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문제 정의
- 본 연구는 33가지의 약용식물 추출물이 항염증 효과를 나타내는지를 관찰하였다. 염증반응을 인위적으로 일으키기 위해 Gram 음성균의 세포벽 성분인 LPS로 RAW 264.
- 본 연구에서는 약용작물로 빈번하게 활용되거나 약용으로 이용될 수 있는 식물자원들 중에서 문헌 및 특허검색을 통해 연구 및 실용화가 미흡한 것들을 선발하여 항염증활성에 대한 활성을 평가하므로서 향후 염증과 관련된 질환의 예방 및 치료제로의 활용 가능성을 알아보고자 하였는 바, 이를 위해 약용식물 추출물들이 lipopolysaccharide (LPS)로 처리한 RAW 264.7 cell에서 proinflammatory cytokine인 TNF-α, interleukin6 (IL-6)의 생성 그리고 iNOS, COX-2, inhibitor of nuclear factor kappa-B alpha (Iκ-Bα)의 발현에 미치는 영향과 peroxynitrite 생성에 대한 저해활성 등을 살펴보았다.
제안 방법
- 96-well microplate에 추출물이 최종농도가 10 ㎍/㎖이 되게 가하고, 90 mM NaCl, 5 mM KCl 및 100 mM diethylenetriaminepenta acetic acid와 10 mM dihydrorhodamine 123을 함유하는 sodium phosphate 완충액 (pH 7.4)를 가하였다. 그리고 50 mM의 3-morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN1)를 처리한 후 fluorescence microplate reader (Synergy HT, BIO-TEK, USA)로 excitation 500 ㎚ 및 emission 536 ㎚에서 측정하여 peroxynitrite의 제거능을 측정하였으며 결과는 SIN-1을 처리한 대조군의 결과에 대한 시료처리에 의해 나타나는 수치를 저해율 (%)로 환산하여 나타내었다.
- RAW 264.7 세포를 48-well plate에 5 × 105/well이 되도록 분주하고 16시간 배양하고 각 시험물질 (5 ㎍/㎖)과 100 ng/㎖ 농도의 LPS 로 동시 처리 또는 LPS를 단독 처리하여 4시간 (TNF-α) 혹은 24시간 (IL-6) 배양하였다.
- 7 세포를 6-well plate에 2 × 106/well이 되도록 분주하여 16시간 배양하고 Iκ-Bα의 분해정도를 관찰하기 위해서는 각 시험물질 5 ㎍/㎖을 첨가하여 2시간 전배양한 후, LPS를 100 ng/㎖ 의 농도로 처리하여 20분간 배양하였다. iNOS 및 COX-2의 발현정도를 관찰하기 위해서는 LPS (100 ng/㎖)와 각 시험물질을 (5 ㎍/㎖)을 동시에 처리한 후 18시간 배양하였다. 배양 후 세포는 냉각 PBS로 씻은 후, 세포를 100 ㎖의 세포 용해액 (200 mM Tris-HCl, pH 7.
- 그 후, Iκ-Bα, iNOS와 COX-2의 specific antibody를 이용하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. iNOS와 COX-2 발현 양은 horseradish peroxidase (HRP)가 붙어있는 secondary antibody로 실온에서 2시간 반응하고 chemiluminescence reagents (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)를 처리한 후 실시간화학 발광 및 형광영상장치 (Chemi-smart 2100, Vilber Lourmat, Italy)를 사용하여 이미지를 분석하였다.
- 각 시험물질을 최종농도 5 ㎍/㎖가 되게 처리하여 24시간 동안 배양한 후 Cell Titer 96®AQueous One Solution Assay를 이용하여 세포독성을 측정하였다.
- 4)를 가하였다. 그리고 50 mM의 3-morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN1)를 처리한 후 fluorescence microplate reader (Synergy HT, BIO-TEK, USA)로 excitation 500 ㎚ 및 emission 536 ㎚에서 측정하여 peroxynitrite의 제거능을 측정하였으며 결과는 SIN-1을 처리한 대조군의 결과에 대한 시료처리에 의해 나타나는 수치를 저해율 (%)로 환산하여 나타내었다. 또한, 1차 선발한 11개의 추출물에 대해서 1.
- 그리고 50 mM의 3-morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN1)를 처리한 후 fluorescence microplate reader (Synergy HT, BIO-TEK, USA)로 excitation 500 ㎚ 및 emission 536 ㎚에서 측정하여 peroxynitrite의 제거능을 측정하였으며 결과는 SIN-1을 처리한 대조군의 결과에 대한 시료처리에 의해 나타나는 수치를 저해율 (%)로 환산하여 나타내었다. 또한, 1차 선발한 11개의 추출물에 대해서 1.25, 2.5, 5.0 및 10.0 ㎍/㎖의 농도에서 peroxynitrite 소거능을 추가로 분석하였다 (Kooy et al., 1994 ).
- 또한, IκBα, iNOS 및 COX-2 단백질 발현양의 분석결과는 LPS 처리군 (염증유발군)의 결과를 1 fold로 환산하여 LPS 처리군에 비교한 각 시험물질의 효과를 fold로 나타낸 후 백분율로서 나타내었다.
- 먼저 99.9%의 에탄올에 용해한 12.5 mM DCFDA와 3차 증류수에 용해한 600 U/㎖ esterase를 −20℃에 stock solution으로 보관하면서 실험 시 DCFDA와 esterase를 혼합하여 조제된 2',7'-dichlorodihydrofluorescein (DCFH) 용액 (최종농도 0.125 mM DCFDA, 6 U/㎖ esterase) 2 ㎕를 취해 SIN-1 용액 (최종농도 50 mM) 190 ㎕ 및 시료 10 ㎕ (최종농도 12.5, 25, 50, 100 ㎍/㎖)를 함께 가하여 5분간 상온의 암소에서 교반한 후 interval time 5분, running time 30분으로 수차례 fluorescence (excitation wavelength 485 ㎚/emission wavelength 530 ㎚)를 측정하여 분당 ROS 발생량을 계산하여 IC50으로 나타내었다.
- 배양 후 상층액을 얻어, 세포 상층액 중으로 분비한 TNF-α와 IL-6를 enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) kit를 처리한 후 분광광도계 겸용 효소면역분석기로 분석하였으며 그 결과는 LPS 처리군 (염증 유발군)의 결과에 대한 시료처리에 의해 나타나는 수치를 저해율 (%)로 환산하여 LPS 처리군에 비교한 각 시험물질의 효과를 나타내었다.
- 각 시험물질의 최종농도가 5 ㎍/㎖이 되게 가하고 100 ng/㎖ 농도의 LPS로 동시 처리 또는 LPS를 단독 처리하여 18시간 배양하였다. 배양 후, 세포상층액을 얻어, 세포상층액 중으로 분비한 nitrite양을 Griess reagent system을 이용하여 측정하였다.
- 7 세포를 한국세포주은행으로 부터 분양받아 사용하였다. 세포배양은 DMEM에 10% FBS, 100 U/㎖ penicillin, 그리고 100 ㎎/㎖ streptomycin을 첨가한 것을 사용하였으며, 배양기를 이용하여 37℃와 5% CO2를 유지하였고 시험과정의 모든 세포는 70~80%의 confluence에서 실험하였고, 10 passages 이하의 세포만을 사용하였다.
- 염증반응을 인위적으로 일으키기 위해 Gram 음성균의 세포벽 성분인 LPS로 RAW 264.7 세포를 자극하였고 LPS로 염증반응을 유발하면서 각 약용식물 추출물을 5 ㎍/㎖의 최종농도가 되게 처리하여, 약용식물 추출물의 항염증효과를 다양한 염증매개물질, 즉 nitrite, TNF-α, IL-6의 분비량을 측정하고, 염증반응을 매개하는 주요 효소인 iNOS 및 COX-2의 발현 양, 염증반응의 핵심전인 신호전달분자인 Iκ-Bα의 분해정도를 관찰함으로 평가하였으며 10 ㎍/㎖의 농도에서 peroxynitrite에 대한 저해활성을 분석하였다.
- 항염증인자에 대한 식물추출물의 활성을 분석하기 위한 1차 검색 실험에는 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 각 식물자원 추출물을 5 ㎎/㎖의 농도로 용해하여 stock solution을 만든 후 반응계 중 시료의 최종농도가 5 ㎍/㎖이 되도록 가하였으며 선발된 11개의 식물추출물은 여러 농도로 조제한 후 peroxynitrite 및 ROS 소거능 분석을 위한 추가실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide (MTT), lipopolysacharide (LPS), 2',7'-dichlorofluorescine diacetate (DCFDA), 3-morpholinosyndnonimine hydrochloride (SIN-1) 및 tannic acid는 Sigma Co. (USA) 제품을 사용하였고 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 및 10% fetal bovine serum (10% FBS)는 Invitrogen (USA)의 제품을 사용하였다.
- 실험에 사용된 Agastache rugosa O. Kuntz (aerial part) 등 33점의 식물추출물은 농촌진흥청 식물자원추출물은행 (PJ007083201003 & PJ007437201003)에서 분양받아 사용하였다 (Table 1).
- 항염증효과 분석에는 대식세포주인 murine mouse macrophage cell line인 RAW 264.7 세포를 한국세포주은행으로 부터 분양받아 사용하였다. 세포배양은 DMEM에 10% FBS, 100 U/㎖ penicillin, 그리고 100 ㎎/㎖ streptomycin을 첨가한 것을 사용하였으며, 배양기를 이용하여 37℃와 5% CO2를 유지하였고 시험과정의 모든 세포는 70~80%의 confluence에서 실험하였고, 10 passages 이하의 세포만을 사용하였다.
데이터처리
- Cell proliferation, NO 생성에 대한 저해능, TNF-α 및 IL6 분비량 측정결과는 LPS 처리군 (염증유발군)의 결과에 대한 각 시험물질의 효과를 백분율로 나타내었으며, 각 결과는 means±SD로 나타 내었고 자료의 유의성은 GraphPad Prism 4.0 software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 이용하여 ANOVA-test를 통해 검정하였다.
이론/모형
- Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit는 eBioscience (San Diego, LA USA)의 것을, Iκ-Bα, iNOS, COX-2에 대한 특이항체는 horseradish peroxidase (HRP) attached secondary antibody는 Cell Signaling Technology (USA)의 것을 사용하였다.
- 선발된 11개의 시료에 대해 LeBel 등 (1992)의 방법에 따라 다음과 같이 total ROS 소거능을 측정하였다. 먼저 99.
- 식물자원 추출물의 NO 생성 저해정도의 분석은 Lee et al. (2007)의 방법에 따라 RAW264.7 세포를 48-well plate에 5 × 105/well이 되도록 분주하고 16시간 배양하였다.
성능/효과
- 33점의 식물추출물 중에서 선발된 11점의 시료에 대해서 활성산소원으로 SIN-1이 사용된 반응계에서의 total ROS에 대한 소거활성을 살펴본 결과, Table 4에 나타낸 바와 같이 대부분의 시료들의 IC50가 대조물질인 trolox의 IC50 (4.60 ± 0.11 ㎍/㎖)보다는 높았으나 대체적으로 우수한 소거활성을 나타내었으며 특히, Alpinia officinarum Hance의 근경은 8.55 ± 0.01 ㎍/㎖의 IC50을 나타냄으로써 11개의 시료 중에서 가장 좋은 활성을 보였다 (Table 4).
- chinensis Regel (flower)은 control (DMSO)에 비해 53.7~25.7%의 protein 함량을 나타내 Iκ-Bα의 분해를 저해하는 것을 확인할 수 있었다.
- japonica Nakai의 잎, Alpinia officinarum Hance의 근경은 5 ㎍/㎖의 비교적 낮은 농도에서도 각각 45.3 ± 4.1%, 38.8 ± 1.6%, 34.5 ± 4.5%를 나타내 이들 시료는 NO의 생성을 비교적 효과적으로 저해하는 것을 알 수 있었다 (Table 2).
- japonica Nakai의 잎이 각각 27.9 ± 3.4% 및 21.7 ± 1.7%로 효과적으로 염증반응으로 유도되는 TNF-α의 분비를 억제함을 관찰할 수 있었다 (Table 3).
- 7%의 protein 함량을 나타내 Iκ-Bα의 분해를 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 그리고, Ulmus arvifolia Jacq (trunk peel)과 Gastrodia elata Blume (root)는 LPS 유도된 대조군의 47.3~29.7%의 iNOS 발현 감소를 나타내었다. 이러한 1차 검색으로부터 선발된 11개 식물 추출물의 여러 농도에 대해 peroxynitrite 및 total ROS에 대한 저해활성을 추가로 살펴본 결과 peroxynitrite에 대해서는1.
- 7%로 Iκ-Bα의 분해를 억제하는 것을 관찰할 수 있었다 (Table 3, Fig 1). 그리고, iNOS발현에 대해서는 Cedrela sinensis A. Juss의 잎, Ulmus arvifolia Jacq의 수피, Gastrodia elata Blume의 뿌리가 대조에 비해 각각 56.8%, 47.3% 및 29.7%의 발현을 나타내 염증반응으로 유도되는 iNOS의 발현을 효과적으로 억제하였다 (Table 3, Fig. 2). 또한, 마우스 대식세포에 LPS를 처리하여 유도되는 COX-2의 발현에 미치는 33가지 약용식물 추출물의 영향을 조사한 결과, Lithospermum erythrorhizon Siebold et Zucc의 뿌리, Aster scaber Thunb.
- 식물자원 추출물의 생쥐 대식세포 RAW264.7에 대한 cell viability는 모든 시료에서 90% 이상의 높은 수치를 나타내었는데 특히, 2004년 채취된 Agastache rugosa O. Kuntz의 전초와 Crataegus pinnatifida Bunge의 열매는 각각 108.6 ± 0.7% 및 106.7 ± 3.4%의 비교적 높은 수치를 나타내었다 (Table 2).
- 실험된 33점의 식물 중에서 14개의 시료가 20% 이상의 NO 생성저해능을 나타내었고 그 외의 시료는 19.5 ± 3.7% 이하의 저해능을 나타내었다.
- 약용식물 추출물의 처리가 마우스 대식세포에서 LPS처리에의한 염증반응으로 유도된 Iκ-Bα의 분해에 미치는 33가지 약용식물 추출물의 영향을 조사한 결과, Alpinia officinarum Hance의 근경과 Citrus unshiu Markovich의 과피가 각각 34.9% 및 53.7%로 Iκ-Bα의 분해를 억제하는 것을 관찰할 수 있었다 (Table 3, Fig 1).
- 의 뿌리 (30.5 ± 5.5%) 등 6개의 시료가 30% 이상의 저해활성을 나타내 염증반응으로 유도되는 IL-6의 분비를 억제함을 관찰할 수 있었다 (Table 3).
- 이들 결과들을 종합할 때, 33가지의 약용식물 추출물중 Alpinia officinarum Hance의 근경, Inula britannica var. chinensis Regel의 꽃, Ulmus arvifolia Jacq의 수피 그리고 Aster scaber Thunb.
- 7%의 iNOS 발현 감소를 나타내었다. 이러한 1차 검색으로부터 선발된 11개 식물 추출물의 여러 농도에 대해 peroxynitrite 및 total ROS에 대한 저해활성을 추가로 살펴본 결과 peroxynitrite에 대해서는1.25 ㎍/㎖ 의 낮은 농도에서 Alpinia officinarum Hance (rhizome) 등 4개의 시료가 40% 이상의 비교적 우수한 저해효과를 보였으며, total ROS에 대해서는 Alpinia officinarum Hance (rhizome) 등 6개의 시료가 비교적 우수한 소거활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 의 지상부는 본 연구에서 분석된 염증관련 인자들에 대해서 효과적으로 작용하는 것으로 확인되었는 바, 차후 보다 다양한 농도에서 염증반응을 매개하는 iNOS 및 COX-2 등의 다양한 효소의 발현과 Iκ-Bα의 분해 등 염증반응의 신호전달물질의 변화를 관찰함으로써 항염증소재로의 가능성을 타진할 필요하다고 사료된다.
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