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문제 정의
- 우엉의 기능성 연구는 Ryu 등(1986)의 돌연변이원성 억제효과와 Park 등(1992)이 돌연변이 유발 억제 및 위암세포의 성장 저해효과를 발표한 이후 거의 보고되지 않았고, 우엉 새싹채소의 기능성(Lee 등 2009) 등이 최근 발표되고 있다. 따라서 본 연구에서는 한국에서 재배된 우엉(뿌리)의 항산화활성을 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH) 라디칼 소거효과, 지질과산화 억제효과 및 malondialdehyde(MDA)-bovine serum albumin(BSA) conjugation 억제효과를 통해 살펴보고, Ames test를 이용하여 돌연변이 유발 억제효과를 검토하고자 한다.
제안 방법
- 냉각된 용액에 n-butanol 1,120 ㎕를 가하고 잘 섞은 다음 250×g로 20분 동안 원심분리하여(Hanil, Union 5KR) butanol 층을 취하여 535 nm에서 흡광도를 측정(Molecular Devices, SpectraMAX 340pc)하였다. Fe2+에 의해 유도된 linoleic acid의 과산화물을 TBA로 발색시킨 것을 100%로 가정하였을 때, 우엉 에탄올 추출물을 첨가하여 과산화물을 50%로 감소시킬 수 있는 농도(IC50)를 구하고, 저해율(%)을 산출하였다.
- 5 mM histidine/biotin 용액을 100 ㎖당 10 ㎖ 첨가한 45℃ 정도의 top agar를 2 ㎖씩 각 시험관에 붓고 3초간 vortex한 후 minimal glucose agar plate에 부어 고루 퍼지게 한 후 굳게 하였다. 그 다음 37℃ incubator(Vision scientific CO., VS-1203P3) 에서 48시간 배양한 후 각각의 복귀돌연변이 균총(revertant colonies)을 계수하였고, 돌연변이 억제율(inhibition rate, %)을 구하였다.
- 냉각된 용액에 n-butanol 1,120 ㎕를 가하고 잘 섞은 다음 250×g로 20분 동안 원심분리하여(Hanil, Union 5KR) butanol 층을 취하여 535 nm에서 흡광도를 측정(Molecular Devices, SpectraMAX 340pc)하였다.
- DMSO에 녹여 농도별로 희석한 시료 10 ㎕에 200 μM DPPH/ethanol 190 ㎕를 가한 후, 37℃에서 30분 동안 반응시킨 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다(Molecular Devices, SpectraMAX 340pc). 대조구(DMSO 10 ㎕)의 흡광도에 대해 시료를 넣었을 때의 흡광도의 감소 정도를 측정하여 DPPH 라디칼을 50% 소거하는 시료의 농도(IC50)를 구하고, 저해율(inhibition rate, %)을 계산하였다.
- Ames의 방법에 의한 항돌연변이 유발실험을 위한 배지 및시약의 조제는 Maron & Ames(1983)의 방법에 따라 행하였으며 Matsushima 등의 방법(Norphth & Garner 1980)에 따라 실험을 행하였다. 모든 실험은 ice bath상에서 행하였고 중복 실험하였다. 대사활성 물질이 필요한 간접돌연변이 물질을 사용할 때는 S9 mix.
- 세척은 3회 실시하였다. 세척한 시료는 12% polyacryl-amide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 120V에서 3시간 동안 실시한 후 발색시켜 densitometer(Vilber Lourmat, BIO-1D Image Analysis)로 정량한 다음, 저해율(%)을 산출하였다.
- 실험에 사용한 시료는 건조 시료(5 g)에 20배의 에탄올(100 ㎖)을 가하여 24시간 동안 실온에서 추출한 후 여과하는 과정을 2회 실시하였다. 여과액은 회전식 진공농축기(EYELA, rotary vacuum evaporator N-N series, Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 농축시킨 후, dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여 지질과산화 억제활성, DPPH 라디칼 소거활성, Ames test를 위한 시료로 사용하였고, 0.1 M sodium phosphate buffer(PBS, pH 7.4)에 녹여 MDA-BSA conjugation 억제효과를 측정하는 시료로 사용하였다.
- 따라서 이를 억제 하는 식품을 섭취하는 것은 만성질환, 암 및 노화를 예방하는데 중요하다(Miquel 등 1990). 우엉의 지질과산화물과 단백질의 결합 억제효과를 측정하기 위해 본 연구는 MDA와 BSA를직접 반응시키고 시료가 이를 억제하는 효과를 측정한 방법을 사용하였는데, 우엉 추출물을 이와 동일한 방법으로 측정한 연구는 없었다. 동일한 방법은 아니지만 rat liver homogenate에서 FeCl2-ascorbic acid-stimulated lipid peroxidation을 측정한 Duh PD(1998)의 연구 결과를 살펴보면, 우엉의 물 추출물은 농도 의존적으로 MDA의 형성을 억제하였고, 35 ㎎ 이상에서는 tocopherol보다 유의하게 높은 억제효과를 나타냈다.
- 항돌연변이능은 Salmonella Typhimurium TA98와 TA100 균주를 이용하여 측정하였다. 정기적으로 이들 균주의 histidine 요구성, deep rough(rfa)돌연변이, uvrB 돌연변이와 R factor 등의 유전형질을 확인하였다. 이들 균주는 nutrient broth에 접종, 배양한 후, 현탁액 1 ㎖당 DMSO 90 ㎕를 가하여 액체질소 탱크(Thermolyne, Bio CaneTM 20)에 보관하면서 사용하였다.
- 한국산 우엉(뿌리)의 항산화활성을 DPPH radical 소거효과, 지질과산화 억제효과 및 MDA-BSA conjugation 억제효과를 통해 살펴보고, Ames test를 이용하여 돌연변이 유발 억제 효과를 검토한 결과는 다음과 같다. 우엉의 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거율은 농도가 증가할수록 소거활성이 증가 하였다.
- 항돌연변이능은 Salmonella Typhimurium TA98와 TA100 균주를 이용하여 측정하였다. 정기적으로 이들 균주의 histidine 요구성, deep rough(rfa)돌연변이, uvrB 돌연변이와 R factor 등의 유전형질을 확인하였다.
대상 데이터
- (Detroit, MI, USA)에서, S9 mix.는 Moltox(11-01L Rat Liver LS-9, Japan)에서 구입하였다. 그 외에 본 실험에서 사용한 모든 시약은 분석용 특급시약을 사용하였다.
- 돌연변이 유발물질 중 간접돌연변이 물질로는 2-AA를 사용하였고, 직접돌연변이 물질로는 2-NF와 sodium azide phosphate 를 사용하였다. 2-AA와 2-NF는 DMSO에 녹여 사용하였고, sodium azide phosphate는 증류수에 녹여 사용하였다.
- 우엉뿌리는 대전시 중앙시장에서 구입하여 수세하고 동결 건조한 후, 분쇄하여 냉동보관(－20℃)하였다. 실험에 사용한 시료는 건조 시료(5 g)에 20배의 에탄올(100 ㎖)을 가하여 24시간 동안 실온에서 추출한 후 여과하는 과정을 2회 실시하였다. 여과액은 회전식 진공농축기(EYELA, rotary vacuum evaporator N-N series, Rikakikai Co.
- 우엉뿌리는 대전시 중앙시장에서 구입하여 수세하고 동결 건조한 후, 분쇄하여 냉동보관(－20℃)하였다. 실험에 사용한 시료는 건조 시료(5 g)에 20배의 에탄올(100 ㎖)을 가하여 24시간 동안 실온에서 추출한 후 여과하는 과정을 2회 실시하였다.
데이터처리
- 실험결과들은 3번 또는 5번 반복 측정하여 평균±표준오차로 나타내었고, 시료의 농도별 평균치 간의 유의성 검정은 분산분석 후, p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test로 검정하였다.
이론/모형
- Ames의 방법에 의한 항돌연변이 유발실험을 위한 배지 및시약의 조제는 Maron & Ames(1983)의 방법에 따라 행하였으며 Matsushima 등의 방법(Norphth & Garner 1980)에 따라 실험을 행하였다.
- BSA 단백질 정량은 Bradford법(Bradford M 1970)을 사용하였고, MDA는 Gomez-Sanchez 등(1990)의 방법에 따라 제조하였다.
- DPPH 라디칼 소거능은 Chen 등(1998)의 방법에 따라 측정하였다. DMSO에 녹여 농도별로 희석한 시료 10 ㎕에 200 μM DPPH/ethanol 190 ㎕를 가한 후, 37℃에서 30분 동안 반응시킨 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다(Molecular Devices, SpectraMAX 340pc).
- Fe2+에 의해 유도된 linoleic acid의 과산화에 대한 억제활성은 Saija 등(1995)과 Haase & Dunkley(1969)의 방법에 따라 측정하였다.
- MDA에 대한 단백질 보호효과는 Park YH(2000)의 방법에 따라 BSA(2 ㎎/ ㎖), MDA(20 mM), 우엉 추출물, 0.1 M PBS 를 혼합하여 37℃에서 24시간 반응시켰다. 반응이 끝난 시료 500 ㎕를 centricon(Amicon, Centricon YM-10)에 넣고 1,400×g 에서 2시간 동안 원심분리하여(Beckman, Model J2-21 centrifuge) MDA와 BSA의 결합물을 분리한 후, 여분의 염 등을 세척하기 위하여 증류수 700 ㎕를 넣고 다시 1,400×g에서 2시간 동안 원심분리하였다.
성능/효과
- 29 ㎎에 해당하였다. Fe2+에 의해 유도된 linoleic acid의 과산화에 대한 우엉 에탄올 추출물의 억제활성은 농도가 증가할수록 증가하였다. 우엉 추출물의 지질과산화 억제능의 IC50 값은 1,759 ㎍이었고, 이는 건조시료 7.
- 우엉의 지질과산화물과 단백질의 결합 억제효과를 측정하기 위해 본 연구는 MDA와 BSA를직접 반응시키고 시료가 이를 억제하는 효과를 측정한 방법을 사용하였는데, 우엉 추출물을 이와 동일한 방법으로 측정한 연구는 없었다. 동일한 방법은 아니지만 rat liver homogenate에서 FeCl2-ascorbic acid-stimulated lipid peroxidation을 측정한 Duh PD(1998)의 연구 결과를 살펴보면, 우엉의 물 추출물은 농도 의존적으로 MDA의 형성을 억제하였고, 35 ㎎ 이상에서는 tocopherol보다 유의하게 높은 억제효과를 나타냈다. 이는 본연구에서 우엉 추출물의 농도가 증가할수록 MDA와 BSA의결합 band가 감소하는 것과 비슷한 결과라고 생각된다.
- 그러나 우엉의 에탄올 추출물은 Salmonella Typhimurium TA98과 Salmonella Typhimurium TA100 모두에서 항돌연변이능이 나타나지 않았다. 따라서 본 연구 결과, 우엉의 에탄올 추출물은 직접적으로 항돌연변이능을 나타내지는 않았지만 라디칼 소거와 지질과산화 억제를 효과적으로 할 수 있는 높은 항산 화활성을 가지고 있으므로 간접적으로 항노화나 항돌연변이에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다고 본다. 또한 한국산 우엉의 항산화활성과 항돌연변이능을 정확히 파악하기 위해서는 다양한 추출법과 이에 따른 기능성 물질의 분석이 뒷받침되어야 할 것으로 사료된다.
- 65 ㎎이었다. 또한 우엉 추출물의 농도가 증가할수록 지질과산화물 (MDA)과 단백질(BSA)의 결합 억제효과도 증가하였다. 지질 과산화물이 단백질과 결합하는 것을 50% 억제하는 IC50은 57.
- 본 연구는 한국산 우엉을 사용하였고, 생 우엉을 동결건조한 후 에탄올로 추출한 시료이므로 위의 연구들과 정량적으로 비교할 수는 없지만 한국산 우엉 역시 DPPH 라디칼 소거 활성이 높고 농도의존적으로 그 활성이 증가하였다.
- 우엉의 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 Table 1과같다. 우엉 추출물의 DPPH 라디칼 소거율은 시료농도 5 ㎍/ 처리 시 6.45%, 50 ㎍/처리 시 29.14%, 500 ㎍/처리 시 70.46% 로 농도가 증가할수록 소거활성이 증가하였다. DPPH 라디칼을 50% 소거하는 시료의 농도인 IC 50값은 296 ㎍이었고, 이를 건조시료로 환산하면 1.
- 에 의해 유도된 linoleic acid의 과산화에 대한 억제활성은 Table 2와 같다. 우엉 추출물의 지질과산화 억제율은 시료 농도 10 ㎍/처리 시 5.38%, 100 ㎍/처리 시 15.42%, 1,000 ㎍/ 처리 시 30.67%로 우엉 추출물의 농도가 증가할수록 소거활성이 증가하였다. 우엉 추출물의 농도에 따른 지질과산화 억제율로 구한 IC50값은 1,759 ㎍이었고, 이를 건조시료로 환산하면 7.
- 한국산 우엉(뿌리)의 항산화활성을 DPPH radical 소거효과, 지질과산화 억제효과 및 MDA-BSA conjugation 억제효과를 통해 살펴보고, Ames test를 이용하여 돌연변이 유발 억제 효과를 검토한 결과는 다음과 같다. 우엉의 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거율은 농도가 증가할수록 소거활성이 증가 하였다. DPPH 라디칼 소거능의 IC50 값은 296 ㎍이었고, 이는 건조시료 1.
- Ames 법으로 측정한 우엉 추출물의 항돌연변이능은 Table 4와 같다. 직접작용 돌연변이물질인 2-NF(4 ㎍/plate)를 틀변경 변이주인 Salmonella Typhimurium TA98에, sodium azide(2 ㎍/plate)를 염기쌍 치환 변이주인 Salmonella Typhimurium TA100에 처리한 후, 우엉 에탄올 추출물을 농도별로 처리하여 직접작용 항돌연변이능을 측정하였으나, 효과가 나타나지 않았다. 또한 간접작용 돌연변이 물질인 2-AA(2.
후속연구
- 따라서 본 연구 결과, 우엉의 에탄올 추출물은 직접적으로 항돌연변이능을 나타내지는 않았지만 라디칼 소거와 지질과산화 억제를 효과적으로 할 수 있는 높은 항산 화활성을 가지고 있으므로 간접적으로 항노화나 항돌연변이에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다고 본다. 또한 한국산 우엉의 항산화활성과 항돌연변이능을 정확히 파악하기 위해서는 다양한 추출법과 이에 따른 기능성 물질의 분석이 뒷받침되어야 할 것으로 사료된다.
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