Osteoporosis is social problem around the world, because fracture of old age may lead to critical medical condition. Osteoclast is a main target for prevention and treatment of osteoporosis due to their responsibility for bone resorption. Saussureae Radix has been known that has gastro-protective, b...
Osteoporosis is social problem around the world, because fracture of old age may lead to critical medical condition. Osteoclast is a main target for prevention and treatment of osteoporosis due to their responsibility for bone resorption. Saussureae Radix has been known that has gastro-protective, bronchodilatory effect and has a anti-biotic effect. Saussureae Radix has been widely used in Oriental medicine. However, the effect of extract of Saussureae Radix in osteoclast differentiation remains unknown. Thus, we examined the effect of Saussureae Radix in receptor activator of nuclear factor-${\kappa}$B ligand (RANKL)-induced osteoclast differentiation. From the results of our study, Here we found that Saussureae Radix significantly inhibited osteoclast differentiation induced by RANKL. Saussureae Radix suppressed the activation of NF${\kappa}$B in bone marrow macrophages (BMMs) treated with RANKL. Also, Saussureae Radix significantly inhibited the mRNA expression of c-Fos, tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), osteoclast-associated receptor (OSCAR), nuclear factor of activated T cells (NFAT)c1 and cathepsin K in BMMs treated with RANKL. Particularly, Saussureae Radix greatly inhibited the protein expression of c-fos and NFATc1. especially in the case of NFATc1 expression, a master transcription factor of the differentiation of osteoclasts is very important step for osteoclastogenesis. These results demonstrate that Saussureae Radix may be useful treatment option of bone-related disease such as osteoporosis and rheumatoid arthritis.
Osteoporosis is social problem around the world, because fracture of old age may lead to critical medical condition. Osteoclast is a main target for prevention and treatment of osteoporosis due to their responsibility for bone resorption. Saussureae Radix has been known that has gastro-protective, bronchodilatory effect and has a anti-biotic effect. Saussureae Radix has been widely used in Oriental medicine. However, the effect of extract of Saussureae Radix in osteoclast differentiation remains unknown. Thus, we examined the effect of Saussureae Radix in receptor activator of nuclear factor-${\kappa}$B ligand (RANKL)-induced osteoclast differentiation. From the results of our study, Here we found that Saussureae Radix significantly inhibited osteoclast differentiation induced by RANKL. Saussureae Radix suppressed the activation of NF${\kappa}$B in bone marrow macrophages (BMMs) treated with RANKL. Also, Saussureae Radix significantly inhibited the mRNA expression of c-Fos, tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), osteoclast-associated receptor (OSCAR), nuclear factor of activated T cells (NFAT)c1 and cathepsin K in BMMs treated with RANKL. Particularly, Saussureae Radix greatly inhibited the protein expression of c-fos and NFATc1. especially in the case of NFATc1 expression, a master transcription factor of the differentiation of osteoclasts is very important step for osteoclastogenesis. These results demonstrate that Saussureae Radix may be useful treatment option of bone-related disease such as osteoporosis and rheumatoid arthritis.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
RANKL에 의해 발현되는 c-Fos는 NFATc1의 발현을 유도한다. 따라서 본 연구진은 c-Fos와 NFATc1 단백질 발현에 목향 추출물의 효과를 검증하였다. RANKL을 처리한 후 12시간과 24시간에서 c-Fos의 발현이 유의하게 증가되었으며, NFATc1의 발현은 48시간에 증가되었다.
반면 NF-κB의 활성은 파골세포 분화를 촉진하는데 RANKL에 의해 자극된 세포에서 목향 추출물을 첨가하여 IkB의 지속을 통한 NF-κB의 활성을 억제하는 기전을 본 실험을 통해 알 수 있었다.
. 본 연구진은 RANKL에 의해 유도되는 여러가지 유전자 발현에 목향 추출물이 미치는 효과를 실험하였다. RANKL로 자극된 파골세포에서 control에서는 c-Fos, NFATc1등의 주요 전사인자의 발현이 증가하였고 TRAP, OSCAR, Cathepsin K의 발현도 증가하였으나 RANKL과 목향 추출물을 처리한 실험군에서는 주요 유전자등의 발현이 억제 되었다(Fig.
본 연구진은 목향 추출물에 의한 파골세포 분화 억제의 작용기전을 규명하기 위해 RANKL에 의해 전달되는 주요 신호전달체계에 목향 추출물이 미치는 영향을 실험하였다. 대식세포를 목향 추출물로 전 처리 하고 RANKL을 시간별로 처리한 다음 MAPKs의 인산화를 측정하였다.
파골세포는 골 흡수 작용을 하는 세포로서 파골세포 분화의 억제는 골 흡수 억제를 나타낸다. 본 연구진은 천연물질 중 목향 추출물이 파골세포의 분화에 억제 효과를 나타내는지 실험을 통해 확인하였다. 목향의 효과를 검증하기 위해 대식세포에 M-CSF와 RANKL을 첨가하고 목향 추출물을 농도별로 처리하여 4일간 배양하였다.
천연물인 목향 추출물을 통하여 기존 골다공증 치료제의 한계를 극복하고 부작용 없는 치료 약물로서의 가능성을 실험으로 확인하였다. 특히 파골세포 분화의 핵심적인 신호 전달 체계에 작용하여 골 흡수를 억제할 기전을 제시하는 결과로, 향후 이에 대한 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
한약재 중 목향이 아직까지 골 보호기능에 대한 연구 보고가 없어 향후 골다공증 치료 가능성을 확인하고자 골 흡수에 주요 역할을 하는 파골세포 분화에 미치는 목향의 효능 연구를 진행하였다.
제안 방법
분리된 골수세포는 10% FBS, 항생제, M-CSF (30 ng/ml)가 포함된 α-minimum essential medium (α-MEM)배지 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) 에서 3일간 배양하였다. 3일 후, 부착된 세포를 대식세포 (bone marrow macrophage, BMM)로 사용하여 실험하였다. 대식세포는 M-CSF (30 ng/ml)와 RANKL (50 ng/ml)을 첨가하여 배양하고 목향 추출물을 농도별로 처리하였다.
대식세포는 M-CSF (30 ng/ml)와 RANKL (50 ng/ml)을 첨가하여 배양하고 목향 추출물을 농도별로 처리하였다. 4일 후, 배양한 세포는 TRAP 용액 (Sigma Aldrich, USA)으로 염색하고 붉은색으로 염색된 세포를 파골세포로 간주하여 세포의 수를 count 하였다.
5주령 ICR 생쥐를 경추 탈골법으로 희생시킨 후 대퇴골과 경골을 분리하고 1cc 주사기를 이용하여 뼈의 속질을 수세하여 골수세포를 얻었다. 분리된 골수세포는 10% FBS, 항생제, M-CSF (30 ng/ml)가 포함된 α-minimum essential medium (α-MEM)배지 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) 에서 3일간 배양하였다.
이후 적절한 1차 항체 및 2차 항체를 처리하였다. TBS-T 완충용액으로 세척한 PVDF 막은 enhanced chemiluminescence를 이용해 단백질 발현을 관찰하였다.
각각의 세포에서 TRIzol (Invitrogen) 용액으로 제조사의 방법에 따라 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA 1 μg은 oligo dT primer, dNTP, buffer, dithiothreitol, RNase inhibitor와 Superscript II reverse transcriptase를 이용하여 cDNA로 합성하였다.
3일 후, 부착된 세포를 대식세포 (bone marrow macrophage, BMM)로 사용하여 실험하였다. 대식세포는 M-CSF (30 ng/ml)와 RANKL (50 ng/ml)을 첨가하여 배양하고 목향 추출물을 농도별로 처리하였다. 4일 후, 배양한 세포는 TRAP 용액 (Sigma Aldrich, USA)으로 염색하고 붉은색으로 염색된 세포를 파골세포로 간주하여 세포의 수를 count 하였다.
본 연구진은 목향 추출물에 의한 파골세포 분화 억제의 작용기전을 규명하기 위해 RANKL에 의해 전달되는 주요 신호전달체계에 목향 추출물이 미치는 영향을 실험하였다. 대식세포를 목향 추출물로 전 처리 하고 RANKL을 시간별로 처리한 다음 MAPKs의 인산화를 측정하였다. RANKL에 의해 자극된 파골세포에서 p38, JNK, ERK의 증가가 관찰되었으나 목향 추출물 군에서 p38의 발현이 감소하였고 I-κB의 발현이 지속되었다(Fig.
또한 중요한 전사인자 발현에 영향을 미치는 구체적인 억제 기전을 알아보기 위하여 신호 전달 경로로서 mitogen-activated protein kinase (MAPK)인 p38, JNK, ERK, 전사인자인 NF-κB의 활성에 대한 실험을 시행하였다.
1A & 1B). 목향 추출물에 의한 TRAP 양성 파골세포 분화의 억제가 세포독성과 관련 있는지 규명하기 위해 MTT 검사를 실시하였다. 다핵성 파골세포로의 분화를 억제하는 농도의 목향 추출물은 세포의 독성을 나타내지 않았다(Fig.
본 연구진은 천연물질 중 목향 추출물이 파골세포의 분화에 억제 효과를 나타내는지 실험을 통해 확인하였다. 목향의 효과를 검증하기 위해 대식세포에 M-CSF와 RANKL을 첨가하고 목향 추출물을 농도별로 처리하여 4일간 배양하였다. 목향 추출물을 처리하지 않은 대조군은 TRAP 양성 다핵성 파골세포로 분화 되었지만 목향 추출물을 처리한 실험군은 목향 추출물 농도가 증가함에 따라 TRAP 양성 다핵성 파골세포의 분화가 억제되었다(Fig.
단백질은 DC Protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 정량하고 동량의 단백질은 10% SDS-polyacrilamide gel에서 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF 막 (Amersham Biosciences)으로 옮기고 PVDF 막은 비 특이 단백질이 붙는 것을 방지하기 위해 5% non-fat dry milk를 처리하였다. 이후 적절한 1차 항체 및 2차 항체를 처리하였다.
대상 데이터
목향을 물로 추출하여 감압 농축한 후 72시간 동안 동결 건조하여 얻었다. Human RANKL과 M-CSF는 Peprotech (London, UK)사에서 구입하였고, XTT assay kit는 Roche (Indianapolis, IN, USA)사에서 구입하였다. Phospho (p)-JNK, JNK, p-ERK, ERK, p-p38, p38, I-κB 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)사의 제품을 사용하였다.
Phospho (p)-JNK, JNK, p-ERK, ERK, p-p38, p38, I-κB 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)사의 제품을 사용하였다.
Phospho (p)-JNK, JNK, p-ERK, ERK, p-p38, p38, I-κB 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)사의 제품을 사용하였다. c-Fos와 NFATc1 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)사에서 구입하였다.
데이터처리
정량적인 결과는 평균값과 표준편차로 표시하였다. 통계적인 차이는 Student's t-test를 이용하여 분석하였고 p 값이 0.
통계적인 차이는 Student's t-test를 이용하여 분석하였고 p 값이 0.05 이하인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하여 별표(*)로 표시하였다.
성능/효과
본 연구진은 RANKL에 의해 유도되는 여러가지 유전자 발현에 목향 추출물이 미치는 효과를 실험하였다. RANKL로 자극된 파골세포에서 control에서는 c-Fos, NFATc1등의 주요 전사인자의 발현이 증가하였고 TRAP, OSCAR, Cathepsin K의 발현도 증가하였으나 RANKL과 목향 추출물을 처리한 실험군에서는 주요 유전자등의 발현이 억제 되었다(Fig. 2).
RANKL에 의해 자극된 파골세포에서 p38, JNK, ERK의 증가가 관찰되었으나 목향 추출물 군에서 p38의 발현이 감소하였고 I-κB의 발현이 지속되었다(Fig. 4).
따라서 본 연구진은 c-Fos와 NFATc1 단백질 발현에 목향 추출물의 효과를 검증하였다. RANKL을 처리한 후 12시간과 24시간에서 c-Fos의 발현이 유의하게 증가되었으며, NFATc1의 발현은 48시간에 증가되었다. 그러나 목향 추출물을 처리한 실험군에서는 c-Fos와 NFATc1 단백질 발현이 현저히 억제 되었다(Fig.
RANKL을 처리한 후 12시간과 24시간에서 c-Fos의 발현이 유의하게 증가되었으며, NFATc1의 발현은 48시간에 증가되었다. 그러나 목향 추출물을 처리한 실험군에서는 c-Fos와 NFATc1 단백질 발현이 현저히 억제 되었다(Fig. 3).
목향 추출물을 처리하지 않은 대조군은 TRAP 양성 다핵성 파골세포로 분화 되었지만 목향 추출물을 처리한 실험군은 목향 추출물 농도가 증가함에 따라 TRAP 양성 다핵성 파골세포의 분화가 억제되었다(Fig. 1A & 1B).
본 실험에서 목향 추출물이 성숙된 파골세포 표지자인 tartrate resistant-acid phosphatase (TRAP), osteoclast-specific receptor (OSCAR), cathepsin K 발현을 억제하는 전형적인 양상을 보였다. 본 실험에는 포함되지는 않았지만 목향이 파골세포 분화의 단계별 상황에서 미치는 영향을 자세히 알아 보기위해 단핵세포에서 다핵 세포로 융합하는 필수적인 성숙과정에서의 목향 추출물의 영향도 연구해볼 필요성이 있을 것으로 생각된다.
본 실험을 통해 목향 추출물이 현미경적인 소견에서 TRAP 양성인 파골세포의 수를 현저히 감소시켰을 뿐만이 아니라 분화에 중요하다고 알려진 전사인자 c-Fos와 NFATc1의 발현을 억제하는 주요 작용이 있음을 확인하였다. 이는 목향 추출물이 파골세포 분화의 주된 경로를 억제한다는 의미를 지니며 독성 실험을 통하여 세포 독성이 없음도 확인 되었다.
본 실험을 통해 목향 추출물이 현미경적인 소견에서 TRAP 양성인 파골세포의 수를 현저히 감소시켰을 뿐만이 아니라 분화에 중요하다고 알려진 전사인자 c-Fos와 NFATc1의 발현을 억제하는 주요 작용이 있음을 확인하였다. 이는 목향 추출물이 파골세포 분화의 주된 경로를 억제한다는 의미를 지니며 독성 실험을 통하여 세포 독성이 없음도 확인 되었다.
또한 중요한 전사인자 발현에 영향을 미치는 구체적인 억제 기전을 알아보기 위하여 신호 전달 경로로서 mitogen-activated protein kinase (MAPK)인 p38, JNK, ERK, 전사인자인 NF-κB의 활성에 대한 실험을 시행하였다. 주로 JNK와 p38경로의 활성화가 파골세포의 분화와 연관되어 있다고 알려져 있는데 본 실험에서는 JNK와 p38의 인산화가 억제되는 소견은 보이지 않아 목향에 의한 파골세포 분화 억제 작용이 JNK와 p38 경로의 억제로 인함이 아니라는 것을 알게 되었다. 반면 NF-κB의 활성은 파골세포 분화를 촉진하는데 RANKL에 의해 자극된 세포에서 목향 추출물을 첨가하여 IkB의 지속을 통한 NF-κB의 활성을 억제하는 기전을 본 실험을 통해 알 수 있었다.
후속연구
본 실험에서 목향 추출물이 성숙된 파골세포 표지자인 tartrate resistant-acid phosphatase (TRAP), osteoclast-specific receptor (OSCAR), cathepsin K 발현을 억제하는 전형적인 양상을 보였다. 본 실험에는 포함되지는 않았지만 목향이 파골세포 분화의 단계별 상황에서 미치는 영향을 자세히 알아 보기위해 단핵세포에서 다핵 세포로 융합하는 필수적인 성숙과정에서의 목향 추출물의 영향도 연구해볼 필요성이 있을 것으로 생각된다.
천연물인 목향 추출물을 통하여 기존 골다공증 치료제의 한계를 극복하고 부작용 없는 치료 약물로서의 가능성을 실험으로 확인하였다. 특히 파골세포 분화의 핵심적인 신호 전달 체계에 작용하여 골 흡수를 억제할 기전을 제시하는 결과로, 향후 이에 대한 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
목향이란?
목향은 초본 식물인데 나무 같아 보이고 향기가 있어 목향이라 불린다. 목향은 국화과의 식물로서 길이가 1-2 m정도 되며 줄기는 반듯하고 넓은 잎은 타원형이나 장 타원형이고 끝이 톱니처럼 되어있고 날카롭다.
뼈의 골 질환이 야기되는 이유는?
뼈는 지속적으로 조골세포에 의해 생성되고 파골세포에 의해 파괴되는 과정을 겪게 되고 이 과정의 불균형은 골 질환을 야기하게 된다11). 특히 골 파괴의 중요한 역할을 담당하는 파골세 포는 조혈모세포에서 유래되며 전구세포인 단핵구/대식세포의 융합에 의해 다핵형세포로 분화된다.
골다공증을 치료하는 약제 중 bisphosphonate 약물의 기능은?
임상에서 골다공증을 치료하는 여러 약제가 사용되고 있는데 가장 흔하게 사용되는 약제가 bisphosphonate 계열의 약물이다. bisphosphonate 약물의 주된 작용은 파골세포의 작용하는 지점에서 파골세포의 기능을 기계적으로 저해하며 파골세포의 세포사멸을 유도하는 기능이다4). 하지만 최근 고령의 환자에서 하악골 괴사가 발생하는 위험성이 알려져 임상적 사용에 주의가 필요한 상황이다5).
참고문헌 (16)
Kanis, J.A., Oden, A., Johnell, O., De Laet, C., Jonsson, B., Oglesby, A.K. The components of excess mortality after hip fracture. Bone 32: 468, 2003.
Johnell, O. and Kanis, J.A. An estimate of the worldwide prevalence and disability associated with osteoporotic fractures. Osteoporos Int 17: 1726, 2006.
Nishikawa, M., Akatsu, T., Katayama, Y., Yasutomo, Y., Kado, S., Kugal, N., Yamamoto, M., Nagata, N. Bisphosphonates act on osteoblastic cells and inhibit osteoclast formation in mouse marrow cultures. Bone. 18: 9-14, 1996.
Kwak, H.B., Kim, J.H., Kim, D.J., Kwon, Y.M., Oh, J., Kim, Y.K. Effect of water extract of deer antler in osteoclast differentiation. Korean J Oriental Physiology & pathology. 22: 891-895, 2008.
Deriu, A., Zanetti, S., Sechi, L.A., Marongiu, B., Piras, A., Porcedda, S., Tuveri, E. Antimicrobial activity of Inula helenium L. essential oil against Gram-positive and Gram-negative bacteria and Candida spp. Int J Antimicrob Agents. 31(6):588-590, 2008.
Seo, J.Y., Lim, S.S., Kim, J.R., Lim, J.S., Ha, Y.R., Lee, I.A., Kim, E.J., Park, J.H., Kim, J.S. Nrf2-mediated induction of detoxifying enzymes by alantolactone present in Inula helenium. Phytother Res. 22(11):1500-1505, 2008.
Dorn, D.C., Alexenizer, M., Hengstler, J.G., Dorn, A. Tumor cell specific toxicity of Inula helenium extracts. Phytother Res. 20(11):970-980, 2006.
Vestergaard, P., Schwartz, K., Pinholt, E.M., Rejnmark, L., Mosekilde, L. Risk of atrial fibrillation associated with use of bisphosphonates and other drugs against osteoporosis: a cohort study. Calcif Tissue Int. 86(5):335-342, 2010.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.