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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 보다 안전하고 우수한 활성을 나타내는 항산화제를 천연물로부터 개발하고자 하는 연구의 하나로 감꼭지의 다양한 극성별 용매 분획물에 대하여 DPPH법에 의한 free radical 소거 작용과 총페놀법에 의한 항산화 활성 물질의 함량 검색을 통해 우수한 항산화 활성을 나타내는 활성 분획물을 확인하고, 활성 분획물로부터 column chromatography에 의해 활성 주성분을 분리한 후 분리되어진 화합물에 대하여 NMR 등의 기기분석을 통해 감꼭지의 항산화 활성 주성분을 다음과 같이 확인하였으므로 이를 보고하고자 한다.
- 그러나 지금까지 개발되어진 다양한 천연 및 합성 항산화제들은 독성, 유해성 및 효능 등에서 다소 미미한 점을 지니고 있다. 이에 천연물이나 약용식물로부터 새로운 항산화제를 개발하기 위한 연구의 하나로, 본 연구는 감꼭지(시체)에 대하여 보다 상세한 항산화 효과의 검토와 함께 항산화 활성 주성분 규명 연구를 실시한 결과 다음과 같은 지견을 얻었다.
제안 방법
- 0.1 M의 초산 완충액(pH 5.5, 2.0 ml)에 시료의 EtOH 용액(2.0 ml) 및 2×10-4 M DPPH EtOH용액(1.0 ml)을 가하여 전량을 5 ml로 하고 실온에 방치한 후, 30분 후 517 nm에서의 흡광도를 1/2로 감소시키는데 필요한 시료의 양(mg)을 α-tocopherol 및 BHA와 같은 기존의 항산화제를 대조군으로 하여 시험하였다.
- 방법에 의해 다음과 같이 측정 하였다. Blank 및 gallic acid를 MeOH로 희석하여 0, 50, 100, 250, 500 ppm의 농도로 제조하여 700 nm에서의 흡광도로 측정한 검량선을 작성하였다. 각 분획물 10 mg을 MeOH 1 ml를 가하여 녹인 다음 0.
- 계속하여 가장 강한 항산화 활성을 나타낸 n-BuOH 분획물로부터 항산화 활성 주성분을 규명하기 위하여 n-BuOH 분획물을 CHCl3와 MeOH 혼합용매를 사용하여 전개용매의 극성을 단계적으로 증가시키면서 silica gel column chromatography를 실시하여 얻어진 6종의 소분획물에 대해서도 DPPH법에 의한 free radical 소거 작용을 실시하였다. 그 결과 Table III에 나타난 바와 같이 fraction 4, 5 및 6이 BHA보다는 약하나 α-tocopherol과는 유사한 항산화 활성을 보임으로서 항산화 활성 주성분 소분획물임을 확인할 수 있었다.
- 2 g)을 각각 얻었다. 분획물 중 가장 우수한 항산화 효과를 나타낸 n-BuOH 분획물(2.5 g)을 CHCl3: MeOH = 20:1부터 단계적으로 극성을 높인 전개용매를 이용하여 silica gel column chromatography를 실시하여 6개의 활성 소분획인 fraction 1(0.1 g), fraction 2(0.1 g), fraction 3(0.07 g), fraction 4(0.03 g), fraction 5(0.1 g) 및 fraction 6(1.5 g)로 나누었으며, 가장 높은 항산화 효과를 나타낸 fraction 4와 fraction 5 및 fraction 6으로부터 재차 silica gel column chromatography와 Sephadex-LH 20을 실시하여 각각 화합물 1(10.2 mg)과 2(30.5 mg) 및 3(120.3 mg)을 분리하였다.
- 5 g)를 얻었다. 얻어진 MeOH extract의 일부를 증류수에 현탁시켜 n-hexane, EtOAc, n-BuOH 및 H2O 순으로 분획 후 농축하여 각 분획물 n-hexane 분획물(1.2 g), EtOAc 분획물(5.4 g), n-BuOH 분획물(2.6 g), 및 H2O 분획물(6.2 g)을 각각 얻었다. 분획물 중 가장 우수한 항산화 효과를 나타낸 n-BuOH 분획물(2.
- 5 ml를 가하고 증류수 1 ml을 넣은 후 실온에서 1시간 동안 반응시킨다. 이어서 1시간 후 700 nm에서의 흡광도를 측정하여 검량선 대비 총 폴리페놀 함량을 계산하였다.
- 화합물 3은 무색의 무정형 분말로서 FeCl3 정색 시험에서 청남색을 나타내고, IR spectrum에서 수산기와 카르보닐기가 확인되고 UV에서 벤젠환의 존재를 확인함에 의해 페놀성 화합물로 추정하였다. 1H-NMR에서 δ 7.
- Free radical 소거효과 측정용 시약인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)는 Aldrich사 제품을 구입하여 사용하였으며, 표준품인 α-tocopherol 및 BHA(butylated hydroxyanisole)는 Sigma사 제품을 구입하여 사용하였고, 추출 및 분획용 용매는 모두 특급 시약을 사용하였다. 흡광도는 Milton-Roy spectronic Genesys-5 UV 분광계를 사용하여 측정하였고, FT-NMR은 Varian Mercury 300 MHz를, 융점은 Mettler FP-5 융점측정기를 사용하였으며 보정은 하지 않았다.
대상 데이터
- Free radical 소거효과 측정용 시약인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)는 Aldrich사 제품을 구입하여 사용하였으며, 표준품인 α-tocopherol 및 BHA(butylated hydroxyanisole)는 Sigma사 제품을 구입하여 사용하였고, 추출 및 분획용 용매는 모두 특급 시약을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 감꼭지는 강원도 원주시 우산동에 소재한 천일약업사에서 구입하여 음건하고 세절하여 실험 재료로 사용하였고, 상지대학교 제약공학과 의약화학 실험실에 보관중이다.
이론/모형
- 총 폴리페놀 함량은 Folin- Denis의21) 방법에 의해 다음과 같이 측정 하였다. Blank 및 gallic acid를 MeOH로 희석하여 0, 50, 100, 250, 500 ppm의 농도로 제조하여 700 nm에서의 흡광도로 측정한 검량선을 작성하였다.
성능/효과
- 1. 감꼭지의 용매별 분획물에 대하여 DPPH법에 의한 항산화 활성과 총페놀법에 의한 폴리페놀성 물질의 함유량을 측정한 결과, 감꼭지의 n-BuOH 분획물이 가장 우수한 항산화 활성을 나타내었다.
- 2. 항산화 활성 주성분을 규명하기 위하여 우수한 항산화 효과를 나타낸 감꼭지의 n-BuOH 분획물에 대하여 항산화 활성을 검토하면서 소분획을 실시한 결과, 가장 높은 항산화 효과를 나타낸 fraction 4와 fraction 5 및 fraction 6으로부터 각각 화합물 1, 화합물 2 및 화합물 3을 분리하였다.
- 26) 13C-NMR spectrum에서는 aromatic 영역에서 12개의 carbon peak와 aliphatic 영역에서 3개 등 총 15개의 carbon signal을 관찰 할 수 있었으며, C-3에 귀속되는 δ 67.7의 hydroxyl carbon signal을 확인할 수 있었다.
- 3. 분리된 화합물 1과 2, 3의 기기 분석치를 표준품 및 문헌치와 spectral data를 비교 분석한 결과 화합물 1은 quercetin으로, 화합물 2는 (+)-catechin으로, 화합물 3은 gallic acid로 동정하였다.
- 4. 감꼭지의 항산화 활성 주성분으로 단리된 quercetin, (+)-catechin 및 gallic acid에 대해 DPPH법에 의한 free radical 소거 효과를 실시한 결과, 모두 대조군인 α-tocopherol 보다는 우수하고, BHA와는 유사 또는 우수한 항산화 효과를 나타냄으로서 이들이 감꼭지의 항산화 활성 주성분임이 판명되었다.
- 항산화제는 크게 천연 항산화제와 합성 항산화제로 나누어지며, 천연 항산화제로는 식품의 가공 또는 저장 중 발생되는 산화를 방지하기 위하여 널리 사용되는 vitamin E, C 등으로서 이들은 안전성은 높으나 단독으로는 산화반응 저지능이 약하고 가격이 고가인 단점이 있다.8) 반면에 합성 항산화제인 butylated hydroxyanisole(BHA)과 butylated hydroxytoluene(BHT)은 효과는 우수하나 페놀계 합성 항산화제의 안전성 으로 인하여 그 사용이 점차 감소되고 있는 추세이다.9-11) 이에 천연물질이나 약용식물로부터 합성 항산화제를 대체할 수 있는 부작용이 적고 항산화 활성이 우수한 새로운 천연 항산화제의 개발 연구가 활발히 진행되고 있다.
- A-ring의 H-8과 H-6으로 귀속되는 δ 5.92와 5.85의 m-coupled doublet가 확인되었고, δ 4.56에서 Cring의 H-2 signal이 관찰되었으며 δ 3.99의 H-3과 coupling constant가 8.0 Hz로 관측됨으로서 trans coupling을 하고 있음을 알 수 있었다.
- 감꼭지의 항산화 활성 주성분으로 단리된 quercetin, (+)- catechin 및 gallic acid에 대해서도 항산화 활성을 DPPH법에 의해 실시한 결과 Table IV에 나타낸 것과 같이 quercetin, (+)-catechin 및 gallic acid 모두 대조군인 α-tocopherol 보다는 우수하고 BHA와는 유사 또는 우수한 항산화 효과를 보였다.
- 그 결과 Table III에 나타난 바와 같이 fraction 4, 5 및 6이 BHA보다는 약하나 α-tocopherol과는 유사한 항산화 활성을 보임으로서 항산화 활성 주성분 소분획물임을 확인할 수 있었다.
- 기존에 널리 알려진 천연 항산화제인 α-tocopherol과 합성 항산화제인 BHA를 대조군으로 하여 감꼭지의 용매별 분획물에 대하여 DPPH법에 의한 free radical 소거 작용 실험을 실시한 결과 Table I에 나타낸 바와 같이 감꼭지의 각 분획물들 가운데에서 n-BuOH 분획물이 가장 강력한 free radical 소거 효과를 나타내었다.
- 또한 1H-NMR spectrum에서 sp2 carbon 유래의 5개의 signal이 δ 6.19, 6.40, 6.89, 7.64, 7.74에서 관측되고, 이들 proton signal의 chemical shift, 분열패턴 및 coupling constant 값의 비교 분석과 TLC에서의 표준품과 비교 분석한 결과 화합물 1은 quercetin으로 추정할 수 있었다.
- 얻어진 화합물 1은 미황색 분말로 FeCl3 시험에서 녹색을, 아니스알데히드-황산시액에서 오렌지색을 나타내어 flavan 계 물질로 추정되었고, IR에서 수산기가 확인되고 UV에서 벤젠환의 존재를 확인할 수 있었다. 또한 1H-NMR spectrum에서 sp2 carbon 유래의 5개의 signal이 δ 6.
- 7의 hydroxyl carbon signal을 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 기존 문헌의 data27-29)와 비교하여 검토한 결과 화합물 2의 구조는 Fig. 1에 나타낸 것과 같이 (+)-catechin으로 동정할 수 있었다.
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