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문제 정의
- 따라서 본 연구에서 백작약 추출물(PRAE)을 파골세포에 처리하여 TRAP solution assay와 TRAP 염색에 의한 파골세포의 분화와 생성 측정, real-time PCR 분석에 의한 분화인자의 발현확인 그리고 western blot 분석을 통하여 세포내 신호전달 및 전사인자의 발현을 조사하여 PRAE의 파골세포 분화 및 생성에 미치는 영향을 관찰하고 그 결과를 보고한다.
제안 방법
- BMMs 세포를 M-CSF와 RNAKL을 처리하여 파골세포로의 분화를 유도시키고, 다양한 농도(1, 2, 5, 10, 20, 40 ㎍/㎖)의 PRAE를 처리하여 파골세포 분화 및 생성에서의 PRAE 효과를 측정하였다. 파골세포를 TRAP staining하고 현미경으로 관찰한 결과, 처리한 PRAE의 농도가 증가할수록 성체 파골세포인 TRAP(+) MNCs의 수가 감소됨을 관찰하였다(Fig.
- PRAE에 의한 파골세포의 분화 및 생성 억제의 기전을 규명하기 위하여 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 내의 신호전달을 조사하였다. BMMs 세포를 M-CSF 처리하여 24시간 동안 배양한 후 RANKL을 5, 15, 30 분 처리하여 mitogen activated protein kinases (MAPKs, ERK, JNK and p38) 및 IκBα 활성을 유도하였다.
- PRAE의 파골세포에 대한 세포독성의 유무를 확인하기 위하여 M-CSF와 RANKL을 처리한 BMMs 세포에 PRAE를 각각 1, 2, 5, 10, 20, 40 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 2일 동안 배양한 후 세포독성을 측정하였다. 그 결과 PRAE를 처리한 모든 실험군의 cell viability를 PRAE를 처리하지 않은 대조군과 비교했을 때 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 백작약 에탄올 추출물(Paeoniae Radix Alba ethanol extract, PRAE)의 파골세포 분화와 생성에서의 효과를 검증하기 위하여 골수세포로부터 유도된 파골세포 전구세포(BMMs)를 RANKL을 처리하여 파골세포로 분화시키는 과정에 PRAE를 처리하였다. 그 결과 PRAE는 측정한 40 ㎍/㎖의 농도까지 세포독성을 나타내지 않았다.
- 세포독성은 Itsbio사(Korea)의 EZ-Cytox Enhanced Cell Viability Assay Kit를 사용하여 제조자의 지시에 따라 측정하였다. 우선, 배양 분리한 BMMs 세포를 1 × 104 cells/well의 농도가 되도록 희석하고 M-CSF (30 ng/㎖)와 RANKL (100 ng/㎖)을 첨가하여 96 well culture plate (Greiner bio-one, Germany)에 분주한 후, 다양한 농도(1, 2, 5, 10, 20 and 40 ㎍/㎖)의 PRAE를 처리하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 2일 동안 배양하였다. 배양 후 10 ㎕의 EZ-Cytox reagent를 각 well에 첨가해 준 후 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다.
- 배양접시에 부착된 세포를 trypsin으로 분리하고 원심분리 하여 모은 세포를 파골세포 전구세포(bone marrow-derived macrophages, BMMs)로 사용하였다. 파골세포를 생성하기 위하여 BMMs을 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin이 첨가된 MEM-α 배지에 M-CSF (30 ng/㎖)와 RANKL (100 ng/㎖)을 처리한 후 4일 동안 배양하여 파골세포로의 분화를 유도하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 백작약 (Paeoniae Radix Alba)은 2012년 5월 익산시 소재 대학한약국에서 구입하였으며, 형태학적 특징을 통하여 동정하였고, 표본품 (NNMBS-2012-066)은 원광대학교 천연물 신약 표준화연구 소재은행에 보관하였다. 백작약 50 g을 70% 에탄올 수용액 50 ㎖로 70℃에서 2시간 동안 가열추출하고 여과한 후 여액을 감압 농축하여 백작약 추출물 7.
- 본 실험에서는 파골세포를 배양하기 위하여 (주)오리엔트 바이오(성남, 대한민국)로부터 구입한 6∼8 주령의 C57BL/6 male mice의 대퇴골(femur)과 경골(tibia)로 부터 골수세포(bone marrow cells)를 분리하였다. 이 골수세포를 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone, Rockford, IL, USA), 1% Penicillin (100U/㎖)/Streptomycin (100 ㎍/㎖)이 첨가된 Minimum Essential Media Alpha (MEM-α, Hyclone) 배지에서 3일 동안, 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하면서 30 ng/㎖ 농도의 M-CSF을 처리하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 각각의 세 번의 실험으로부터 얻은 mean ± SD로 표시하였으며, 통계분석은 one-way ANOVA test (SPSS 12.0, SPSS GmbH, Germany)로 처리하고, P < 0.05인 것만 유의한 것으로 정하였다.
이론/모형
- 1% SDS)를 이용하여 배양된 세포를 lysis 시키고 원심분리하여 모은 상층액을 전체 세포 단백질(total lysate)로 이용 하였다. 단백질 농도는 Bradford method을 이용하여 측정하였다. 30 ㎍의 total lysate를 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 사용하여 분리하였고, HybondTM-polyvinylidene fluoride membranes (PVDF, GE-Healthcare Life Science, USA)를 사용하여 이동하였다.
- 세포독성은 Itsbio사(Korea)의 EZ-Cytox Enhanced Cell Viability Assay Kit를 사용하여 제조자의 지시에 따라 측정하였다. 우선, 배양 분리한 BMMs 세포를 1 × 104 cells/well의 농도가 되도록 희석하고 M-CSF (30 ng/㎖)와 RANKL (100 ng/㎖)을 첨가하여 96 well culture plate (Greiner bio-one, Germany)에 분주한 후, 다양한 농도(1, 2, 5, 10, 20 and 40 ㎍/㎖)의 PRAE를 처리하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 2일 동안 배양하였다.
성능/효과
- 2). 20 ㎍/㎖의 PRAE를 처리한 결과 MAPKs(ERK, JNK, p38)의 활성은 변하지 않았지만, IκBα의 활성이 억제됨을 확인하였고, c-Fos의 발현양이 감소됨을 확인하였다. 이러한 신호 억제에 의해 최종 NFATc1의 단백질 발현양이 급격히 감소됨을 관찰하였다(Fig.
- 따라서 이후 모든 실험을 20 ㎍/㎖의 PRAE로 수행하였다. PRAE를 처리했을 때 성체 파골세포인 TRAP(+) MNCs의 수가 PRAE의 농도의존적으로 현저하게 감소되었다. 또한 파골세포 분화인자의 발현이 PRAE에 의해 감소됨을 real-time PCR 분석으로 확인하였다.
- 백작약 에탄올 추출물(Paeoniae Radix Alba ethanol extract, PRAE)의 파골세포 분화와 생성에서의 효과를 검증하기 위하여 골수세포로부터 유도된 파골세포 전구세포(BMMs)를 RANKL을 처리하여 파골세포로 분화시키는 과정에 PRAE를 처리하였다. 그 결과 PRAE는 측정한 40 ㎍/㎖의 농도까지 세포독성을 나타내지 않았다. 따라서 이후 모든 실험을 20 ㎍/㎖의 PRAE로 수행하였다.
- 이 결과를 좀 더 검증하기 위하여 실제로 파골세포 분화 및 생성동안 발현양이 증가하는 파골세포 분화인자들(TRAP, CtsK, OSCAR, DC-STAMP, ATP6v0d2, NFATc1)의 발현양을 real-time PCR 분석으로 측정하였다. 그 결과 측정한 모든 파골세포 분화인자들의 발현양이 PRAE를 처리하지 않은 control에 비해 20 ㎍/㎖의 PRAE를 처리한 그룹에서 배양기간에 걸쳐 발현양이 현저히 감소됨이 관찰되었다(Fig. 3).
- 또한 파골세포 분화인자의 발현이 PRAE에 의해 감소됨을 real-time PCR 분석으로 확인하였다. 그리고 PRAE를 처리하였을 때 세포내 신호전달체계 중 IκBα의 활성과 c-Fos의 발현이 감소하였고, 이로 인해 파골세포 분화와 생성에 가장 중추적인 역할을 하는 전사인자인 NFATc1의 발현이 현저히 감소되었다. 따라서 PRAE는 파골세포의 분화와 생성을 억제하는 효과를 보이며, 이상의 결과를 바탕으로 in vivo에서 효과를 확인한다면 골다공증, 류마티스 관절염 그리고 치주염 등 파골세포에 의한 뼈 흡수 현상을 보이는 뼈 질환 치료제의 후보 물질이 될 것으로 사료된다.
- PRAE를 처리했을 때 성체 파골세포인 TRAP(+) MNCs의 수가 PRAE의 농도의존적으로 현저하게 감소되었다. 또한 파골세포 분화인자의 발현이 PRAE에 의해 감소됨을 real-time PCR 분석으로 확인하였다. 그리고 PRAE를 처리하였을 때 세포내 신호전달체계 중 IκBα의 활성과 c-Fos의 발현이 감소하였고, 이로 인해 파골세포 분화와 생성에 가장 중추적인 역할을 하는 전사인자인 NFATc1의 발현이 현저히 감소되었다.
- 그러나 5 ㎍/㎖의 PRAE를 처리한 실험군 부터 현저하게 성체 파골세포의 생성이 감소되었고, 20 ㎍/㎖ PRAE를 처리한 실험군 부터 성체 파골세포가 생성되지 않음을 확인하였다. 또한, TRAP을 발현하는 mono-, di- 그리고 multinuclear cell의 total TRAP 활성을 측정할 수 있는 TRAP solution assay 결과, 파골세포 염색의 결과와 마찬가지로 20과 40㎍/㎖의 PRAE를 처리한 그룹에서 급격히 TRAP 활성이 감소함을 관찰하였다(Fig. 2C).
- 결국 두 가지 신호전달 모두 NFATc1의 활성화로 인해 파골세포의 분화 관련 유전자의 발현이 증가되어 분화가 이루어진다. 본 연구에서 RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화 및 생성에서 백작약 추출물(PRAE)이 억제효과를 보임을 확인하였다(Fig. 2).
- 또한, Yang 등25)이 콜라겐으로 유도한 관절염 백서에서 백작약이 포함된 17개 약제 혼합물인 Sanshuibaihu decoction (SSBH)이 항염증 효과를 보이고 이러한 효과는 NFκB와 p38 MAPK의 활성억제에 기인한다는 결과를 보고하였다. 본 연구에서는 PRAE에 의해 파골세포의 분화 억제가 IκBα 활성 억제에 일부 기인함을 보였다(Fig. 4).
- 특히 파골세포 분화와 생성의 모든 단계에서 가장 중요한 역할을 하는 전사인자인 NFATc1의 발현도 PRAE에 의해 감소되었다. 이 결과들은 PRAE가 파골세포 분화인자 및 전사인자의 발현을 감소시킴으로써 파골세포 분화 및 생성을 억제한다는 것을 보여준다.
- 2C). 이러한 결과들은 PRAE가 파골세포의 분화 뿐 아니라 생성에서도 억제 효과를 보인다는 것을 보여준다.
- 그러나 PRAE를 처리했을 때는 2일 후 조금 증가하였다가 점점 감소하는 경향을 보였다. 이상의 결과들은 PRAE가 RANKL에 의한 파골세포 분화과정에서 IκBα 인산화와 c-Fos의 발현을 억제시킴으로써 NFATc1의 발현을 감소시킴을 보여준다. 이에 따라 NFATc1의 조절을 받는 많은 유전자들의 전사가 억제되어 파골세포의 분화와 생성이 감소되었다.
- BMMs 세포를 M-CSF와 RNAKL을 처리하여 파골세포로의 분화를 유도시키고, 다양한 농도(1, 2, 5, 10, 20, 40 ㎍/㎖)의 PRAE를 처리하여 파골세포 분화 및 생성에서의 PRAE 효과를 측정하였다. 파골세포를 TRAP staining하고 현미경으로 관찰한 결과, 처리한 PRAE의 농도가 증가할수록 성체 파골세포인 TRAP(+) MNCs의 수가 감소됨을 관찰하였다(Fig. 2A and 2B).
후속연구
- 또한 in vitro 실험과 in vivo 실험 사이에 차이가 많이 발생할 수 있는데, PRAE를 사용한 본 실험도 생쥐를 이용하여 in vivo에서 파골세포 및 조골세포에 대한 효과 및 뼈 밀도에 얼마나 영향을 주는지에 대한 연구가 이루어져야 할 것이다. 그러나 이상의 결과들을 종합해 볼 때 PRAE가 골다공증, 류마티스 관절염, 골관절염 및 치주염 등 뼈 관련 질환들의 치료에 효과적인 후보물질이 될 수 있을 것이라 사료된다. 본 연구에서는 파골세포의 분화와 생성에서 PRAE의 억제효과를 in vitro에서 확인하고 그 억제 기전을 보고하였다.
- 본 연구에서는 파골세포의 분화와 생성에서 PRAE의 억제효과를 in vitro에서 확인하고 그 억제 기전을 보고하였다. 다음으로 조골세포 분화에서의 PRAE 효과를 연구하고, 또한 동물모델을 이용한 in vivo 실험에서 그 효과를 증명하는 연구가 필요하다고 사료된다.
- 그리고 PRAE를 처리하였을 때 세포내 신호전달체계 중 IκBα의 활성과 c-Fos의 발현이 감소하였고, 이로 인해 파골세포 분화와 생성에 가장 중추적인 역할을 하는 전사인자인 NFATc1의 발현이 현저히 감소되었다. 따라서 PRAE는 파골세포의 분화와 생성을 억제하는 효과를 보이며, 이상의 결과를 바탕으로 in vivo에서 효과를 확인한다면 골다공증, 류마티스 관절염 그리고 치주염 등 파골세포에 의한 뼈 흡수 현상을 보이는 뼈 질환 치료제의 후보 물질이 될 것으로 사료된다.
- 실제로 백작약을 탕약으로 사용할 때 추출되는 유효성분은 물에 의해 추출되는 것이다. 따라서 물 추출물과 에탄올 추출물의 유효성분 비교 및 뼈대사(bone metabolism)에 미치는 차이에 대한 연구가 필요하다고 사료된다. 또한 in vitro 실험과 in vivo 실험 사이에 차이가 많이 발생할 수 있는데, PRAE를 사용한 본 실험도 생쥐를 이용하여 in vivo에서 파골세포 및 조골세포에 대한 효과 및 뼈 밀도에 얼마나 영향을 주는지에 대한 연구가 이루어져야 할 것이다.
- 따라서 물 추출물과 에탄올 추출물의 유효성분 비교 및 뼈대사(bone metabolism)에 미치는 차이에 대한 연구가 필요하다고 사료된다. 또한 in vitro 실험과 in vivo 실험 사이에 차이가 많이 발생할 수 있는데, PRAE를 사용한 본 실험도 생쥐를 이용하여 in vivo에서 파골세포 및 조골세포에 대한 효과 및 뼈 밀도에 얼마나 영향을 주는지에 대한 연구가 이루어져야 할 것이다. 그러나 이상의 결과들을 종합해 볼 때 PRAE가 골다공증, 류마티스 관절염, 골관절염 및 치주염 등 뼈 관련 질환들의 치료에 효과적인 후보물질이 될 수 있을 것이라 사료된다.
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