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문제 정의
- 본 연구에서는 陳皮 에탄올추출물의 콜라겐 유도 관절염 마우스에서의 항관절염 효과를 평가하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 등이 보고되고 있다. 본 연구에서는 陳皮의 에탄올추출물의 류마티스 관절염 동물모델인 콜라겐 유도 관절염(CIA) 마우스에서의 관절조직 손상과 관절활막 염증반응에 대한 억제효과를 확인함으로써 陳皮 에탄올추출물의 관절염 개선 효과를 확인하였다. 관절염 실험모델 중 콜라겐 유도 관절염(CIA) 마우스 모델은 가장 일반적으로 사용되는 대표적인 자가 면역성 관절염 모델로서 제2형 콜라겐(type Ⅱ collagen)을 주입함으로써 자가면역성이 유도되는 관절염 연구에 널리 이용되고 있는 류마티스 관절염 모델이다19).
- 이에 저자는 陳皮의 관절염에 대한 효과를 확인하기 위해 진피의 에탄올추출물을 제조하여 콜라겐 유입에 의해 관절염이 유발된 마우스(collagen-induced arthritis; CIA mice)에서의 항관절염 효과를 조사하였으며, 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- TNF-α의 측정은 3회 시행하여 평균값을 얻었으며, 여기에서 얻은 흡광도를 통해 TNF-α의 표준농도곡선에 대입하여 혈청 내 TNF-α의 농도를 계산하였다.
- 1점과 2점은 주로 가역성(reversible)의 부종성 염증(edematous inflammation)을 동반하며, 3점은 비가역성(irreversible)의 이미 관절염이 진행된 관절 강직(joint anklylosis)를 나타낸다. 관절염의 평가는 실험군과 대조군에 대해 알고 있지 않은 두 명의 관찰자가 참여하여 관찰자에 따른 오차를 최소화하였다.
- 관절염 실험모델 중 콜라겐 유도 관절염(CIA) 마우스 모델은 가장 일반적으로 사용되는 대표적인 자가 면역성 관절염 모델로서 제2형 콜라겐(type Ⅱ collagen)을 주입함으로써 자가면역성이 유도되는 관절염 연구에 널리 이용되고 있는 류마티스 관절염 모델이다19). 따라서 본 연구에서는 陳皮 에탄올추출물의 항류마티스 관절염 효과를 확인하기 위해 DBA/1J 마우스모델을 제작하여 사용하였다.
- 또한 14일 후 동일 방법으로 제조된 콜라겐 용액에 Freund's incomplete adjuvant를 동량으로 혼합하여 마우스의 뒷다리 족근골에 피하 주사함으로써 관절염을 유발하였다(Fig. 1).
- 모든 실험동물은 고형사료와 물을 제한 없이 공급하였으며, 일정한 온도(23±3℃)와 습도(50±10%) 및 12시간 낮과 밤의 주기를 유지하여 사육하였다.
- 실험군은 마우스 10마리를 한 군으로 하여 관절염을 유발시키지 않은 정상 대조군(normal control), 관절염을 유발시킨 대조군(CIA control) 및 陳皮 에탄올추출물을 투여한 약물군(CIA+CP-E) 및 대조약물로 비선택적 COX-2 억제제이며 항관절염 약물인 indomethacin을 투여한 약물 대조군(CIA+Indomethacin)으로 나누었다.
- 약물의 투여는 陳皮 에탄올추출물 50, 100 ㎎/㎏/body weight 또는 indomethacin 1 ㎎/㎏/body weight를 CIA 유발 후 28일부터 48일까지 28일 동안 매일 1회, 정해진 시간에 경구 투여하였으며, 49일에 모든 실험동물을 희생시켜 관절염 개선 정도를 평가하였다.
- 제작한 파라핀 조직표본은 xylene, 무수알코올, 50% 알코올 순으로 탈 파라핀 과정을 거친 후 Hematoxylin & eosin(H&E) 염색시약으로 염색하여 광학현미경 하에 관절조직의 형태변화를 관찰하였다.
- 에 의한 관절염 육안평가방법(rheumatoid scoring system)을 이용하여 평가하였다. 즉, 부종이나 발적, 종창 등 관절염의 증거가 없는 경우 0 (normal), 한 두 개의 발가락 종창을 동반한 홍조를 띄거나 최소한의 종창이 유발된 상태로 족근골이나 발목 관절에 국한된 경한 부종과 발적이 있는 경우 1점(slight swelling and/or erythema of the fingers), 확실한 홍조를 띄거나 국부적 상지 종창, 그리고 자유로이 발을 이용하지 못하는 상태, 발목 관절에서 족근골에 걸친 중증도의 부종과 발적이 있는 경우 2점(pronounced edematous swelling), 무릎까지의 상당한 부종과 종창이 관찰되고 자유로이 발을 이용하지 못하는 상태로 발목에서 발가락 전체에 걸쳐 부종과 발적이 있는 경우 3점(joint rigidity with edematous swelling or joint ankylosis)으로 하여 점수를 측정하였다. 1점과 2점은 주로 가역성(reversible)의 부종성 염증(edematous inflammation)을 동반하며, 3점은 비가역성(irreversible)의 이미 관절염이 진행된 관절 강직(joint anklylosis)를 나타낸다.
- 콜라겐 주입에 의해 관절염이 유발된 동물에서 나타나는 관절염의 발병도(clinical severity)에 대한 陳皮 에탄올추출물의 효과를 확인하기 위해 콜라겐 주입 후 28일부터 48일까지 매주 1회 관절염 지수(arthritis score)를 측정하였다.
- 콜라겐 주입에 의해 류마티스 관절염이 유발된 마우스에서 나타나는 족근관절의 손상에 대한 陳皮 에탄올추출물의 효과를 조사하기 위해서 관절조직을 H&E 염색하였다.
- 실험 49일째 모든 실험동물을 희생시킨 후 우측 족근관절이 포함되도록 경골 원위부에서 중족골(metatarsal) 원위부(distal) 사이를 적출하고 10% 중성 포르말린용액(formaldehyde)에 4℃에서 24시간 고정한 후 20% fermic acid에 3일간 침지하여 탈회하였다. 탈회된 조직을 24시간 수세하여 조직 내 남아있는 포르말린을 제거한 후, 50% 알코올에서부터 무수알코올까지 농도 상승순으로 탈수하고 자일렌(xylene)으로 치환하였다. 파라핀 침투과정을 거친 후 포매하여 파라핀 블록을 제작하였으며 회전형 박절기(microtome)를 사용하여 5 ㎛두께로 자른 뒤 슬라이드 위에 놓아 조직표본을 제작하였다.
- 탈회된 조직을 24시간 수세하여 조직 내 남아있는 포르말린을 제거한 후, 50% 알코올에서부터 무수알코올까지 농도 상승순으로 탈수하고 자일렌(xylene)으로 치환하였다. 파라핀 침투과정을 거친 후 포매하여 파라핀 블록을 제작하였으며 회전형 박절기(microtome)를 사용하여 5 ㎛두께로 자른 뒤 슬라이드 위에 놓아 조직표본을 제작하였다.
- 그 후 각 well에 peroxidaseconjugated antimouse IgG를 넣어 2시간 동안 반응시킨 후 5-aminosalicylic acid를 넣어 반응을 종료시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 항collagen 항체치 측정은 3회 시행하여 평균값을 얻었으며, 여기에서 얻은 흡광도를 anti-C Ⅱ IgG의 표준농도곡선에 대입하여 혈청 내 농도를 계산하였다.
대상 데이터
- 55 g이었다. 陳皮 에탄올추출물(CP-E, Voucher No. NCSHM 2011-CP)은 냉장 보관하면서 실험 전 멸균된 생리식염수에 완전히 용해한 후 membrane filter(0.45 ㎛)로 여과하여 실험약물로 사용하였으며 남은 시료는 냉동보관(-20 ℃) 하였습니다.
- 본 실험에 사용된 陳皮(Citrus unshiu Markovich, Citri Pericarpium; CP)는 2010년 10월 식약청 한약재과학화사업단의 안동대학교 손건호교수로부터 시료를 제공받아 사용하였다.
- 실험동물은 7~8주령의 DBA/1J계 수컷 마우스(mouse, 20~25 g)를 (주)오리엔트바이오(경기도, 한국)으로부터 구입하였다. 모든 실험동물은 고형사료와 물을 제한 없이 공급하였으며, 일정한 온도(23±3℃)와 습도(50±10%) 및 12시간 낮과 밤의 주기를 유지하여 사육하였다.
- 실험에 사용되어진 기기로는 Microplate Reader(Asys, Sunnyvale, CA, USA), Rotary Evaporator(Eyela, Japan), Orbital Shaker(Finemould Precision IN, Co., Gyenggi-do, korea), Microscopy(Olympus Imaging America Inc., Center Valley, PA 18034-0610, USA) 등을 사용하였다.
- 실험에 사용되어진 시약은 collagen(type Ⅱ, Sigma-Aldrich, St Louse, CA, USA), Complete Freund's adjuvant(Sigma-Aldrich), H&E stain kit(Thermo Fisher Scientific Inc., MA, USA), Collagen Type Ⅱ Antibody ELISA kit(MD Bioproduct, Division of MD Biosciences Inc., St Paul, MN, USA), DuoSet mTNF-α ELISA Development System(R&D System, Inc., MN, USA) 등을 사용하였다.
데이터처리
- 결과는 3회 반복실험에 대한 평균과 표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 통계학적 유의성 검증은 GraphPad Prism 5.0 분석프로그램의 one-way ANOVA, Tukey's test를 이용하였고, p값이 0.05 이하인 경우 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 발 관절염은 28일부터 48일까지 매주 1회 관찰하였으며, 관절염 정도(clinical severity)를 William 등22)에 의한 관절염 육안평가방법(rheumatoid scoring system)을 이용하여 평가하였다. 즉, 부종이나 발적, 종창 등 관절염의 증거가 없는 경우 0 (normal), 한 두 개의 발가락 종창을 동반한 홍조를 띄거나 최소한의 종창이 유발된 상태로 족근골이나 발목 관절에 국한된 경한 부종과 발적이 있는 경우 1점(slight swelling and/or erythema of the fingers), 확실한 홍조를 띄거나 국부적 상지 종창, 그리고 자유로이 발을 이용하지 못하는 상태, 발목 관절에서 족근골에 걸친 중증도의 부종과 발적이 있는 경우 2점(pronounced edematous swelling), 무릎까지의 상당한 부종과 종창이 관찰되고 자유로이 발을 이용하지 못하는 상태로 발목에서 발가락 전체에 걸쳐 부종과 발적이 있는 경우 3점(joint rigidity with edematous swelling or joint ankylosis)으로 하여 점수를 측정하였다.
- 콜라겐 주입에 의해 관절염이 유발된 동물에서 나타나는 콜라겐 항원에 대한 특이적 항체인 항콜라겐 항체에 대한 陳皮 에탄올추출물의 효과를 조사하기 위해서 ELISA 방법으로 혈청 내 anti-CⅡ IgG의 양을 측정하였다.
- 콜라겐 주입에 의해 관절염이 유발된 동물에서 다량 생성되는 염증사이토카인인 TNF-α에 대한 陳皮 에탄올추출물의 효과를 조사하기 위해서 ELISA 방법으로 혈청 내 TNF-α의 양을 측정하였다.
- 혈청 내 TNF-α의 양은 ELISA 방법으로 TNF-α ELISA kit를 이용하여 측정하였다.
- 혈청 내 항콜라겐 항체의 함량은 ELISA 방법으로 anti-C Ⅱ IgG ELISA kit를 이용하여 측정하였다. 즉 96 well polystyrene microplate(Nunc, Denmark)의 각 well에 0.
성능/효과
- 1. 陳皮 에탄올추출물은 콜라겐 유도 관절염 마우스에서 관절염 지수를 시간에 의존하여 감소시키는 경향을 나타냈다.
- 2. 陳皮 에탄올추출물은 콜라겐 유도 관절염 마우스의 혈청내 항콜라겐 항체와 염증사이코안인 TNF-α의 생성을 유의적으로 감소시켰다.
- 3. 陳皮 에탄올추출물은 콜라겐 유도 관절염 마우스의 관절조직 형태변형과 활막의 비후를 억제함으로써 관절조직을 보호하는 것으로 나타났다.
- 결론적으로 본 연구에서 陳皮 에탄올추출물은 콜라겐 유도 관절염 마우스에서 항콜라겐 항체 생성을 억제하고, 관절조직의 파괴와 손상을 줄이며, 관절 활막 내 염증반응을 유발하는 TNF-α의 분비를 억제함으로써 항관절염 효과가 있음을 확인하였다.
- 그 결과, CIA 대조군에서는 실험 28일부터 42일까지 관절염의 지수가 시간에 의존적으로 증가하였으나, 陳皮 에탄올추출물(CP-E)을 50, 100 ㎎/㎏ 농도로 경구 투여한 약물군은 CIA 대조군에 비해 감소되는 경향은 보였다(Fig. 1). 또한 양성대조약물인 Indomethacin 투여군에서도 CIA 대조군에 비해 유의적으로 관절염 지수가 감소되었다.
- 그 결과, 정상대조군에서는 5.59±1.28 units/㎖, CIA 대조군에서는 51.58± 0.88 units/㎖, 陳皮 에탄올추출물(CP-E)을 50과 100 ㎎/㎏ 투여한 군에서는 각각 40.02±0.17 units/㎖, 40.04± 0.16 units/㎖로 陳皮 에탄올추출물 투여군은 대조군에 비하여 모두 유의적으로 감소하였다(Fig. 2).
- 그 결과, 정상대조군에서는 8.02±0.80 pg/㎖, CIA 대조군에서는 56.37± 4.03 pg/㎖, 陳皮 에탄올추출물(CP-E)을 50과 100 ㎎/㎏ 투여한 군에서는 각각 44.26± 5.44 pg/㎖, 41.09± 6.64 pg/㎖으로 陳皮 에탄올추출물 50, 100 ㎎/㎏ 투여군에서 대조군에 비하여 TNF-α가 유의적으로 감소하였다(Fig. 3).
- 따라서 陳皮 에탄올추출물은 콜라겐 유도 관절염 마우스에서 항관절염 효과가 있는 것으로 나타났으며, 이는 진피가 사람의 관절염 개선에 도움을 될 수 있음을 의미한다.
- 먼저, 마우스의 족근관절의 형태변화를 관찰한 결과, 대조군(CIA)에서는 특이적으로 관절 주위의 부종과 다형 백혈구, 림프구 등의 침윤이 현저하게 관찰되었으며 활막의 염증(synovial inflammation), 비후와 더불어 현저한 관절면의 연골손실(bone erosion)을 관찰할 수 있었다(Fig. 4). 이에 반하여 陳皮 에탄올추출물(CP-E)을 50 ㎎/㎏과 100 ㎎/㎏ 투여한 군에서는 대조군에 비해서 염증세포의 침윤과 활막의 비후가 억제되었으며, 관절면의 연골 손실이 줄어들었고, 골 파괴가 개선되었으며 염증세포의 침윤과 활막의 비후가 억제되는 것이 관찰되었다.
- 본 연구에서 陳皮 에탄올추출물은 CIA 마우스의 혈청 내 주요 염증사이토카인인 TNF-α의 생성을 유의적으로 감소시켰으며 이는 陳皮 에탄올추출물이 관절염의 염증반응을 유발하는 TNF-α의 생성을 억제함으로써 활막염의 발생과 진행을 막을 수 있음을 의미한다.
- . 본 연구에서 陳皮 에탄올추출물은 CIA 마우스의 혈청 내 항콜라겐 항체의 생성을 유의적으로 감소시켰으며, 이는 陳皮가 류마티스 관절염 발달 시 자가항체 생산 반응을 조절함으로써 질환의 발달을 막을 수 있음을 의미한다.
- 본 연구의 관절조직 H&E 염색에서 陳皮 에탄올추출물은 CIA 마우스의 족근 관절 주위의 부종과 다형 백혈구, 림프구 등의 침윤을 막고 활막의 염증과 비후를 억제하였으며, 관절면의 연골손실을 줄임으로써 관절염을 개선시키는 효과를 나타내었다.
- 4). 이에 반하여 陳皮 에탄올추출물(CP-E)을 50 ㎎/㎏과 100 ㎎/㎏ 투여한 군에서는 대조군에 비해서 염증세포의 침윤과 활막의 비후가 억제되었으며, 관절면의 연골 손실이 줄어들었고, 골 파괴가 개선되었으며 염증세포의 침윤과 활막의 비후가 억제되는 것이 관찰되었다.
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