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문제 정의
- 등이 있다. 그러나 가장 비만 상태가 되기 쉬운 체질인 太陰人의 대표적 처방인 調胃升淸湯의 비만 및 고지혈증 관련 인자 개선효과에 대한 연구는 아직 발표된 것이 없어 고지방식이 유도 비만 쥐를 대상으로 그 효과를 살펴보고자 한다.
- 이와 같이 고지혈증, 인슐린, 렙틴은 비만과 밀접한 관계가 있다. 따라서 체중뿐만 아니라 혈청 지질, 인슐린, 렙틴은 비만과 관련된 인자이며, 이 논문에서는 비만 관련 인자들의 농도를 측정하여 調胃升淸湯 의 비만과 고지혈증에 대한 효과를 연구하였다.
- 본문에서는 C57BL/6 mice에 고지방식이와 함께 調胃升淸湯을 4주간 복용시킨 후 한약을 복용하지 않은 대조군과 비교하였다. 이에 고지방식이 유도 비만 쥐에 대한 調胃升淸湯의 체중 감소, 고지혈증 개선 및 혈청 insulin, leptin 농도 개선에 미치는 영향을 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 1주 적응기간이 끝난 후부터 4주간 매주 1회 일정한 시간에 0.01 g 단위까지 전자저울(CAS, 한국)로 측정하였다.
- 4주간의 사육기간이 끝난 후 금식시키고, 12시간이 지난 후 각 군의 실험 동물을 ether 마취하에 심장천자하여 혈액을 채취하였다. 혈액을 EDTA 처리된 튜브에 담아 3,000rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리한 후 (주)녹십자(Yongin, Korea)에 의뢰하여 혈청 지질, insulin, leptin 농도를 측정하였다.
- Total lipid 농도는 Total lipid reagents(Medicos, USA) 시약을 이용하여 Photometer(Agilent 8453, Agilent, Germany)로 측정하였다. Phospholipid 농도는 L-Type PL(Wako, Japan) 시약을 이용하여 Hitachi clinical analyzer(Hitachi 7180, Hitachi, Japan)로 측정하였다.
- Radioimmunoassay(RIA)를 사용하여 leptin을 측정하였고(LINCO Research, St. Charles, MO, USA), Mouse leptin RIA kit(LINCO, USA)와 γ-counter (COBRA 5010 Quanrum, PACKARD, USA)를 사용하였다.
- Total cholesterol, LDL-cholesterol, HDL-cholesterol, Triglyceride 농도는 각각 Cholesterol reagent(Bayer, USA), LDL-Cholesterol reagent(Bayer, USA), Direct HDL-Cholesterol reagent(Bayer, USA), Triglycerides reagents(Bayer, USA) 시약을 이용하여 자동혈액분석기(ADVIA 1650, Bayer, Japan)로 측정하였다. Total lipid 농도는 Total lipid reagents(Medicos, USA) 시약을 이용하여 Photometer(Agilent 8453, Agilent, Germany)로 측정하였다.
- Total cholesterol, LDL-cholesterol, HDL-cholesterol, Triglyceride 농도는 각각 Cholesterol reagent(Bayer, USA), LDL-Cholesterol reagent(Bayer, USA), Direct HDL-Cholesterol reagent(Bayer, USA), Triglycerides reagents(Bayer, USA) 시약을 이용하여 자동혈액분석기(ADVIA 1650, Bayer, Japan)로 측정하였다. Total lipid 농도는 Total lipid reagents(Medicos, USA) 시약을 이용하여 Photometer(Agilent 8453, Agilent, Germany)로 측정하였다. Phospholipid 농도는 L-Type PL(Wako, Japan) 시약을 이용하여 Hitachi clinical analyzer(Hitachi 7180, Hitachi, Japan)로 측정하였다.
- 정상군을 제외한 나머지 군은 4주간 60 kcal% fat의 고지방식이를 투여하여 비만을 유발시켰다. 調胃升淸湯군은 매일 1회 일정한 시각(오후 1시)에 調胃升淸湯 분말 35 mg을 증류수 0.1 cc에 희석하여 경구 투여하였고, 약물을 투여하지 않는 정상군과 대조군에는 같은 양의 증류수 0.1 cc를 경구 투여하였다.
- 또한 『東醫寶鑑·肉·肉主肥瘦』6)에서 ‘血實氣虛 則肥’, 『東醫寶鑑·用藥·肥瘦用藥』6)에서 ‘肥人, 氣虛多痰, 宜豁痰補氣’라 하여 비만인의 병기와 치료법을 제시하였다.
- 본문에서는 C57BL/6 mice에 고지방식이와 함께 調胃升淸湯을 4주간 복용시킨 후 한약을 복용하지 않은 대조군과 비교하였다. 이에 고지방식이 유도 비만 쥐에 대한 調胃升淸湯의 체중 감소, 고지혈증 개선 및 혈청 insulin, leptin 농도 개선에 미치는 영향을 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 실험 시작 시점의 체중을 기준으로, 체중 증가의 정도를 백분율로 계산해 보았다. 4주 후 체중 증가 정도는 대조군 141.
- 5℃, 습도 45±5%이었으며, 매일 광주기 및 암주기는 각각 12시간이 되도록 조절하였다. 실험동물은 각 군의 7마리씩을 stainless steel cage에 분류하여 사육하였고, 식이와 물은 자유 공급하였다. 동물실험은 경희의료원 실험동물 윤리위원회의 승인(KMHC- IACUC-10-069)을 얻고 수행하였다.
- 실험동물은 사육실에서 사육하였으며, 사육실 온도는 24±0.5℃, 습도 45±5%이었으며, 매일 광주기 및 암주기는 각각 12시간이 되도록 조절하였다.
- 실험은 4주령 C57BL/6 수컷 mouse 7마리씩을 정상군(Normal), 고지방식이 투여 대조군(이하 대조군, Control), 고지방식이와 함께 調胃升淸湯 투여군(이하 調胃升淸湯군, CWSCT)으로 나누어 진행하였다. 정상군을 제외한 나머지 군은 4주간 60 kcal% fat의 고지방식이를 투여하여 비만을 유발시켰다.
- 처음 1주간의 적응기간에는 모든 실험군의 mouse에 general diet(일반 쥐 사료, Research Diets)를 섭취시켰으며, 그 다음 4주간의 실험기간에는 각 군에 따라 general diet 또는 high fat diet(The original high fat diets, Research Diets, #D12492, 60 kcal% fat)를 섭취시켰다.
- 4주간의 사육기간이 끝난 후 금식시키고, 12시간이 지난 후 각 군의 실험 동물을 ether 마취하에 심장천자하여 혈액을 채취하였다. 혈액을 EDTA 처리된 튜브에 담아 3,000rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리한 후 (주)녹십자(Yongin, Korea)에 의뢰하여 혈청 지질, insulin, leptin 농도를 측정하였다.
대상 데이터
- RIA를 사용하여 insulin을 측정하였고, Rat insulin RIA kit(LINCO Research, St. Charles, MO, USA) 와 γ-counter(COBRA 5010 Quanrum, PACKARD, USA)를 사용하였다.
- 실험동물의 식이 및 사육, 실험에 이용된 동물은 중앙실험동물(주)에서 구입한 체중 20 g 전후의 4주령 C57BL/6 수컷 mouse로 7마리씩 3군으로 나누어 1주간 적응시킨 후 4주간 사육하였다. 실험동물은 사육실에서 사육하였으며, 사육실 온도는 24±0.
- 실험에서 사용한 調胃升淸湯(CWSCT)은 四象醫學 太陰人 胃受寒表寒病證에 적용되는 처방으로 경희대학교 경희의료원 한방병원에서 구입하여 사용하였다(Table 1).
데이터처리
- **: p<0.001 compared with control group by one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparison test.
- 각 군의 체중 결과는 정규성을 만족하였으므로 각 군 간의 체중 비교는 one-way ANOVA 로 분석하였고 Tukey’s multiple comparison test로 사후 검정하였으며, 각 군 내의 최초 체중과 최종 체중 비교는 paired t-test로 분석하였다.
- 결과는 평균±표준편차로 표시하였고, SPSS (version:12.0k; SPSS InC. Chicago, Illinois, USA) 를 이용하였다.
- 각 군의 체중 결과는 정규성을 만족하였으므로 각 군 간의 체중 비교는 one-way ANOVA 로 분석하였고 Tukey’s multiple comparison test로 사후 검정하였으며, 각 군 내의 최초 체중과 최종 체중 비교는 paired t-test로 분석하였다. 혈청 지질 및 insulin, leptin 결과는 정규성 검정을 한 결과 정규성을 만족하지 않았으므로 비모수 검정인 Kruskal Wallis test를 실시하였고, 다중분석은 분산의 동질성을 만족하지 않았으므로 Tanhamn T2를 시행하였다. 모든 통계치는 p값이 0.
성능/효과
- 1. 調胃升淸湯군은 대조군에 비하여 체중 증가를 유의하게 억제한다.
- 2. 調胃升淸湯군은 대조군에 비하여 혈청 HDL cholesterol 농도 감소를 유의하게 억제한다.
- 3. 調胃升淸湯군은 대조군에 비하여 혈청 Total cholesterol/HDL cholesterol 비의 증가를 유의 하게 억제한다.
- 4. 調胃升淸湯군은 대조군에 비하여 혈청 Leptin 농도 증가를 유의하게 억제한다.
- 실험 시작 시점의 체중을 기준으로, 체중 증가의 정도를 백분율로 계산해 보았다. 4주 후 체중 증가 정도는 대조군 141.10%, 調胃升淸湯군 127.70%, 정상군 122.93% 순서로 높았다(Fig. 1).
- 調胃升淸湯군도 대조군에 비하여 leptin 농도의 증가를 유의하게 억제하였다(p<0.05, Fig. 4).
- 각 군 내에서 최초 체중과 최종 체중을 비교하였을 때, 3군 모두 체중 변화가 유의하게 나타났다. 각 군 간의 비교에서는 실험 시작 시 실험군 간의 체중에 유의한 차이는 없었다.
- 각 군 내에서 최초 체중과 최종 체중을 비교하였을 때, 정상군, 대조군, 調胃升淸湯군의 p값이 각각 0.001, 0.000, 0.011로 4주 사육 후 모든 군에서 체중 변화가 유의하게 나타났다. 각 군 간의 체중을 비교해보면, 실험 시작 시 3개의 군 간의 체중 차이는 유의성이 없었다.
- 각 군의 Total cholesterol/HDL cholesterol 비를 계산한 결과, 정상군 1.70±0.14, 대조군 2.28±0.18, 調胃升淸湯군 1.82±0.08로, 정상군과 調胃升淸湯군은 대조군에 비하여 유의하게 낮았다(p<0.05, Fig. 3).
- 각 군의 Total cholesterol/HDL cholesterol 비를 계산해 본 결과, 정상군과 調胃升淸湯군은 대조군에 비하여 유의하게 낮았다(p<0.05).
- 그러나 4주 후 정상군에 비하여 대조군은 체중이 유의하게 증가하였으며, 調胃升淸湯군은 대조군에 비하여 체중 증가가 유의하게 억 제되었다(p<0.001, Table 3).
- 동물실험에서 혈청 HDL cholesterol 농도를 측정한 결과, 정상군 49.2±1.2 mg/dL, 대조군 64.2±0.6 mg/dL, 調胃升淸湯군 77.8±3.4 mg/dL으로, 調胃升淸湯군이 대조군에 비하여 HDL cholesterol 농도가 유의하게 증가하였다(p<0.05).
- 동물실험에서 혈청 LDL cholesterol 농도를 측정한 결과, 대조군은 정상군, 調胃升淸湯군에 비하여 LDL cholesterol 농도가 가장 높았다. 정상군 8.
- 동물실험에서 혈청 Leptin 농도를 측정한 결과, 정상군 1.67±0.30 ng/dL, 대조군 7.08±2.30 ng/dL, 調胃升淸湯군 3.40±0.81 ng/dL로, 대조군은 정상군, 調胃升淸湯군에 비하여 혈청 leptin 농도가 가장 높았다.
- 동물실험에서 혈청 Phospholipid 농도를 측정한 결과, 정상군 172.6±15.3 mg/dL, 대조군 242.8±15.9 mg/dL, 調胃升淸湯군 246.2±16.2 mg/dL로, 대조군이 정상군에 비하여 유의하게 높았다(p<0.05).
- 동물실험에서 혈청 Total cholesterol 농도를 측정한 결과, 대조군은 정상군, 調胃升淸湯군에 비하여 Total cholesterol 농도가 가장 높았다. 정상군 83.
- 동물실험에서 혈청 Total lipid 농도를 측정한 결과, 정상군 470.8±50.1 mg/dL, 대조군 645.8±36.0 mg/dL, 調胃升淸湯군 615.0±43.5 mg/dL로, 대조군이 정상군에 비하여 유의하게 높았다(p<0.05).
- 동물실험에서 혈청 Triglyceride 농도를 측정한 결과, 정상군 108.8±13.1 mg/dL, 대조군 127.2±12.9 mg/dL, 調胃升淸湯군 138.2±36.4 mg/dL로, 각 군 간에는 유의한 차이가 없었다.
- 동물실험에서 혈청 insulin 농도를 측정한 결과, 정상군 0.23±0.04 ng/dL, 대조군 0.67±0.25 ng/dL, 調胃升淸湯군 0.39±0.07 ng/dL로, 대조군은 정상군, 調胃升淸湯군에 비하여 혈청 insulin 농도가 가장 높았다.
- 본 연구에서는 太陰調胃湯 가미방이면서 마황을 함유한 調胃升淸湯이 비만 및 고지혈증 관련 인자에 대하여 부분적인 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
- Bruce K30) 등도 Total cholesterol/HDL cholesterol 비는 관상동맥질환의 좋은 예측인자라고 하였다. 이러한 근거를 바탕으로 결과를 해석하면, 정상군이 가장 관상동맥질환의 위험도가 낮으며, 調胃升淸湯군도 대조군에 비해 관상동맥질환의 위험도를 낮추는 효과가 있다고 볼 수 있다(Fig. 3).
- 이상의 결과로 볼 때, 고지방식이 유도 비만 C57BL/6 mouse 실험에서 調胃升淸湯은 체중 증가를 억제하며, 혈청 지질 중 HDL cholesterol의 감소를 억제하고, Total cholesterol/HDL cholesterol 비를 낮추는 효과가 있고, 혈청 leptin 농도 증가를 억제한다. 따라서 調胃升淸湯은 비만 및 고지혈증 억제에 대하여 부분적인 효과를 나타낼 뿐만 아니라 심혈관질환의 발병 빈도를 낮추는 역할을 한다.
- 정상군 83.8±7.5 mg/dL, 대조군 146.4±10.7 mg/dL, 調胃升淸湯 군 141.2±7.3 mg/dL로, 대조군은 정상군에 비하여 유의하게 증가하였으며(p<0.05), 調胃升淸湯군은 대조군에 비하여 Total cholesterol 농도 증가가 적었으나 유의성은 없었다(p=0.949).
- 즉, 調胃升淸湯군이 대조군에 비하여 HDL cholesterol 농도 감소를 유의하게 억제하였다(p<0.05, Fig. 2).
- 혈청 HDL cholesterol 농도 측정 결과, 調胃升淸湯군의 HDL cholesterol 농도는 대조군보다 높았다. 즉, 調胃升淸湯군이 대조군에 비하여 HDL cholesterol 농도 감소를 유의하게 억제하였다(p<0.
- 혈청 Total cholesterol과 LDL cholesterol 농도 측정 결과, 調胃升淸湯군은 대조군에 비하여 혈청 Total cholesterol과 LDL cholesterol 농도 증가를 억제하였으나 유의성은 없었다.
- 혈청 Triglyceride, Total lipid, Phospholipid 농도는 대조군과 調胃升淸湯군이 유의한 차이를 나타내지 않았다. 본 실험에서 이 항목들의 변화가 나타나지 않았던 것은 4주간의 짧은 기간 동안의 관찰이었던 관계로 여겨지며, 실험 기간을 연장하여 그 효과에 대한 지속적 연구가 필요하다고 생각된다.
- 혈청 leptin 농도 측정 결과, 정상군은 대조군에 비하여 혈청 leptin의 증가가 유의하게 낮았다 (p<0.001).
후속연구
- 또한 혈청 내 insulin 함량은 체중 및 내장지방 증가에 따라 증가하는 것으로 보고되고 있으며28), 調胃升淸湯에 의한 insulin 감소는 체중 감소에 기인한 것으로 판단된다. 그러나 본 실험에서 insulin 농도의 감소는 있었으나 유의성은 없었고, 이것 역시 좀 더 오랜 기간의 실험이 필요하다고 여겨진다.
- 그러나 혈청 insulin과 leptin 농도가 내장지방과도 밀접한 관련이 있으므로 내장지방 양도 함께 관찰한 실험이 추가적으로 필요하다. 또한 여러 임상연구에서 small dense LDL은 동맥경화의 위험인자라고 보고되었는데, LDL cholesterol 중에서 small dense LDL은 크기가 작고 입자의 성분이 다르기 때문에 혈관벽으로의 이동이 쉽게 이루어지고, 혈관벽에 더욱 오래 머물러 산화될 가능성이 높아지며, 결국 산화된 small dense LDL이 혈관벽을 자극하여 동맥경화를 촉진시킨다고 한다32).
- 또한 여러 임상연구에서 small dense LDL은 동맥경화의 위험인자라고 보고되었는데, LDL cholesterol 중에서 small dense LDL은 크기가 작고 입자의 성분이 다르기 때문에 혈관벽으로의 이동이 쉽게 이루어지고, 혈관벽에 더욱 오래 머물러 산화될 가능성이 높아지며, 결국 산화된 small dense LDL이 혈관벽을 자극하여 동맥경화를 촉진시킨다고 한다32). 그러므로 각 실험군의 LDL cholesterol의 농도뿐만 아니라 구성에 대한 효과 연구도 추가적으로 이루어진다면 비만의 합병증인 동맥경화의 위험인자에 대한 효과를 알 수있을 것이다. 마지막으로, 실험이 자유 급식으로 설계되어 3가지 군의 식이 섭취량 차이에 따른 변화를 차단하지 못하였고, mouse의 혈액량이 적어서 1회의 채혈만 가능하여 실험 시작 전 baseline 혈액 검사를 실시하여 더 정확하게 비교하지 못한 것이 한계점으로 남는다.
- Baldizán G27) 등의 논문에 의하면, 복숭아 팜유, 원유 팜유, 옥수수 기름, 소 기름 등으로 동물실험한 결과, 옥수수 기름 식이군에서만 혈청 HDL cholesterol 농도가 감소하였으며, HDL choleserol 농도는 식이 지방의 종류에 따라 많은 영향을 받는다고 하였다. 따라서 HDL cholesterol을 감소시키는 성분이 일반 식이에 포함되었을 것으로 사료되어 향후 추가적인 연구가 필요하다.
- 따라서 調胃升淸湯은 비만 및 고지혈증 억제에 대한 부분적인 효과를 보였으며, 비만인의 체중 감량, HDL cholesterol 농도 상승을 통한 고지혈증 개선, 심혈관질환 예방에 응용할 수 있는 가능성이 있어 추후 보다 높은 단계의 연구가 필요하다.
- 그러므로 각 실험군의 LDL cholesterol의 농도뿐만 아니라 구성에 대한 효과 연구도 추가적으로 이루어진다면 비만의 합병증인 동맥경화의 위험인자에 대한 효과를 알 수있을 것이다. 마지막으로, 실험이 자유 급식으로 설계되어 3가지 군의 식이 섭취량 차이에 따른 변화를 차단하지 못하였고, mouse의 혈액량이 적어서 1회의 채혈만 가능하여 실험 시작 전 baseline 혈액 검사를 실시하여 더 정확하게 비교하지 못한 것이 한계점으로 남는다.
- 혈청 Triglyceride, Total lipid, Phospholipid 농도는 대조군과 調胃升淸湯군이 유의한 차이를 나타내지 않았다. 본 실험에서 이 항목들의 변화가 나타나지 않았던 것은 4주간의 짧은 기간 동안의 관찰이었던 관계로 여겨지며, 실험 기간을 연장하여 그 효과에 대한 지속적 연구가 필요하다고 생각된다. 또한 실험에 사용한 고지방식이는 lard fat 함량이 31.
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