단계는 전일 실험과 같이 5회 연속으로 성공한 것을 성공으로 인정하였다. 각 실험에서 먹이가 있는 자기는 불특정하게 좌우의 위치를 변경하여 쥐가 방향성에 따라 선택하지 않도록 하였으며, 먹이가 없는 자기에는 먹이를 가루내어 분사하여 먹이 냄새를 맡고 움직이지 않도록 하였다.
- 각각의 생쥐는 50 ㎕ Hamilton microsyringe에 26-gauge 바늘을 덧씌워 2.4 ㎜의 깊이가 주입되도록 설치한 후 생쥐의 정수리(Bregma)에 amyloid-β를 5 ㎕씩 주입하였다.
- 농도가 결정되면, amyloid-β를 생쥐에게 주입한 후 동일한 방식으로 실험을 진행하였다.
- SD단계가 종료되면 다음 단계로 넘어가는데, 이 단계부터는 각 단계 안에서 2과정으로 다시 나누어, 일차적으로 표에 제시된 처음 조건을 5회 연속으로 성공하면 조건을 뒤집어서 다시 실험하였으며, 이 과정을 한 단계로 설정하였다. 다음 단계는 Compound discrimination(CD) 단계로서, SD 단계와 동일한 향기를 사용하였으며, clove향기가 있는 곳에 먹이를 배치하였고, 눈에 보이는 재질을 톱밥대신 볼모양의 솜털과 털실로 나누었다. 다음 단계는 reversal of Compound discrimination (CD Rev)의 단계로 CD단계에서 먹이가 들어가는 향기만 바꾼 조작을 통해 실험하였다.
- 다음 단계는 reversal of intradimension(ID Rev)단계로서, CD Rev와 동일한 방식으로써 ID 단계에서 사용한 향기와 재질을 사용하였다. 다음 단계는 extradimension(ED) 단계로서 전 단계가 향기를 따라서 먹이를 배치하는 방식이었다면, 이번 단계는 재질에 따라 먹이를 배치하는 방식으로 진행하였다. 다음 단계인 reversal of extradimension(ED Rev) 역시 metallic ball에 먹이를 배치하는 식으로 하였다.
- 다음 단계는 Compound discrimination(CD) 단계로서, SD 단계와 동일한 향기를 사용하였으며, clove향기가 있는 곳에 먹이를 배치하였고, 눈에 보이는 재질을 톱밥대신 볼모양의 솜털과 털실로 나누었다. 다음 단계는 reversal of Compound discrimination (CD Rev)의 단계로 CD단계에서 먹이가 들어가는 향기만 바꾼 조작을 통해 실험하였다. 다음 단계는 intradimension(ID) 단계로서, CD단계와 동일한 방식으로 진행되나, 향기나 재질을 완전히 다른 것으로 교체하였다.
- 상기의 과정과 동일한 방법을 반복한다. 단, 실험 10일 전에 5일간 동물 실험실에 적응토록 하고, 일주일간 한약을 경구투여한 후에 실험을 진행하였다. 실험하는 과정에서도 한약은 계속 투여하였다.
- 5일째에는 생쥐를 밝은 방에 내려놓고, 어두운 방으로 들어가는 시간(latency)을 확인하였다. 뒷발까지 넘어갔을 때 넘어간 것으로 간주하였으며, 각 test는 최대한 300초까지 측정하였고, 300초를 초과한 것은 300초로 간주하였다.
- 본 실험에 앞서 수동회피 실험을 이용하여 치매가 유발될 수 있는 amyloid-β의 농도를 측정하였다.
- 생쥐는 3일간 shuttle box 안에서 자유롭게 생활하였다. 생쥐 밝은 방에 투입하여, 어두운 방으로 스스로 찾아가도록 하였고, 어두운 방으로 넘어가면 약 1분간 쉬게 한 후, 밝은 방으로 몰아낸 다음 상자에서 빼냈다.
- 각 생쥐는 한 쪽 미로의 끝에서 벽을 보고 있는 상태에서 출발하여 다른 가지(arm)로 가도록 하였으며, 교차를 올바르게 성공하면, 1점을 부여하였다. 생쥐가 올바르게 교차하였는지를 측정하기 위해 측정된 점수에서 획득가능한 최고 점수(각 arm을 통과한 합에서 2를 뺀 회수)로 나누어서 100을 곱하여 점수를 산정하였다. 미로를 통과하는 기준은 생쥐가 각 통로의 반을 통과한 시점으로 하였다.
- 수동 회피 실험 다음날 동일한 생쥐로 Y자형 미로 실험 (Y-maze task)를 통해 측정하였다. 생쥐의 움직임을 교차회수 (alternation)로 나타내는데, 교차회수란 생쥐가 연속적으로 3개의 통로를 순차적으로 통과하였을 때 한 번 교차한 것으로 정의된다.
- 수동 회피 실험을 시행하였으며, 증류수를 먹이고 뇌에 증류수를 주입한 대조군(Con)과 증류수를 먹이고 뇌에 amyloid-β 1 nmol을 주입한 증류수군(DW), 한약혼합제제를 40 ㎎/㎏복용하고 뇌에 amyloid-β 1 nmol를 주입한 저농도군(Low), 한약혼합 제제를 200 ㎎/㎏복용하고 뇌에 amyloid-β 1 nmol를 주입한 고농도군(High)로 나누어서 실험하였으며, 고농도군에서 효과가 있음을 확인하였다(Fig. 3).
- 실험은 증류수를 뇌에 주입한 대조군(Con)과 amyloid-β를 500 pmol 주입한 군(500)과 1 nmol을 주입한 군(1000)으로 나누어 실험하였으며, 1 nmol을 주입한 군에서 치매가 유발되었음을 확인하였다(Fig. 2).
- 좌측 방의 뚜껑에는 할로겐 전구(250W)를 달아 실험 동물이 싫어하는 매우 밝은 환경을 조성하였다. 우측 방에는 실험 동물의 발바닥에 전기 충격을 가할 수 있도록 밑면에 스테인레스봉을 깔고 통전장치를 설치하여 AC 가변 전원 전기 충격발생기로 2.0 ㎃의 전기 충격을 가할 수 있게 하였다. 밝은 방의 벽면은 흰색의 아크릴로 하였고, 어두운 방은 검은색 아크릴로 하였다.
- 이 중 Rosewood 향기가 있는 그릇에만 먹이를 배치하여, 쥐가 향기에 따라 먹이가 있다는 것을 인식시켰다. 이 때 그릇은 무작위로 위치를 바꾸어, 방향에 따른 변수를 배제하였고, 쥐가 자기 그릇에 가서 톱밥을 뒤지지 않고 냄새만 맡고, 정확한 그릇으로 가서 톱밥을 뒤져서 먹이를 찾아내는 것을 성공으로 인정하여, 이를 5회 연속 성공하면 다음 단계로 넘어가도록 하였다.
- 4 ㎜의 깊이가 주입되도록 설치한 후 생쥐의 정수리(Bregma)에 amyloid-β를 5 ㎕씩 주입하였다. 이 때 생쥐는 각 군당 10마리로 하였으며, 대조군 (Con)은 ICV 시행시 phosphate-buffered saline(PBS)를 투여하였으며, 500 pmol 투여한 군(500), 1 nmol 투여한 군(1000)으로 나누어 실험을 진행하였다.
- 이번에 사용된 실험들은 뇌기능을 측정하기 위해 디자인된 행동실험이다. 수동 회피 실험은 기억능력을 평가하기 위한 실험9,10)으로써 한약혼합물 제제를 복용하는 과정에서 amyloid-β로 뇌실에 주입하여 치매를 유발하고, 강한 전기 자극을 가해 생쥐가 기억하던 어두운 방의 안락함을 위험한 방으로 인식시키는 방식으로 사건 기억을 측정하도록 고안되었다.
- 첫째 날과 둘째 날은 이 무대에 대해 적응 시켰다. 자기 그릇에는 톱밥을 깔고 먹이를 놓았는데, 먹이는 (주)동서식품(서울, 대한민국)에서 제조된 코코볼을 절반 정도의 크기로 절단하여 1회 먹는 양으로 하여 먹도록 하였다. 쥐는 출발대기실에서 칸막이가 열리면 전방에 있는 자기로 나아가 먹이를 먹도록 하였으며, 먹이를 먹은 후 반대편 자기로 움직이면 비워진 자기에 다시 먹이를 보충하여 쥐가 5분간 자유롭게 양쪽 자기를 왕복하면서 먹도록 먹이를 제공하였다.
- 저농도 군은 40 ㎎/㎏, 고농도 군은 200 ㎎/㎏ 의 농도로 12일간 소식자(sonde)를 이용하여 경구로 투여하였다.
- 자기 그릇에는 톱밥을 깔고 먹이를 놓았는데, 먹이는 (주)동서식품(서울, 대한민국)에서 제조된 코코볼을 절반 정도의 크기로 절단하여 1회 먹는 양으로 하여 먹도록 하였다. 쥐는 출발대기실에서 칸막이가 열리면 전방에 있는 자기로 나아가 먹이를 먹도록 하였으며, 먹이를 먹은 후 반대편 자기로 움직이면 비워진 자기에 다시 먹이를 보충하여 쥐가 5분간 자유롭게 양쪽 자기를 왕복하면서 먹도록 먹이를 제공하였다. 5분이 종료되면 쥐를 다시 출발 대기실에서 출발하여 다시 5분간 자유롭게 먹을 수 있도록 반복하는데, 첫 번째 훈련과는 달리 먹이를 안 보이게 톱밥으로 가렸다.
- 실험 결과 본 실험에서 치매가 유발되기 위해 사용된 amyloid-β의 농도는 1nmol로 결정하였고, 2가지 농도로 기억력 실험을 측정한 결과 농도 의존적으로 효과가 확인되었다. 집중력 실험의 경우 증류수를 먹은 군과 한약을 200 ㎎/㎏ 농도로 먹은 두 군으로 분류하여 실험하여 효과를 확인하였다.
- 집중력 조합-이동 실험을 시행하였으며, 증류수를 복용한 대조군(Con)과 한약혼합제제를 복용한 탕약(Tang)군으로 나누어 실험하였으며, 탕약군의 유의한 효과를 확인하였다(Fig. 5).
- 집중력 측정은 Birrell & Brown5)이 제안한 집중력 조합-이동 실험(Attentional Set-Shifting Task)을 약간 변형하여 시행하였다.
- 이는 하얀 색칠을 한 나무로 가로×세로×높이를 40 ㎝×71 ㎝×20 ㎝의 규격으로 제작하고, 상부 1/3 지점은 가운데에 칸막이를 설치한 후 그 중간에 지름 6 ㎝ 구멍을 파서 자기 그릇을 배치하였다. 하부 1/3 지점에는 위아래로 여닫히는 단두대 형식의 칸막이를 만들어 언제든지 올렸다 내렸다 할 수 있도록 하였는데, 이 공간은 생쥐가 대기 상태에 있다가 칸막이가 올라가면 앞으로 나갈 수 있도록 제작하였다(Fig. 1).
대상 데이터
- 8종(Lemon, Rosewood, Clove, Nutmeg, Rosemary, Cinnamon, Citronella, Thyme)의 향기를 준비하여, 2종(Lemon, Rosewood)은 실험 3일째, 나머지 6종은 실험 4일째에 사용하였으며, 향기는 (주)Aromaalab(성남, 대한민국)에서 구입하여 사용 하였다.
- 다음 단계는 intradimension(ID) 단계로서, CD단계와 동일한 방식으로 진행되나, 향기나 재질을 완전히 다른 것으로 교체하였다. 다음 단계는 reversal of intradimension(ID Rev)단계로서, CD Rev와 동일한 방식으로써 ID 단계에서 사용한 향기와 재질을 사용하였다. 다음 단계는 extradimension(ED) 단계로서 전 단계가 향기를 따라서 먹이를 배치하는 방식이었다면, 이번 단계는 재질에 따라 먹이를 배치하는 방식으로 진행하였다.
- 수동회피실험을 위해 왕복상자는 50×50×40 ㎝의 크기로 제작하였다.
- 실험에 사용된 동물은 기억력에 관한 수동회피 실험(Passive Avoidance Test)및 Y자 미로 실험(Y-maze task)은 25±3 g의 ICR계 생쥐(5주령)을 대한 실험 동물로부터 구입하여 대조군, 저농도군, 고농도군(n=10)으로 나누어 실험하였다.
- 실험에 사용된 총아100은 세명대학교 산학협력단 산하 지역 연고산업진흥사업단 참여기업인 자연인에서 제공받아 대추 8.4% 생강 7.0% 석창포 4.9% 백복신 4.9% 원지 2.8% 백복령 2.8% 인삼 2.8% 천궁 2.8% 당귀 2.8% 작약 2.8% 백출 2.8% 감초 2.8% 숙지황 2.8% 황기 2.625% 육계 2.625% 산사 2.625% 맥아 2.625%를 혼합한 후 원료 중량의 5-10배 양의 물을 넣고 95℃로 4시간동안 달인 후 추출하였다. 추출물을 1 ㎛필터로 여과한 후 50brix가 되도록 6시간 동안 감압농축하였다.
- 실험에 사용한 시약은 amyloid-β1-42(Sigma, Seoul, Korea)이다.
- 은 이미 수십 년 전부터 수험생이 기억력 향상을 목표로 하여 널리 애용되고 있다. 이번 실험에 사용된 총아100은 이러한 원리에서 기존의 처방에서 많이 사용 되어진 本草를 중심으로 처방하여 실험에 사용하였다.
- 집중력에 관한 실험에는 230±10 g Sprague-Dawley계 수컷흰 쥐(6주령)를 대한실험동물로부터 구입하여 대조군, 탕약군 (n=8)으로 나누어 실험하였다.
데이터처리
- 수동회피 실험과 Y자 미로 실험은 일원분산분석(One-way ANOVA)으로 측정하였으며, 사후 분석은 Dunett’s test를 시행 하였다.
- 집중력 조합-이동 실험(Attentional Set-Shifting Task)은 이원분산분석(Two-way ANOVA)로 측정하였고, 사후 분석은 Bonferroni test를 시행하였다.
이론/모형
- 사건 기억력은 수동 회피 실험(Passive Avoidance Test)을 통하여 측정하였다. 본 실험에 앞서 수동회피 실험을 이용하여 치매가 유발될 수 있는 amyloid-β의 농도를 측정하였다.
성능/효과
- Y자 미로 실험을 시행하였으며, 사건 기억 능력과 동일한 군으로 나누어 실험하였으며, 고농도군에서 효과가 있음을 확인하였다(Fig. 4).
- 셋째 날, 특정 향기나 특정 재질에 따라 먹이가 있을 수도 있고, 먹이가 없을 수도 있다는 것을 인식시키기 위해 훈련시켰다. 처음에는 동일한 톱밥을 깔아 시각적인 차이를 배제하였고, 하나는 Rosewood, 하나는 Lemon향기를 분사하여 후각적에 따른 변수를 인식시켰다.
- 실험 결과 본 실험에서 치매가 유발되기 위해 사용된 amyloid-β의 농도는 1nmol로 결정하였고, 2가지 농도로 기억력 실험을 측정한 결과 농도 의존적으로 효과가 확인되었다.
- 이번 본 실험실에서 시행된 행동 실험을 통해 총아100이 기억력과 집중력을 향상시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이 실험은 아직 활발하게 연구되고 있지 않은 집중력에 대한 한약에 대한 가능성을 제시한 면에서 어느 정도 의의가 있으나, 본초 각각의 효능에 대한 검증과 면역 화학(immunochemistry)적 연구가 병행되는 것이 필요할 것으로 보인다.
후속연구
- 이번 본 실험실에서 시행된 행동 실험을 통해 총아100이 기억력과 집중력을 향상시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이 실험은 아직 활발하게 연구되고 있지 않은 집중력에 대한 한약에 대한 가능성을 제시한 면에서 어느 정도 의의가 있으나, 본초 각각의 효능에 대한 검증과 면역 화학(immunochemistry)적 연구가 병행되는 것이 필요할 것으로 보인다.
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