[논문]RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화에 대한 시금치 추출물의 영향

김동규; 김미혜; 강민정; 신정혜

doi:10.3746/jkfn.2015.44.4.532

RANKL에 의해 유도되는 파골세포 분화에 대한 시금치 추출물의 영향
Effect of Spinach Extract on RANKL-Mediated Osteoclast Differentiation 원문보기

한국식품영양과학회지 = Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, v.44 no.4, 2015년, pp.532 - 539

김동규 ((재)남해마늘연구소) , 김미혜 ((재)남해마늘연구소) , 강민정 ((재)남해마늘연구소) , 신정혜 ((재)남해마늘연구소)

초록
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파골세포의 분화에 대한 시금치 추출물의 영향을 확인하고자 RANKL을 처리한 RAW264.7 세포에서 세포독성, TRAP(+) 다핵세포의 형성, 파골세포 분화 관련 유전자의 발현, 그리고 단백질 발현을 확인하였다. 물과 25, 50, 75 및 100% 에탄올 시금치 추출물의 세포독성을 측정한 결과 모든 추출물들이 $100{\mu}g/mL$ 이하의 농도에서 RAW264.7 세포에 독성을 유발하지 않았다. TRAP 염색을 통해 TRAP(+) 다핵세포의 수와 효소 활성을 측정한 결과 물 추출물을 제외한 모든 추출물이 대조군에 비해 분화 억제 및 효소 활성 저해 효과가 있었다. 특히 $100{\mu}g/mL$ 농도의 100% 에탄올 추출물은 RANKL만 처리한 대조군과 비교해 80%의 유의한 TRAP(+) 다핵세포 숫자 감소와 44%의 TRAP 효소 활성 저해율을 보였다. 시금치 에탄올 추출물은 RANKL에 의한 파골세포 분화의 지표가 되는 관련유전자인 NFAT, c-FOS, cathepsin K 및 TRAP의 발현을 억제하였다. 또한 단백질 수준에서 시금치 에탄올 추출물은 RANKL에 의해 증가된 NFATc1의 발현을 현저히 감소시키는 것으로 확인되었고, 또한 c-FOS의 활성화 형태인 인산화된 c-FOS의 발현뿐만 아니라 인산화되지 않은 비활성의 c-FOS 발현도 감소시켰다. 반면 파골세포의 분화에 직간접적인 영향을 미친다고 알려진 MAPK 중 ERK의 활성에는 거의 영향을 미치지 않는 것으로 보아 시금치 에탄올 추출물은 c-FOS의 활성, 비활성형 전체를 감소시킴으로 파골세포 분화를 감소시키는 것으로 확인되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Inhibition of osteoclast differentiation is the most important target for prevention of inflammatory bone resorption and bone diseases. Here, we investigated the effect of spinach ethanol extract on osteoclast differentiation in RAW264.7 cells. Spinach was extracted with ethanol at a concentration ranging from 0 to 100% (0, 25, 50, 75, and 100% ethanol). Inhibitory effects of receptor activator of NF-${\kappa}B$ ligan (RANKL)-induced osteoclast differentiation were evaluated using tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) stain assay. The most effective eanol concentration for osteoclast differentiation was 100%. Spinach extract (100% ethanol) suppressed RANKL-induced osteoclast differentiation and TRAP activity. Spinach extract (100% ethanol) also suppressed expression of osteoclast differentiation-related marker genes (NFATc1, c-FOS, cathepsin K, and TRAP) and down-regulated RANKL-induced NF-${\kappa}B$ and ERK phosphorylation during osteoclast differentiation. Taken together, our results suggest that spinach extract is effective against reducing osteoclast differentiation through the NF-${\kappa}B$-mediated pathway.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

시금치의 뼈 건강과 관련한연구는 시금치 자체에 함유되어 있는 칼슘이나 철분과 같은미네랄 성분과 더불어 다른 유효성분들도 영향을 미치므로이와 관련한 기작을 밝히는 연구도 다양하게 추진되어야 한다. 본 연구에서는 이러한 연구의 일환으로 시금치 추출물이파골세포의 분화 억제 효능을 가진다는 것을 몇 가지 실험방법을 통해 검증하고, 이러한 연구결과를 토대로 시금치가뼈 건강에 미치는 영향을 확인하기 위한 기초자료를 얻고자하였다.

제안 방법

100% 에탄올 추출물이 파골세포 분화 저해 활성이 있음을 확인하였기에 이후 실험은 시금치 100% 에탄올 추출물을 농도별로 처리하여 TRAP(+) 다핵세포 형성 및 효소 활성을 측정하였다. RANKL과 함께 시금치 100% 에탄올 추출물을 25, 50, 75 그리고 100 ug/mL로 각각 처리하여 7일간 배양한 결과는 Fig.
배양이 끝난세포는 protease inhibitor와 phenylmethane-sulfonyl fluoride를 첨가한 radioimmunoprecipitation assay 완중액으로 용해하고 13, 000 rpm, 4℃에서 20분간 원심 분리하여 얻은 상층액을 단백질 시료로 삼았다. Lysate 중의 단백질은 BCA protein assay kit(Pierce, Rockford, IL, USA) 을 이용하여 albumin 검량곡선에 대입하여 정량하였고 30 ug의 시료를 SDS-PAGE로 분리하여 PVDF막에 옮긴 후 특정 항체를 이용하여 반응시키고 이미지장비(Ez-Capture Ⅱ, ATTO, Tokyo, Japan)를 통해 단백질 밴드를 관찰하였다.
RANKLe 파골세포 분화단계의 주요 전사인자인 NFATcl 의 분화를 유도하므로 시금치 100% 에탄올 추출물이 RANKL에 유도된 NFATc1과 c-FOS에 미치는 영향을 RT-PCR로 관찰하였다. 그리고 파골세포가 분화하여 기능할 때 발현되는 효소인 TRAP와 cathepsin K의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR로 관찰하였다.
RANKL과 함께 시금치 추출물들을 처리한 후 2일에 한번씩 배지를 교환하며 7일째에 이미지 데이터를 얻어 파골세포의 분화를 확인하였다(Fig. 2A). Positive controls 사용된 RANKL 처리 세포군에서는 3개 이상의 핵을 가지는 TRAP(+) 다핵세포로 분화가 유도되었고, RANKL 과 시금치 에탄올 추출물을 처리한 세포군에서는 추출용매의 에탄올 비율이 증가할수록 파골세포로의 분화가 억제되었다.
RANKL에 의한 신호전달과정을 관찰하기 위해 RAW 264.7 세포를 6-well plate에 well당 5X105개가 되도록분주하고 10% FBS가 포함된 DMEM(Gibco BRL)을 배양액으로 6시간 배양한 다음, 10% FBS를 포함하는 a-MEM 에 0, 50, 100 ug/mL 농도로 희석한 시금치 에탄올 추출물과 50 ng/mL의 RANKL을 24시간 처리하였다. 배양이 끝난세포는 protease inhibitor와 phenylmethane-sulfonyl fluoride를 첨가한 radioimmunoprecipitation assay 완중액으로 용해하고 13, 000 rpm, 4℃에서 20분간 원심 분리하여 얻은 상층액을 단백질 시료로 삼았다.
7(KCLB)을 파골전구세포로 하여 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 DMEM(Gibco BRL)을 배양액으로 5% CO₂incubator 를 이용하여 37℃에서 계대 배양하면서 실험에 사용하였다. RAW264.7 세포를 culture용 well plate에 적정 수량을 분주한 후 4~6시간 배양하여 세포가 well에 부착되면 배지를제거하고 10% FBS가 첨가된 a-MEM 배지에 분화인자인 RANKL 50 ng/mL와 남해 용매별 시금치 추출물을 0, 50, 100 ug/mL 농도가 되도록 혼합한 배양액을 분주하여 2일에한 번씩 배지를 교환하면서 4일 또는 7일간 배양하였다.
이후 column wash solution과 RNA wash solution으로 column 을 세척하고 최종적으로 nuclease free water를 첨가하여원심 분리를 실시해 total RNA 샘플을 획득하였다. RNA의정량을 위해서 QuantiFlour RNA system(Promega Corp.) 을 이용하였고, 분리된 RNA로부터 1 ug을 취해 GoScript reverse transcription system을 이용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA는 Table 2에서 나타낸 primer를 이용하여 PCR 하였다.
Spinach extract down-regulated the expression of osteoclast-specific genes. RT-PCR analysis to measure the gene expression of NFATc1 (A), c-FOS (B), cathepsin K (C), and TRAP (D). Each bar represents the mean±SD of three repeated experiments.
관찰하였다. 그리고 파골세포가 분화하여 기능할 때 발현되는 효소인 TRAP와 cathepsin K의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR로 관찰하였다. 실험을 위해서 배양된 각각의 세포에서 ReliaPrep RNA Cell Miniprep System kit (Promega Corp.
분화되어 생성이 가능하다(5). 본 실험에 앞서 시금치추출물과 RANKL의 세포 내 처리가 세포 독성을 유발하는지 확인하기 위해 RAW264.7 세포에 50 ng/mL RANKL과 50 ug/mL 및 100 ug/mL의 시금치 추출물을 처리하여 7일간 배양한 후 MTT 방법으로 세포독성을 평가하였다. 실험결과 시금치 물 추출물과 25~100% 에탄올 추출물을 처리한 세포 모두에서 세포 독성을 유발하지 않았다(Fig.
시금치 동결건조 분말에 물, 에탄올 및 이들을 비율별로혼합(75:25, 50:50, 25:75)한 용매를 각각 20배(w/v)씩 첨가 후 상온에서 30분간 2회 진탕 추출하였다. 추출액을 여과지(Whatman No 2, Whatman International Ltd.
시금치 추출물이 파골세포 분화에 미치는 영향을 평가하기 위해서 TRAP 염색을 실시하였다. TRAP 염색을 하게되면 RANKL 처리를 하지 않은 대조군은 RAW264.
그리고 파골세포가 분화하여 기능할 때 발현되는 효소인 TRAP와 cathepsin K의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR로 관찰하였다. 실험을 위해서 배양된 각각의 세포에서 ReliaPrep RNA Cell Miniprep System kit (Promega Corp., Madison, WI, USA)을 이용하여 total RNA를 분리하였다. 1-Thioglycer이을 포함하는 BL buf- fer를 plate에 첨가하여 회수한 cell lysate를 mini-column 에 옮긴 뒤 14, 000xg게서 30초간 원심 분리하여 column에흡착시킨 다음 DNase와 MnCb 혼합액을 column에 첨가하여 15분간 incubation 함으로써 DNA를 제거하였다.
)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 시료를 포함하는 배지를 제거한 후 serum-free 배지와 5 mg/ mL MTT 용액을 첨가하여 37℃에서 2시간 더 배양하고 DMSO를 분주하여 sonication 하고 10분간 교반하여 용출시킨 뒤 570 nm에서 흡광도를 측정해 세포생존율을 구하였다. 세포생존율은 LPS 처리군에 대한 백분율로 나타내었다.
합성된 cDNA는 Table 2에서 나타낸 primer를 이용하여 PCR 하였다. 증폭된 cDNA는 1% agarose gel에서분리하였고 gene stain detection solution을 이용하여 이미지 장비(E-Graph, ATTO, Tokyo, Japan)로 관찰하였다.
파골세포의 분화에 대한 시금치 추출물의 영향을 확인하고자 RANKL을 처리한 RAW264.7 세포에서 세포독성, TRAP(+) 다핵세포의 형성, 파골세포 분화 관련 유전자의 발현, 그리고 단백질 발현을 확인하였다. 물과 25, 50, 75 및 100 % 에탄올 시금치 추출물의 세포독성을 측정한 결과 모든추출물들이 100 ug/mL 이하의 농도에서 RAW264.
유전자 발현을 유도한다(18). 파골세포의 운명에 주요인자로 알려진 NFATc1, c-Fos 그리고 cathepsin K의발현을 확인하기 위해 RT-PCR을 수행하였고, 각각의 발현량을 정 량하기 위하여 housekeeping gene으로 hypoxanthine phosphoribosyltransferase(HPRT)의 발현을 확인하였다. HPRT genee 다른 여타 housekeeping gene에비해 경제적이고 정확하다고 알려져 있다(30).

대상 데이터

건조하였다. 동결 건조된 시금치는 분쇄기(HMF-3450S, Hanil, Seoul, Korea)로 분쇄한 후 60 mesh 표준망체로체질하여 추출물 제조용 시료로 사용하였다.
마우스 유래 대식세포주 RAW264.7(KCLB)을 파골전구세포로 하여 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 DMEM(Gibco BRL)을 배양액으로 5% CO₂incubator 를 이용하여 37℃에서 계대 배양하면서 실험에 사용하였다. RAW264.
시금치는 경남 남해군에서 노지 재배된 것을 취하여 흐르는 물로 세척한 후 자연 건조한 다음 뿌리부분을 제거하고동결 건조하였다. 동결 건조된 시금치는 분쇄기(HMF-3450S, Hanil, Seoul, Korea)로 분쇄한 후 60 mesh 표준망체로체질하여 추출물 제조용 시료로 사용하였다.
실험에 사용된 마우스의 대식세포주인 RAW264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받았으며, 세포 배양을 위해 10% fetal bovine serum(FBS)과 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's media(DMEM; Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)를 사용하여 CO₂incubator(37℃, 5% CO₂)에서배양하였다. 시금치 추출물의 세포에 대한 독성 측정은 3- (4, 5-dimethylthiazole-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 환원방법을 이용하여 측정하였다.
1-Thioglycer이을 포함하는 BL buf- fer를 plate에 첨가하여 회수한 cell lysate를 mini-column 에 옮긴 뒤 14, 000xg게서 30초간 원심 분리하여 column에흡착시킨 다음 DNase와 MnCb 혼합액을 column에 첨가하여 15분간 incubation 함으로써 DNA를 제거하였다. 이후 column wash solution과 RNA wash solution으로 column 을 세척하고 최종적으로 nuclease free water를 첨가하여원심 분리를 실시해 total RNA 샘플을 획득하였다. RNA의정량을 위해서 QuantiFlour RNA system(Promega Corp.

데이터처리

각각의 실험군은 3개 이상 수행하였고 결과 값은 SPSS 12.0 package(SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램을사용하여 평균값과 표준편차를 계산하였다. 모든 실험은 3 회 이상 반복하여 동일한 실험결과를 얻은 경우 실험 결과로 사용하였다.
모든 실험은 3 회 이상 반복하여 동일한 실험결과를 얻은 경우 실험 결과로 사용하였다. 결과의 통계는 Student's t-test를 이용하여분석하였고 ? 값이 0.05 이하인 경우 통계적으로 유의한것으로 간주하였다.

이론/모형

이 NFATc1은 다른 파골세포 분화에중요한 단백질의 발현을 조절하는데 이때 MAPK 중 ERK의활성이 파골세포 분화에 기여한다고 보고된 바 있고, 더욱이 ERK는 분화뿐만 아니라 파골세포의 생존에도 관여함이 알려져 있다(31-33). RANKL에 의해 유도되는 NFATc1과 c-FOS 단백질의 유도형 및 c-FOS의 활성형에 대한 시금치 100% 에탄올 추출물의 영향을 western blot법으로 확인하였다. 그 결과 유전자 수준에서의 분석 결과와 일치하는 경향으로 RANKL을 처리하지 않은 무처리 대조군에서도 en- dogenous한 NFATc1 단백질의 발현이 확인되었다.
7 세포는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받았으며, 세포 배양을 위해 10% fetal bovine serum(FBS)과 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's media(DMEM; Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)를 사용하여 CO₂incubator(37℃, 5% CO₂)에서배양하였다. 시금치 추출물의 세포에 대한 독성 측정은 3- (4, 5-dimethylthiazole-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 환원방법을 이용하여 측정하였다. 세포를 96 well-plate에 well당 5X104개가 되도록 분주하고 24시간 부착시킨 후, 완전 건조된 용매별 시금치 추출물을 dimethyl sulfoxide(DMSO; Sigma-Aldrich Co.

성능/효과

25%, 50% 및 75% 에탄올 추출물처리군에서 TRAP(+) 다핵세포 숫자는 각각 RANKL 단독 처리군 대비 31%, 42% 및 60%로 유의성 있게 억제되었으며, 100% 에탄올 추출물에서 대조군에 비해 파골세포 분화가 90% 이상 억제되었다. 반면 시금치 물 추출물은 RANKL 처리군과 유사한 수준의파골세포 생성을 보여 분화 억제 활성을 나타내지 않았다 (Fig.
2A). Positive controls 사용된 RANKL 처리 세포군에서는 3개 이상의 핵을 가지는 TRAP(+) 다핵세포로 분화가 유도되었고, RANKL 과 시금치 에탄올 추출물을 처리한 세포군에서는 추출용매의 에탄올 비율이 증가할수록 파골세포로의 분화가 억제되었다.
RAW264.7 세포에 RANKL을 처리했을 때 c-Fos, NFATc1, TRAP mRNA 발현이 증가되었지만 시금치 100% 에탄올 추출물을 처리한 세포군에서는 RANKL에 의해 증가된 NFATc1과 c-FOS 유전자 발현의 증가가 감소되었다 (Fig. 4). 또한 시금치 100% 에탄올 추출물은 RANKL에 의해 발현이 증가된 cathepsin K와 TRAP 유전자의 발현도유의적으로 감소시켰다.
7 세포에 독성을 유발하지 않았다. TRAP 염색을 통해 TRAP(+) 다핵세포의 수와 효소 활성을 측정한 결과 물 추출물을 제외한 모든 추출물이 대조군에 비해 분화 억제 및 효소 활성저해 효과가 있었다. 특히 100 ug/mL 농도의 100% 에탄올추출물은 RANKL만 처리한 대조군과 비교해 80%의 유의한 TRAP(+) 다핵세포 숫자 감소와 44%의 TRAP 효소 활성저해율을 보였다.
무처리 세포군에 비해 RANKL 처리군에서는 파골세포 분화지표인 TRAP(+) 반응의 파골세포들이 짙은 색으로 염색되었다. 광학 현미경을통해 융합되어 다핵을 지닌 파골세포의 형성을 확인한 결과 25~100 ug/mL 농도의 시금치 100% 에탄올 추출물 처리시 분화를 억제하여 TRAP(+) 반응 특유의 짙은 색을 띠는세포의 수가 현저히 감소되었다. 또한 TRAP(+) 다핵세포수를 계수한 결과 RANKL 처리에 의한 TRAP(+) 다핵세포숫자 대비 25~100 ug/mL의 농도별 시금치 100% 에탄올추출물은 파골세포 형성을 80% 이상 유의하게 감소시켰다 (Fig.
RANKL에 의해 유도되는 NFATc1과 c-FOS 단백질의 유도형 및 c-FOS의 활성형에 대한 시금치 100% 에탄올 추출물의 영향을 western blot법으로 확인하였다. 그 결과 유전자 수준에서의 분석 결과와 일치하는 경향으로 RANKL을 처리하지 않은 무처리 대조군에서도 en- dogenous한 NFATc1 단백질의 발현이 확인되었다. 더욱이 RANKL 처리에 의해 NFATc1의 양이 일부 증가되는 양상을 나타내었으나 100 Ug/mL 농도의 시금치 100% 에탄올추출물에 의해 NFATc1의 발현 감소가 유도되었다(Fig.
그 결과 유전자 수준에서의 분석 결과와 일치하는 경향으로 RANKL을 처리하지 않은 무처리 대조군에서도 en- dogenous한 NFATc1 단백질의 발현이 확인되었다. 더욱이 RANKL 처리에 의해 NFATc1의 양이 일부 증가되는 양상을 나타내었으나 100 Ug/mL 농도의 시금치 100% 에탄올추출물에 의해 NFATc1의 발현 감소가 유도되었다(Fig. 5A). 또 다른 분화에 중요한 전사인자인 c-FOS의 발현 역시 RANKL에 의해 현저하게 증가하였고, 시금치 100% 에탄올 추출물은 RANKL에 의한 c-FOS의 발현 증가를 무처리 대조군의 c-FOS 유도형과 활성형 수준으로 현저하게감소시켰다(Fig.
5A). 또 다른 분화에 중요한 전사인자인 c-FOS의 발현 역시 RANKL에 의해 현저하게 증가하였고, 시금치 100% 에탄올 추출물은 RANKL에 의한 c-FOS의 발현 증가를 무처리 대조군의 c-FOS 유도형과 활성형 수준으로 현저하게감소시켰다(Fig. 5B, D). 분화 신호를 전달하는 시그널 단백질 중 하나인 ERK의 불활성형에 대해서는 영향을 미치지않았으나 활성형의 발현은 감소시키는 것을 확인하였다 (Fig.
광학 현미경을통해 융합되어 다핵을 지닌 파골세포의 형성을 확인한 결과 25~100 ug/mL 농도의 시금치 100% 에탄올 추출물 처리시 분화를 억제하여 TRAP(+) 반응 특유의 짙은 색을 띠는세포의 수가 현저히 감소되었다. 또한 TRAP(+) 다핵세포수를 계수한 결과 RANKL 처리에 의한 TRAP(+) 다핵세포숫자 대비 25~100 ug/mL의 농도별 시금치 100% 에탄올추출물은 파골세포 형성을 80% 이상 유의하게 감소시켰다 (Fig. 3B).
시금치 에탄올 추출물은 RANKL에 의한파골세포 분화의 지표가 되는 관련유전자인 NFAT, c-FOS, cathepsin K 및 TRAP의 발현을 억제하였다. 또한 단백질수준에서 시금치 에탄올 추출물은 RANKL에 의해 증가된 NFATc1의 발현을 현저히 감소시키는 것으로 확인되었고, 또한 c-FOS의 활성화 형태인 인산화된 c-FOS의 발현뿐만아니라 인산화되지 않은 비활성의 c-FOS 발현도 감소시켰다. 반면 파골세포의 분화에 직간접적인 영향을 미친다고알려진 MAPK 중 ERK의 활성에는 거의 영향을 미치지 않는것으로 보아 시금치 에탄올 추출물은 c-FOS의 활성, 비활성형 전체를 감소시킴으로 파골세포 분화를 감소시키는 것으로 확인되었다.
4). 또한 시금치 100% 에탄올 추출물은 RANKL에 의해 발현이 증가된 cathepsin K와 TRAP 유전자의 발현도유의적으로 감소시켰다.
3A와 같다. 무처리 세포군에 비해 RANKL 처리군에서는 파골세포 분화지표인 TRAP(+) 반응의 파골세포들이 짙은 색으로 염색되었다. 광학 현미경을통해 융합되어 다핵을 지닌 파골세포의 형성을 확인한 결과 25~100 ug/mL 농도의 시금치 100% 에탄올 추출물 처리시 분화를 억제하여 TRAP(+) 반응 특유의 짙은 색을 띠는세포의 수가 현저히 감소되었다.
7 세포에서 세포독성, TRAP(+) 다핵세포의 형성, 파골세포 분화 관련 유전자의 발현, 그리고 단백질 발현을 확인하였다. 물과 25, 50, 75 및 100 % 에탄올 시금치 추출물의 세포독성을 측정한 결과 모든추출물들이 100 ug/mL 이하의 농도에서 RAW264.7 세포에 독성을 유발하지 않았다. TRAP 염색을 통해 TRAP(+) 다핵세포의 수와 효소 활성을 측정한 결과 물 추출물을 제외한 모든 추출물이 대조군에 비해 분화 억제 및 효소 활성저해 효과가 있었다.
또한 단백질수준에서 시금치 에탄올 추출물은 RANKL에 의해 증가된 NFATc1의 발현을 현저히 감소시키는 것으로 확인되었고, 또한 c-FOS의 활성화 형태인 인산화된 c-FOS의 발현뿐만아니라 인산화되지 않은 비활성의 c-FOS 발현도 감소시켰다. 반면 파골세포의 분화에 직간접적인 영향을 미친다고알려진 MAPK 중 ERK의 활성에는 거의 영향을 미치지 않는것으로 보아 시금치 에탄올 추출물은 c-FOS의 활성, 비활성형 전체를 감소시킴으로 파골세포 분화를 감소시키는 것으로 확인되었다.
5B, D). 분화 신호를 전달하는 시그널 단백질 중 하나인 ERK의 불활성형에 대해서는 영향을 미치지않았으나 활성형의 발현은 감소시키는 것을 확인하였다 (Fig. 5C, D). 시금치 100% 에탄올 추출물은 ERK의 발현에대한 저해 효과가 낮은 수준이었으나, 파골세포 분화에 필수적인 전사인자 c-FOS의 유도형과 활성형의 발현을 저해함으로써 파골세포 분화의 신호전달과정을 억제하는 것으로추정된다.
5C, D). 시금치 100% 에탄올 추출물은 ERK의 발현에대한 저해 효과가 낮은 수준이었으나, 파골세포 분화에 필수적인 전사인자 c-FOS의 유도형과 활성형의 발현을 저해함으로써 파골세포 분화의 신호전달과정을 억제하는 것으로추정된다.
특히 100 ug/mL 농도의 100% 에탄올추출물은 RANKL만 처리한 대조군과 비교해 80%의 유의한 TRAP(+) 다핵세포 숫자 감소와 44%의 TRAP 효소 활성저해율을 보였다. 시금치 에탄올 추출물은 RANKL에 의한파골세포 분화의 지표가 되는 관련유전자인 NFAT, c-FOS, cathepsin K 및 TRAP의 발현을 억제하였다. 또한 단백질수준에서 시금치 에탄올 추출물은 RANKL에 의해 증가된 NFATc1의 발현을 현저히 감소시키는 것으로 확인되었고, 또한 c-FOS의 활성화 형태인 인산화된 c-FOS의 발현뿐만아니라 인산화되지 않은 비활성의 c-FOS 발현도 감소시켰다.
7 세포에 50 ng/mL RANKL과 50 ug/mL 및 100 ug/mL의 시금치 추출물을 처리하여 7일간 배양한 후 MTT 방법으로 세포독성을 평가하였다. 실험결과 시금치 물 추출물과 25~100% 에탄올 추출물을 처리한 세포 모두에서 세포 독성을 유발하지 않았다(Fig. 1).
2B). 이러한 결과를 통해 시금치 에탄올 추출물이 파골세포의 분화를 억제하는 역할을 수행함을 확인하였으며, 100% 에탄올 추출물이 가장 높은 파골세포의 분화 저해 효과가 있는 것을 확인하였다.
3C). 이러한 실험결과를 통해 시금치 에탄올 추출물이 농도의존적으로 TRAP(+) 다핵세포의 수뿐만 아니라 TRAP 효소 활성을 감소시켜 파골세포의 분화를 저해함을 검증하였다.
때 분비가 증가한다고 알려져 있다(8). 이를 이용하여 파골분화 정도를 측정한 결과 5, 10, 25 ug/mL 농도의 시금치 100% 에탄올 추출물 처리 시에는 효소 활성의 저해가 나타나지 않은 반면, 50과 100 ug/mL 농도에서는 각각 38%와 44%의 유의한 TRAP 효소 억제 활성을 나타내었다(Fig. 3C). 이러한 실험결과를 통해 시금치 에탄올 추출물이 농도의존적으로 TRAP(+) 다핵세포의 수뿐만 아니라 TRAP 효소 활성을 감소시켜 파골세포의 분화를 저해함을 검증하였다.
TRAP 염색을 통해 TRAP(+) 다핵세포의 수와 효소 활성을 측정한 결과 물 추출물을 제외한 모든 추출물이 대조군에 비해 분화 억제 및 효소 활성저해 효과가 있었다. 특히 100 ug/mL 농도의 100% 에탄올추출물은 RANKL만 처리한 대조군과 비교해 80%의 유의한 TRAP(+) 다핵세포 숫자 감소와 44%의 TRAP 효소 활성저해율을 보였다. 시금치 에탄올 추출물은 RANKL에 의한파골세포 분화의 지표가 되는 관련유전자인 NFAT, c-FOS, cathepsin K 및 TRAP의 발현을 억제하였다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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