청도 반시의 과육과 감꼭지(시체: 枾滯)의 항산화 및 항염증 활성 연구 Study on the Anti-oxidant and Anti-inflammatory Activities of Sarcocarp and Calyx of Persimmon (Cheongdo Bansi)원문보기
천연 자원은 지금까지도 여러 치료제의 선도물질로서 개발되어 제약 산업 뿐만 아니라 식품 및 화장품 사업에 소중한 자원으로 이용되어 왔다. 따라서 본 연구는 청도에서 생산되는 청도반시를 이용하여 반시의 과육부분과 시체를 이용하여 의약품, 식품 및 화장품 소재로서 가능성을 찾아보고자 하였다. 전자공여능을 측정한 결과 시체의 에탄올 추출물은 500 ${\mu}g/mL$에서 91% 이상의 전자공여능을 나타내어 감 에탄올 추출물 40% 보다 우수하였고, SOD 유사활성능은 시체의 추출물이 1,000 ${\mu}g/mL$에서 22% 이하의 유사활성능을 나타내었다. 항염증 효과를 관찰하기 위하여 각질형성세포에 대한 감 및 시체의 세포생존율을 조사하여 생존율에 영향을 미치지 않는 5, 10, 25, 50 ${\mu}g/mL$농도에서 실험을 진행하였다. HaCaT세포에 LPS를 처리한 결과, 감의 시체 추출물이 LPS로 유도되어야 할 NO의 생성량과 iNOS, COX-2의 발현을 크게 저해하였고, 또한 염증성 사이토카인인 IL-$1{\beta}$, IL-6, TNF-${\alpha}$의 생성량도 크게 감소하였다. 이러한 결과로 보아 감의 시체 추출물은 염증성 질환의 치료에 활용될 수 있음을 시사한다.
천연 자원은 지금까지도 여러 치료제의 선도물질로서 개발되어 제약 산업 뿐만 아니라 식품 및 화장품 사업에 소중한 자원으로 이용되어 왔다. 따라서 본 연구는 청도에서 생산되는 청도반시를 이용하여 반시의 과육부분과 시체를 이용하여 의약품, 식품 및 화장품 소재로서 가능성을 찾아보고자 하였다. 전자공여능을 측정한 결과 시체의 에탄올 추출물은 500 ${\mu}g/mL$에서 91% 이상의 전자공여능을 나타내어 감 에탄올 추출물 40% 보다 우수하였고, SOD 유사활성능은 시체의 추출물이 1,000 ${\mu}g/mL$에서 22% 이하의 유사활성능을 나타내었다. 항염증 효과를 관찰하기 위하여 각질형성세포에 대한 감 및 시체의 세포생존율을 조사하여 생존율에 영향을 미치지 않는 5, 10, 25, 50 ${\mu}g/mL$농도에서 실험을 진행하였다. HaCaT세포에 LPS를 처리한 결과, 감의 시체 추출물이 LPS로 유도되어야 할 NO의 생성량과 iNOS, COX-2의 발현을 크게 저해하였고, 또한 염증성 사이토카인인 IL-$1{\beta}$, IL-6, TNF-${\alpha}$의 생성량도 크게 감소하였다. 이러한 결과로 보아 감의 시체 추출물은 염증성 질환의 치료에 활용될 수 있음을 시사한다.
Biological activities of sarcocarp and calyx of persimmon (Cheongdo Bansi) were investigated. The electron donating ability of the calyx extract was 91% at a 500 ${\mu}g/mL$ level, which was higher than that of the sarcocarp extract (40%). The superoxide dismutase (SOD)-like activity of c...
Biological activities of sarcocarp and calyx of persimmon (Cheongdo Bansi) were investigated. The electron donating ability of the calyx extract was 91% at a 500 ${\mu}g/mL$ level, which was higher than that of the sarcocarp extract (40%). The superoxide dismutase (SOD)-like activity of calyx extracts was about 22% at a 1,000 ${\mu}g/mL$ level. During the entire experimental period, there was no cytotoxicity found from sarcocarp and calyx up to 50 ${\mu}g/mL$. Our results indicated that sarcocarp and calyx significantly inhibited NO production and iNOS and COX-2 expression accompanied by an attenuation of interleukin (IL)-$1{\beta}$, IL-6, and tumer necrosis factor (TNF)-${\alpha}$ formation in human keratinocyte. These results suggest that sarcocarp and calyx of persimmon may have significant effect on inflammatory factors and can be used as potential anti-inflammatory agents.
Biological activities of sarcocarp and calyx of persimmon (Cheongdo Bansi) were investigated. The electron donating ability of the calyx extract was 91% at a 500 ${\mu}g/mL$ level, which was higher than that of the sarcocarp extract (40%). The superoxide dismutase (SOD)-like activity of calyx extracts was about 22% at a 1,000 ${\mu}g/mL$ level. During the entire experimental period, there was no cytotoxicity found from sarcocarp and calyx up to 50 ${\mu}g/mL$. Our results indicated that sarcocarp and calyx significantly inhibited NO production and iNOS and COX-2 expression accompanied by an attenuation of interleukin (IL)-$1{\beta}$, IL-6, and tumer necrosis factor (TNF)-${\alpha}$ formation in human keratinocyte. These results suggest that sarcocarp and calyx of persimmon may have significant effect on inflammatory factors and can be used as potential anti-inflammatory agents.
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문제 정의
이용되어 왔다. 따라서 본 연구는 청도에서 생산되는 청도 반시를 이용하여 반시의 과육부분과 시체를 이용하여 의약품, 식품 및 화장품 소재로서 가능성을 찾아보고자 하였다. 전자공여 능을 측정한 결과 시체의 에탄올 추출물은 500|ig/mL에서 91% 이상의 전자공여능을 나타내어 감 에탄올 추출물 40% 보다 우수 하였고, SOD 유사활성능은 시체의 추출물이 1, 000 |ig/mL에서 22% 이하의 유사활성능을 나타내었다.
따라서, 본 연구에서는 청도반시의 감꼭지(시체: 柿滯)와 감의 과육부분의 항염증 활성을 검토하여 청도반시의 고부가가치화와 활용성의 증대방안을 강구하고자 연구를 하였다.
가설 설정
3)Each value is mean士SD (n±3).
제안 방법
5 mL 넣어준 뒤 실온에서 1시간 방치 한다. 420nm에서 흡광도를 측정한 후 표준물질인 quercetin 으로 미리 작성한 표준곡선의 흡광도 값과 비교하여 플라보노이드 함량을 측정하였다.
세포 배양액 내의cytokines의 양을 측정하기 위하여 ELISA Kit (Diaclone, Besancon, France)를 이용하여 측정하였다. HaCaT 세포에 10 曲/ng LPS를 처리하여 1시간 뒤 감 및 시체 추출물을 농도별(10, 25, 50 pig/mL) 농도로 처리한 다음 24시간 배양한 후세포배양액을 얻어 cytokine 측정에 이용하였다. 각각의 cytokine으로 coating된 96 well plate에 배 양액 100 μL biotinylated antibody reagent를 처리하여 상온에서 1시간 반응 후 washing buffer로 3회 세척하였다.
NO 생성량 측정. NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를Griess reagent를 이용하여 측정하였다. HaCaT 세포를 DMEM 배지를 이용하여 5xl04 cells/ml로 조절한 후 12 well plate에 접종하고, 5% CO2 incubatoi에서 24시간 전 배양하였다.
이 방법은 MTT가 ft)rmazan으로 전환되는 것을 측정하는 것으로, HaCaT 세포 1x10* cells/mL를 96 well plate에 분주하고 감 및 시체추출물을 농도별(5, 10, 50, 75, 100 pg/mL)로 24시간 동안 처리하였다. Well당 20|iL의 MTT용액을 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubatoi에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader 를 이용하여 540nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다.
총 폴리페놀 함량은 Folir과 Denis [1912]에 준하여 정량하였다. 감 및 시체 추출물 100 μL에 Folin-ciocalteu phenol reagent 100 μL를 가하고 0.75 M Na2CO3 100 |1L를 가하여 혼합한 후 1시간 실온에서 방치하고 750nm㎛서 흡광도를 측정한 후 표준물질인 tannic acid로 미리 작성한 표준곡선의 흡광도 값과 비교하여 폴리페놀 함량을 산출하였으며, 총 플라보노이드의 함랑은 Woisky 와 Salatino [1998]의 방법을 변형하여 측정하였다. 추출물 시료 1 mg을 증류수 1 mL에 녹인다.
MTT assay에 의한 세포 생존율 측정. 감 및 시체 추출물에대한 독성 측정은 MTT 측정으로 분석하였다. 이 방법은 MTT가 ft)rmazan으로 전환되는 것을 측정하는 것으로, HaCaT 세포 1x10* cells/mL를 96 well plate에 분주하고 감 및 시체추출물을 농도별(5, 10, 50, 75, 100 pg/mL)로 24시간 동안 처리하였다.
감 및 시체의 추출물이 iNOS 및 COX-2를 저해하는 효과가 있는지 알아보기 위하여 human keratinocyte세포를 이용하여 iNOS protein의 발현 변화를 western blotting으로 확인하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 g-actin을 positive control로 사용흐]■였으며, Fig.
그리고 PVDF membrane을 5% skim milk에서 1시간 방치한 뒤 primary antibody에서 4℃에서 overnight하여 준다. 다시 Tris-bufiered saline and tween 20 (TBST)로 세 번 세척한뒤 secondary antibody를 상온에서 1시간 반응 시킨 뒤 TBST로 세 번 세척 ■하■고 Amersham ECL western blotting detection reagent (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)와 반응시 켜 LAS 4000 chemiluminescence detection system (Fuji, Tokyo, Japan)을 이용하여 현상 후 분석하였다.
세포에 leg/mL의 LPS를 처리하고 1시간 뒤에 5, 10, 25, 50 μg/ mL回 감 및 시체 추출물을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후 Griess 시약과 반응 시킨 후 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하여 NO 생성율을 백분율로 표시하였다.
-1 beta, IL-6, TNF-alpha 분비량 측정. 세포 배양액 내의cytokines의 양을 측정하기 위하여 ELISA Kit (Diaclone, Besancon, France)를 이용하여 측정하였다. HaCaT 세포에 10 曲/ng LPS를 처리하여 1시간 뒤 감 및 시체 추출물을 농도별(10, 25, 50 pig/mL) 농도로 처리한 다음 24시간 배양한 후세포배양액을 얻어 cytokine 측정에 이용하였다.
감 및 시체의 추출물이 lOOjxg/mL 에서 각각 93, 94% 이상의 세포생존율을 나타내어 각질 형성 세포 독성에 영향을 적게 주는 것으로 나타났다. 세포독성 결과로부터 시료용액의 농도를 100μ矽mlQ]하의 농도로 결정하여 실험을 하였다. 이는 돌나물 추출물을 100 ng/mL 이상 처리 시 human keratinocyte 세포의 세포생존율이 90% 이하로 나타나는 결과[Sim 등, 2008]와 비교시 감 및 시체의 세포 생존율이 우수함을 확인할 수 있었다.
HaCaT 세포를 DMEM 배지를 이용하여 5xl04 cells/ml로 조절한 후 12 well plate에 접종하고, 5% CO2 incubatoi에서 24시간 전 배양하였다. 세포에 leg/mL의 LPS를 처리하고 1시간 뒤에 5, 10, 25, 50 μg/ mL回 감 및 시체 추출물을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후 Griess 시약과 반응 시킨 후 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하여 NO 생성율을 백분율로 표시하였다.
감 및 시체 추출물에대한 독성 측정은 MTT 측정으로 분석하였다. 이 방법은 MTT가 ft)rmazan으로 전환되는 것을 측정하는 것으로, HaCaT 세포 1x10* cells/mL를 96 well plate에 분주하고 감 및 시체추출물을 농도별(5, 10, 50, 75, 100 pg/mL)로 24시간 동안 처리하였다. Well당 20|iL의 MTT용액을 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubatoi에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader 를 이용하여 540nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다.
전자공여능 측정. 전자공여능(EDA: electron donating ability) 은 Blois [1958]의 방법을 변형하여 측정하였다. 각 시료용액 2 mL에 0.
전자공여 능을 측정한 결과 시체의 에탄올 추출물은 500|ig/mL에서 91% 이상의 전자공여능을 나타내어 감 에탄올 추출물 40% 보다 우수 하였고, SOD 유사활성능은 시체의 추출물이 1, 000 |ig/mL에서 22% 이하의 유사활성능을 나타내었다. 항염증 효과를 관찰하기 위하여 각질형성세포에 대한 감 및 시체의 세포 생존율을 조사하여 생존율에 영향을 미치지 않는 5, 10, 25, 50 μg/mL농도에서 실험을 진행하였다. HaCaT세포에 LPS를 처리한 결과, 감의 시체 추출물이 LPS로 유도되어야 할 NO의 생성량과 iNOS, COX-2의 발현을 크게 저해하였고, 또한 염증성사이토카인인 IL-ip, IL-6, TNF-a의 생성량도 크게 감소하였다.
대상 데이터
에서, Sodium Dodesyl Sulfate (SDS), Acrylamide, bisacrylamidee Bio-rad Co, (Hercules, CA)에서 구입하였다. 1 차 항체인 iNOS는 BD Bioscience (SanJose, CA), COX®는 Cayman (Ann Arbor, MI), 0-Actin 은 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)에서 구입하였다. 2차 항체인 anti-rabbit Ig-G horseradish peroxidase (HRP)-conjugated antibody는 Santa Cruz에서 구입하였다.
1 차 항체인 iNOS는 BD Bioscience (SanJose, CA), COX®는 Cayman (Ann Arbor, MI), 0-Actin 은 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)에서 구입하였다. 2차 항체인 anti-rabbit Ig-G horseradish peroxidase (HRP)-conjugated antibody는 Santa Cruz에서 구입하였다. IL-1 beta, IL-6, TNF-alpha 즉정을 위한 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kit (Diacion, Besancon, France)를 사용하였다.
세포배양. 각질형성세포(HaCaT)는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양 받았으며, 세포배양을 위해 10% FBS과 1% penicillinstreptomycin을 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
시료재료. 본 실험에 사용한 감(Persimmon)은 학명이Diospyros kaki Thunb로 경북 청도군에서 재배된 청도반시를구입하여 실험재료로 사용하였다.
IL-1 beta, IL-6, TNF-alpha 즉정을 위한 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kit (Diacion, Besancon, France)를 사용하였다. 실험에 사용된 기기는 ELISA reader (Tecan, Monnedorf; Switzerland), UV/VIS spectrophotometer (Hitachi, Tokyo, Japan), rotary vacuum evaporator (Rikakikai Co., Tokyo, Japan), Freeze drier (Ilsin, Gyeonggi-do, Korea), centtifoge (Hitachi), microscope (Olympus, Tokyo, Japan), CO2 incubator (Hanbaek Co., Gyeonggi-do, Korea), Haemacytometer (Marienfeld, Germany) 를 사용하였다.
항염증 효과에 측정에 사용된 시약인 lipopolysaccharide (LPS), NP-40, protease inhibitor, ripa buffer, Griess reagent 등은 Sigma Chemical Co.에서, Sodium Dodesyl Sulfate (SDS), Acrylamide, bisacrylamidee Bio-rad Co, (Hercules, CA)에서 구입하였다. 1 차 항체인 iNOS는 BD Bioscience (SanJose, CA), COX®는 Cayman (Ann Arbor, MI), 0-Actin 은 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)에서 구입하였다.
시약 및 기기. 폴리페놀, 플라보노이드 및 항산화능 측정 실험에 사용된 시약인 1-1 -diphenyl-2-picryl-hydrazy 1 (DPPH), pyrogallol, tannic acid, quercetin 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), 세포배양을 위한 Dulbeco's Modifide Eagle Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), streptomycin penicillin, trypsin 250, 0.4% trypan blue staine Gibco BRL Co. (Grand Island, New York), 3-[4, 5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2, 5-diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT)는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)게서 구입하여 사용하였다. 항염증 효과에 측정에 사용된 시약인 lipopolysaccharide (LPS), NP-40, protease inhibitor, ripa buffer, Griess reagent 등은 Sigma Chemical Co.
데이터처리
Data represent the mean土SD with three separate experiments. Oneway ANOVA was used for comparisons of multiple group means followed by t-test (Significant as compared to control. *p<0.05, **/?<0.01).
Data represent the mean±SD with three separate experiments. Oneway ANOVA was used for comparisons of multiple group means followed by t-test (Significant as compared to control. *p<0.05, **p<0.01).
통계처리. 결과 통계처리는 SPSS 10.0을 사용하였으며, 유의차 검증은 분산분석 (ANOVA: analysis of variance)을 한 후 a=0.05 수준에서 Duncan의 다중검증법(DMRT: Duncan's multiple range test)에 따라 분석하였다.
이론/모형
2차 항체인 anti-rabbit Ig-G horseradish peroxidase (HRP)-conjugated antibody는 Santa Cruz에서 구입하였다. IL-1 beta, IL-6, TNF-alpha 즉정을 위한 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kit (Diacion, Besancon, France)를 사용하였다. 실험에 사용된 기기는 ELISA reader (Tecan, Monnedorf; Switzerland), UV/VIS spectrophotometer (Hitachi, Tokyo, Japan), rotary vacuum evaporator (Rikakikai Co.
SOD 유사활성 측정. SOD 유사활성은 Markhmd와 Marklundμ974]의 방법에 준하여 측정하였다. 각 시료용액 0.
배양이 끝난 세포를 수집하여 phosphate buffered saline (PBS)로 세척한 후 IOOjiL의 lysis buffere 첨가하여 30분간 lysis 시킨 후 13, 000rpm에서 20분간 원심 분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 bovine serum albumin (BSA)를 표준화 하여 Bradford assay를 사용하여 정 량화 하였다. 40 gg protein을 10% SDS-PAGE 로 분리하여 이를 polyvinylidenedifluoride (PVDF) membrane에 55V로 90분간 transfer하였다.
총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정. 총 폴리페놀 함량은 Folir과 Denis [1912]에 준하여 정량하였다. 감 및 시체 추출물 100 μL에 Folin-ciocalteu phenol reagent 100 μL를 가하고 0.
성능/효과
항염증 효과를 관찰하기 위하여 각질형성세포에 대한 감 및 시체의 세포 생존율을 조사하여 생존율에 영향을 미치지 않는 5, 10, 25, 50 μg/mL농도에서 실험을 진행하였다. HaCaT세포에 LPS를 처리한 결과, 감의 시체 추출물이 LPS로 유도되어야 할 NO의 생성량과 iNOS, COX-2의 발현을 크게 저해하였고, 또한 염증성사이토카인인 IL-ip, IL-6, TNF-a의 생성량도 크게 감소하였다. 이러한 결과로 보아 감의 시체 추출물은 염증성 질환의 치료에 활용될 수 있음을 시사한다.
4와 같이 나타내었다. LPS를 첨가하지 않은 군에서는 54%의 NO를 생성하였고, LPS와 감 및 시체를 첨가한 군에서는 시체 추출물이 NO의 생성량을 가장 많이 억제하였다. 즉, 감 및 시체 추출물 모두 농도 의존적으로 NO의 생성을 억제함을 나타내었으며, 50 μ以mL의 농도에서 감의 경우 27%의 NO의 생성을 억제하였으며, 시체의 경우 48% 이상의 높은 NO의 생성을 억제하였다.
본 실험에서는 감 및 시체의 에탄올 추출물에 함유된 총 폴리페놀 화합물의 함량은 Table 1과 같이 나타내었다. 감 및 시체 에탄올 추출물의 총폴리 페놀 함량은 각각 11.73, 231.28 mg/g으로 나타내었으며, 총 플라보노이드는 1.74, 5.62 mg/g을 나타내어 폴리페놀 함량에 비해 낮게 나타났으며, 청도반시의 과육 추출물 보다 시체추출물에서 3배 이상 많은 플라보노이드 화합물이 함유된 것으로 나타났다. 이는 Lee 등[2005]의 울릉도산 산채류 추출물인 물엉겅퀴 잎과 섬고사리 잎 추출물에서 각각 130.
2와 같이 나타내었다. 감 및 시체 추출물 모두 농도가 증가함에 따라 유의적으로 SOD 유사활성을 나타내었다. 1, 000昭/mL 에서 감 및 시체의 추출물 각각의 활성이 11%와 23% 정도를 나타내었다.
특히 시체의 경우 50μg/mL에서 77% 이상의 iNOS 발현을 감소시켰으며, COX-2의 경우 LPS를 처리하지 않은 정상군에 비해 LPS 를 5 |ig/mL 농도로 처리한 대조군에서는 COX-2 protein 발현이 72kDa에서 50% 수준으로 나타났다. 감 및 시체 추출물을 첨가한 군에서는 농도 의존적으로 COX-2 발현이 감소하는 경향을 나타내었지만 모두 큰 효과는 나타나지 않았으며, 시체 50 |ig/mL 에서 COX-2 발현을 24% 정도로 감소시켜 가장 좋은 효과를 나타내었다(Fig. 6).
3과 같이 나타내었다. 감 및 시체의 추출물이 lOOjxg/mL 에서 각각 93, 94% 이상의 세포생존율을 나타내어 각질 형성 세포 독성에 영향을 적게 주는 것으로 나타났다. 세포독성 결과로부터 시료용액의 농도를 100μ矽mlQ]하의 농도로 결정하여 실험을 하였다.
LPS 자극에 의해 생성된 NO는 염증빈응을 매개하는 역할을 하게 되는데 활성화된 세포에서 IL-lp, IL-6, IL-10, TNF-a 와 같은 전염증성 및 염증성 cytokine과 PGE2 등을 생산하게 된다[Hiroliashi와 Morrison, 1996; Horwood 등, 2006]. 염증 매개 물질이 과량 생산되면, 과도한 면역반응을 야기하게 되고 이로써 대장염, 췌장염, 류마티스성 관절염, 천식 등의 각종 인체질환을 악화시키는 원인이 된다[Wang 등, 1995; Matsuda 등,2003], 본 실험에서 LPS는 IL-ip, IL-6, TNF-a의 생성을 증가시켰으며, 감 및 시체의 의 추출물을 농도별로 처리한 결과 Fig. 7, 8과 같이 IL-6는 감 및 시체 추출물 농도가 50μg/mL에서 22%, 56%의 생성 억제 효과를 나타내었으며, IL-1P와 TNF-a 는 시체 추출물 50 卜ig/mL에서 각 30, 51%의 생성억제 효과를 나타내었다.
감 추출물의 경우 1,000 에서 48% 의 전자공여능을 나타낸 반면 시체의 경우 500 ng/mL에서 91% 의 전자공여능을 나타내어 대조군인 ascorbic acid와 같은 농도에서 비교시 유사한 전자공여능을 나타내었다. 이는 와송 메탄올 추출물의 1,000μ以mL割 농도에서 88.3%의 전자공여 능과 와송 열수 추출물[Choi 등, 2008]의 1,000)ig/mLe 농도에서 60.6%의 전자공여능을 나타낸 결과와 비교하여 시체의 전자공여 능이 우수함을 확인할 수 있었다.
확인하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 g-actin을 positive control로 사용흐]■였으며, Fig. 5와 같이 LPS를 처리 하지 않은 Normal 군에서는 iNOS protein 발현이 거의 나타나지 않았지만, LPS를 처리한 군에서는 iNOS protein 발현이 130kDa에서 상당 수준으로 나타났으며, 감 및 시체 추출물을 첨가한 군에서는 농도 의존적으로 유의성 있게 iNOS 발현이 감소함을 나타내었다. 특히 시체의 경우 50μg/mL에서 77% 이상의 iNOS 발현을 감소시켰으며, COX-2의 경우 LPS를 처리하지 않은 정상군에 비해 LPS 를 5 |ig/mL 농도로 처리한 대조군에서는 COX-2 protein 발현이 72kDa에서 50% 수준으로 나타났다.
따라서 본 연구는 청도에서 생산되는 청도 반시를 이용하여 반시의 과육부분과 시체를 이용하여 의약품, 식품 및 화장품 소재로서 가능성을 찾아보고자 하였다. 전자공여 능을 측정한 결과 시체의 에탄올 추출물은 500|ig/mL에서 91% 이상의 전자공여능을 나타내어 감 에탄올 추출물 40% 보다 우수 하였고, SOD 유사활성능은 시체의 추출물이 1, 000 |ig/mL에서 22% 이하의 유사활성능을 나타내었다. 항염증 효과를 관찰하기 위하여 각질형성세포에 대한 감 및 시체의 세포 생존율을 조사하여 생존율에 영향을 미치지 않는 5, 10, 25, 50 μg/mL농도에서 실험을 진행하였다.
LPS를 첨가하지 않은 군에서는 54%의 NO를 생성하였고, LPS와 감 및 시체를 첨가한 군에서는 시체 추출물이 NO의 생성량을 가장 많이 억제하였다. 즉, 감 및 시체 추출물 모두 농도 의존적으로 NO의 생성을 억제함을 나타내었으며, 50 μ以mL의 농도에서 감의 경우 27%의 NO의 생성을 억제하였으며, 시체의 경우 48% 이상의 높은 NO의 생성을 억제하였다. 이는 Byun 등[2005]의 현삼 메탄올 추출물과 Kim 등 [2004]의 상황 H2O 추출물의 LPS로 유도된 Raw264.
5와 같이 LPS를 처리 하지 않은 Normal 군에서는 iNOS protein 발현이 거의 나타나지 않았지만, LPS를 처리한 군에서는 iNOS protein 발현이 130kDa에서 상당 수준으로 나타났으며, 감 및 시체 추출물을 첨가한 군에서는 농도 의존적으로 유의성 있게 iNOS 발현이 감소함을 나타내었다. 특히 시체의 경우 50μg/mL에서 77% 이상의 iNOS 발현을 감소시켰으며, COX-2의 경우 LPS를 처리하지 않은 정상군에 비해 LPS 를 5 |ig/mL 농도로 처리한 대조군에서는 COX-2 protein 발현이 72kDa에서 50% 수준으로 나타났다. 감 및 시체 추출물을 첨가한 군에서는 농도 의존적으로 COX-2 발현이 감소하는 경향을 나타내었지만 모두 큰 효과는 나타나지 않았으며, 시체 50 |ig/mL 에서 COX-2 발현을 24% 정도로 감소시켜 가장 좋은 효과를 나타내었다(Fig.
후속연구
HaCaT세포에 LPS를 처리한 결과, 감의 시체 추출물이 LPS로 유도되어야 할 NO의 생성량과 iNOS, COX-2의 발현을 크게 저해하였고, 또한 염증성사이토카인인 IL-ip, IL-6, TNF-a의 생성량도 크게 감소하였다. 이러한 결과로 보아 감의 시체 추출물은 염증성 질환의 치료에 활용될 수 있음을 시사한다.
참고문헌 (46)
Achiwa Y, Hibasami H, Katsuzaki H, Imai K, and Komiya T (1997) Inhibitory effects of persimmon (Diospyros kaki) extract and related polyphenol compounds on growth of human lymphoid leukemia cells. Biosci Biotech Biochem 61, 1099-1109.
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