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문제 정의
- 본 연구에서는 국내 조제 분유 8종과 외국의 조제분유 3종을 구입하여 이들의 지방산 조성 및 sn-2 위치별 지방산 조성 분석을 통해서 국내산 조제분유와 외국의 조제분유에 함유되어 있는 지방의 조성을 비교하였다. 그리고 HPLC를 이용하여 모유지방에서의 대표적인 지방 형태인 sn-2 위치에 포화지방산으로 구성되어 있고, sn-1,3 위치에는 단일불포화지방산으로 구성되어 있는 단일불포화-포화-단일불포화 대칭형 TAG 분자들의 정성 분석을 수행하여 분석된 조제분유에 존재하는 TAG분자 형태를 고찰하고자 하였다.
- 한편, 장쇄 다가 불포화지방산인 arachidonic acid(AA) 및 docosahexaenoic acid(DHA) 등의 기능성 유지들을 첨가하여 건강기능성을 부여하는 제품들도 개발되어 나오고 있다(14-17). 본 연구에서는 국내 조제 분유 8종과 외국의 조제분유 3종을 구입하여 이들의 지방산 조성 및 sn-2 위치별 지방산 조성 분석을 통해서 국내산 조제분유와 외국의 조제분유에 함유되어 있는 지방의 조성을 비교하였다. 그리고 HPLC를 이용하여 모유지방에서의 대표적인 지방 형태인 sn-2 위치에 포화지방산으로 구성되어 있고, sn-1,3 위치에는 단일불포화지방산으로 구성되어 있는 단일불포화-포화-단일불포화 대칭형 TAG 분자들의 정성 분석을 수행하여 분석된 조제분유에 존재하는 TAG분자 형태를 고찰하고자 하였다.
제안 방법
- Gas chromatograph(GC, Hewlett-Packard 6890 series, Avondale, PA, USA)를 이용하여 지방산 조성을 분석하였 다. 사용된 methylation 방법은 다음과 같다.
- TAG의 분리는 silver ion column(ChromSpher 5 lipids 250×4.6 mm i.d., Varian, Middelburg, Netherlands)에서 이루어졌고, 검출기 는 evaporative light scattering detector(ELSD, SEDEX Model 75, Sedere, Alfortvill, France)로써 온도는 40oC, N2 유속은 2.2 bar 조건 하에서 검출하였다.
- 2 μm, film thickness, Supelco, Bellefonte, PA, USA) 이었고, 검출 기는 flame ionized detector(FID)를 사용하였다. 분석에 사 용된 검출기 온도는 280oC이었고 주입부 온도는 250oC이었 으며, GC oven은 150oC(5 min)에서 220oC(40 min)까지 승온 (4oC/min)시켜 총 62.5분간 분석하였다. Split ratio는 1/50이 며 mobile phase는 nitrogen gas로써 1 mL/min로 흐르게 하였다.
- 분석은 25 mL vial에 시료 5 mg을 취하고 15 mL의 hexane에 희석한 후에 PTFE syringe filter를 사용하여 여과한 후 10 μL를 auto sampler 와 dual pump(SP930D, Younglin, Anyang, Korea)가 장착 된 HPLC(Acme, Younglin)에 주입하였다.
- 시료에서 지방을 추출하기 위해서 수분의 존재 유무에 영 향을 받지 않고 지방을 추출할 수 있는 Folch 법을 이용하였 다. 시료 5 g과 chloroform과 methanol(2:1, v/v)을 혼합한 용매 25 mL을 균질화 하여서 1:5(w/v)를 비율로 진탕시킨 후에 sonicator에서 30oC에서 30분간 추출을 하였고, filter paper(Whatman no.4)를 이용하여 불순물을 제거하였다. 이 후 0.
- 시료에서 추출한 지방의 TAG 조성을 알아보기 위해서 normal-phase high-performance liquid chromatography (NP-HPLC) 분석을 수행하였다. 분석은 25 mL vial에 시료 5 mg을 취하고 15 mL의 hexane에 희석한 후에 PTFE syringe filter를 사용하여 여과한 후 10 μL를 auto sampler 와 dual pump(SP930D, Younglin, Anyang, Korea)가 장착 된 HPLC(Acme, Younglin)에 주입하였다.
- 시료에서 추출한 지방의 sn-2 위치 지방산 조성을 알아보 기 위해서 pancreatic lipase(from hog pancreas, Sigma, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 시료를 가수분해 하였다. 시 료에서 추출한 지방을 7 mg을 취하고 1 M Tris-HCl buffer (pH 7.
- 시중에 유통되고 있는 조제분유의 지방산 및 TAG 조성 을 알아보기 위하여 국내외 조제분유 총 11 품목을 선정하였 고, Folch법을 이용하여 지방을 추출한 다음 총 지방산과 sn-2 위치의 지방산 및 silver ion HPLC를 이용한 단일불포 화-포화-단일불포화 glycerol(MSM)의 조성을 분석하였다. 조제분유의 조지방의 함량은 17.
- Silver ion column을 이용하여 TAG분자들을 분석하게 되면 위치에 따른 이중 결합의 수와 이성체로 분리되기 때문 에 TAG분자들이 PPP/SSS(포화-포화-포화, SSS), POP/ SOS(포화-단일불포화-포화, SMS), PPO/SSO(포화-포화 -단일불포화, SSM), POO/SOO(포화-단일불포화-단일불 포화, SMM), OPO/OSO(단일불포화-포화-단일불포화, MSM), OOO(단일불포화-단일불포화-단일불포화, MMM) 로 분리될 수 있다(P=palmitic acid, S=stearic acid, O=oleic acid). 이와 같은 분석을 통해서 palmitic acid와 stearic acid 등과 같은 포화지방산들의 TAG에서의 위치 분포와 모유지 방을 구성하고 있는 TAG분자들의 특징인 1,3-단일불포화 -2-포화지방산으로 구성된 대칭형 TAG(MSM)의 조성을 알아보았다(Fig. 1). 분석한 TAG 조성에서 모유 지방의 특 성인 PN=48/50인 MSM(OPO/OSO)의 peak는 전반적으로 작은 것을 알 수 있었다.
- 이후 diethyl ether(3 mL)를 첨 가하여 상층액만을 분리하여 sodium sulfate column으로 수 분과 불순물을 제거한 후, 질소로 농축된 시료를 TLC silica plate(silica gel 60 F254, 20×20 cm, Merck KGaA, Darmstadt, Germany)에 부피비 전개용매(hexane : diethyl ether : acetic acid＝50:50:1)를 이용하여 TLC tank 내에서 전개 하였다(18). 전개 후 monoacylglycerol(MAG)인 부분만을 취하여 위의 지방산 조성 분석과 같은 방법으로 GC 분석을 실시하였다.
대상 데이터
- Pancreatic lipase(Type Ⅱ, crude)는 Sigma-Aldrich Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, fatty acid methyl ester 표준물질은 Nu-Check Prep, Inc. (Elysian, MN, USA)에서 구입한 것을 사용하였으며, 모든 기기분석에 사용된 용매는 HPLC grade이었다.
- 5, v/v)이었고, 1 mL/min 유속으 로 70분간 등용리로 분석하였다(19). Peak identification을 위해서 1,3-dioleoyl-2-palmitoyl-glycerol(Sigma-Aldrich) 과 1,2-dioleoyl-3-palmitoyl-glycerol(Sigma-Aldrich)를 구입하여 사용하였다. 분석한 TAG의 partition number(PN) 는 아래의 식을 이용하여 계산하였다.
- 본 연구에서 분석된 시료들은 국내제품 8종, 미국제품 2종 및 일본제품 1종이었다. 국내 제품은 2008년 8월에서 9월 중에 제조된 유아용 조제분유들로써 대형마트에서 구입하 였다. 미국 및 일본 제품은 온라인 매장을 통해서 구입하였 다.
- 국내 제품은 2008년 8월에서 9월 중에 제조된 유아용 조제분유들로써 대형마트에서 구입하 였다. 미국 및 일본 제품은 온라인 매장을 통해서 구입하였 다. Pancreatic lipase(Type Ⅱ, crude)는 Sigma-Aldrich Chemical Co.
- 본 연구에서 분석된 시료들은 국내제품 8종, 미국제품 2종 및 일본제품 1종이었다. 국내 제품은 2008년 8월에서 9월 중에 제조된 유아용 조제분유들로써 대형마트에서 구입하 였다.
- 분석에 사용된 column은 SP-2560 (biscyanopropyl polysiloxane, 100 m×0.25 mm×0.2 μm, film thickness, Supelco, Bellefonte, PA, USA) 이었고, 검출 기는 flame ionized detector(FID)를 사용하였다.
데이터처리
- 2000 Statistical Analysis System S/W Package(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 각 데이터간의 유의성을 Duncan's Multiple Range test로 5% 수준에서 검증하였다(20)
- 데이터의 통계 처리를 위하여 각 시료를 2회 이상의 반복 측정을 하였다. 2000 Statistical Analysis System S/W Package(SAS Institute Inc.
- Split ratio는 1/50이 며 mobile phase는 nitrogen gas로써 1 mL/min로 흐르게 하였다. 분석하여 얻어진 크로마토그램의 peak는 표준물질 의 머무름 시간과 비교하여 확인하였다.
이론/모형
- 시료에서 지방을 추출하기 위해서 수분의 존재 유무에 영 향을 받지 않고 지방을 추출할 수 있는 Folch 법을 이용하였 다. 시료 5 g과 chloroform과 methanol(2:1, v/v)을 혼합한 용매 25 mL을 균질화 하여서 1:5(w/v)를 비율로 진탕시킨 후에 sonicator에서 30oC에서 30분간 추출을 하였고, filter paper(Whatman no.
성능/효과
- 97%로 가장 낮게 나타났다. Omega-6 다가불포화 지방산과 omega-3 다가불포화 지방산의 주요한 지방산은 필수지방산인 linoleic acid(C18:2)와 linolenic acid(C18:3, n-3)로써 분석된 조제분유들의 linoleic acid 함량은 16.72 ～25.87%의 범위였으며 K1이 25.87%로 가장 높은 함량을 나타냈고, K3가 16.72%로 가장 낮은 함량을 나타냈다. Linolenic acid의 함량의 경우 1.
- 74%보다 낮은 수치를 나타냈는데 이는 F2를 구성 하는 TAG의 sn-1,3 위치에 주로 palmitic acid가 존재함을 의미한다. 따라서 분석된 조제분유 중에서 K8과 F3이 다른 시료들보다 모유 지방의 특성에 가장 가까웠다. 불포화지방 산의 경우, sn-2 위치의 oleic acid 함량은 1.
- 28% 로써 다른 시료들보다 낮은 함량을 보였다. 따라서 위치별 지방산 조성의 분석 결과로부터 대부분의 국내외 조제분유 들은 모유와 비교하였을 때 특히 sn-2위치의 palmitic acid 함량이 낮은 경향을 보임을 알 수 있었다(Table 3).
- 54%로써 비교적 낮은 함량을 나타냈는데 이는 myristic acid가 sn-2 위치보다는 sn-1,3 위치에 더 많이 존재하는 것을 의미한다. 또한, F1과 F2에서도 myristic acid의 함량은 각각 3.82%와 3.15%로써 다른 시료들과 비교하였을 때 낮은 함량을 나타 내었는데 이들의 총 지방산 조성에서도 5.47%와 4.37%의 낮은 함량을 나타냈다. 따라서 이들 시료들도 myristic acid 가 sn-2 위치보다는 sn-1,3 위치에 위치하는 것을 의미한다.
- 모유지방의 특징인 MSM 대칭형 TAG의 경우 대부분의 분석된 시료들에서 많은 양으로 존재 하지는 않았으나 F3의 경우 다른 시료들보다 MSM peak가 높게 나타났다.
- 분석된 조제분유 들의 주요 포화지방산은 lauric acid(C12:0), myristic acid (C14:0), palmitic acid(C16:0), stearic acid(C18:0)이었다. 분 석된 조제분유 중에서 lauric acid의 함량은 6.5～23.34%로 K6가 23.34%로 가장 높은 함량을 나타난 반면 F3에서는 6.5%로 가장 낮은 함량을 나타냈다. Van Seeventer와 Systermans(21)에서 제시한 조제분유의 지방산 조성에 대한 지 표에 따르면 lauric acid의 함량은 총지방의 약 15%인데, K5 와 K6의 lauric acid 함량은 19.
- 한편, 총 지방산 조성에서 oleic acid 의 함량이 높았던 K3과 F1의 경우에서 PN=48인 MMM (OOO)의 peak가 크게 나타났고 이는 triolein을 많이 함유하 고 있는 식물성 유지가 사용되었기 때문이라고 생각된다. 분석된 11개의 조제분유들에서 PN=54/48인 SSS(PPP/SSS) 형태의 TAG가 가장 많이 존재하였고, 이외 1몰의 단일불포 화지방산과 2몰의 포화지방산으로 구성된 PN=48/52인 SMS, SSM이 주로 존재하였다. 모유지방의 특징인 MSM 대칭형 TAG의 경우 대부분의 분석된 시료들에서 많은 양으로 존재 하지는 않았으나 F3의 경우 다른 시료들보다 MSM peak가 높게 나타났다.
- 59%)는 보고된 범위보다 낮은 함량을 나타 냈다. 분석된 시료들의 stearic acid (C18:0)의 함량은 2.61～ 8.23%의 범위로써 F3이 8.23%로 가장 높은 함량을 나타냈 고, F1이 2.61%로 가장 낮은 함량을 나타냈다.
- 64%의 함량을 보여 다른 조제분유보다 비교 적 낮은 함량을 나타냈다. 분석된 시료들의 총 다가불포화지 방산은 19.08～29.67%의 범위를 나타냈는데 K1이 29.67%로 써 가장 높은 함량을 나타냈으며, K3가 19.08%로써 가장 낮게 나타났다. 특히, omega-3 다가불포화지방산은 K7, K8 이 각각 2.
- 시료인 조제분유의 sn-2 위치 지방산 조성이 모유지방의 독특한 sn-2 위치 지방산 조성과 비교하기 위하여 Table 3에 나타내었다. 분석된 조제분유들 중에서 sn-2 위치에서 의 lauric acid 함량은 7.70～52.09%의 범위이었고, K5와 K6 가 각각 52.09%와 48.24%로써 높은 함량을 나타내었는데 이는 총 지방산 조성에서의 lauric acid가 sn-1,3 위치보다는 sn-2 위치에 존재한다는 것을 의미한다. Myristic acid의 함 량의 경우 3.
- 분석된 조제분유들의 주요 포화지방산은 lauric acid(C12:0), myristic acid(C14:0), palmitic acid(C16: 0), stearic acid(C18:0)이었다.
- 07%로 나타났고, 단일불포화지방산들 중에서 대부분을 구성하고 있는 지방산은 oleic acid(C18:1)이었다. 분석된 조제분유에 서 oleic acid의 함량은 19.64～44.64%의 범위였고 총 다가불 포화지방산은 19.08～29.67%의 범위였다. Omega-6 다가불 포화지방산과 omega-3 다가불포화지방산의 주요한 지방산 은 필수지방산인 linoleic acid(C18:2)와 linolenic acid(C18:3, n-3)로 분석된 조제분유의 비율은 10:1～13:1로, 조제분유의 지방산 조성에 대한 지표인 linoleic acid/linolenic acid의 비 율인 5:1～15:1 범위 내였다.
- 단일 불포화지방산들 중에서 대부분을 구성하고 있는 지방산은 oleic acid(C18:1)이었다. 분석된 조제분유에서 oleic acid의 함량은 19.64～44.64%의 함량으로 나타났다. Jensen(22)의 모유의 지방산 연구에서 모유에서의 oleic acid의 함량은 22.
- 조제분유를 모유 의 지방산 조성에 근접하게 하기 위해서는 palmitic acid의 함량 또한 모유에 근접해야 한다. 분석된 조제분유의 palmitic acid의 함량 범위는 7.59～21.65%로써 Jensen(22)의 모유 지방산 조성 연구에 보고된 바와 같이 모유에서의 palmitic acid(C16:0)의 함량인 19.3～25.1%의 범위에는 K7 (19.54%), K8(19.64%), F2(21.65%), F3(20.05%)이 보고된 범위의 수치를 나타냈고, K2(14.64%), K3(8.29%), K6 (13.47%), F1 (7.59%)는 보고된 범위보다 낮은 함량을 나타 냈다. 분석된 시료들의 stearic acid (C18:0)의 함량은 2.
- 1). 분석한 TAG 조성에서 모유 지방의 특 성인 PN=48/50인 MSM(OPO/OSO)의 peak는 전반적으로 작은 것을 알 수 있었다. 한편, 총 지방산 조성에서 oleic acid 의 함량이 높았던 K3과 F1의 경우에서 PN=48인 MMM (OOO)의 peak가 크게 나타났고 이는 triolein을 많이 함유하 고 있는 식물성 유지가 사용되었기 때문이라고 생각된다.
- Omega-6 다가불 포화지방산과 omega-3 다가불포화지방산의 주요한 지방산 은 필수지방산인 linoleic acid(C18:2)와 linolenic acid(C18:3, n-3)로 분석된 조제분유의 비율은 10:1～13:1로, 조제분유의 지방산 조성에 대한 지표인 linoleic acid/linolenic acid의 비 율인 5:1～15:1 범위 내였다. 분석한 조제분유들 중에서 sn-2 위치에서의 lauric acid 함량은 7.70～52.09%로 나타났 고, myristic acid의 함량은 3.15～20.89%로써 분석된 조제 분유들은 전반적으로 sn-2 위치에서의 lauric acid 함량이 20% 이상으로 높게 나타났다. 특히, 분석된 조제분유들의 sn-2 위치에 존재하는 palmitic acid의 함량은 1.
- 따라서 분석된 조제분유 중에서 K8과 F3이 다른 시료들보다 모유 지방의 특성에 가장 가까웠다. 불포화지방 산의 경우, sn-2 위치의 oleic acid 함량은 1.71～50.36%의 범위를 나타냈는데 K3, F1과 F2에서 각각 50.36%, 50.14% 와 48.06%의 함량을 보여 분석된 조제분유들 중에서 비교적 높았고 보고된 모유지방의 sn-2 위치에 존재하는 oleic acid 함량과 비교하여도 높은 수치이었다. K5는 sn-2 위치의 oleic acid의 함량이 1.
- 따라서 대부분의 국내외 조제분유들을 구성하 는 triacylglycerol(TAG)의 sn-2 위치에서의 palmitic acid 함량이 모유와 비교하였을 때 낮은 경향을 보임을 알 수 있 었다. 이러한 조제분유보다 더 나아가 HPLC 분석을 통해서 모유의 주요 TAG 형태라고 할 수 있는 단일불포화-포화단일불포화 glycerol(MSM)의 함량이 외국의 조제분유인 F3이 가장 높게 나타났다. 따라서 조제분유에 이러한 MSM 형태의 지방 함량을 높여야하며, MSM 형태의 모유대체지 연구를 산업화하려는 노력이 필요하다.
- 시중에 유통되고 있는 조제분유 11종을 구입하여 지방을 추출한 결과로 얻은 조지방 함량은 Table 1에 나타내었다. 조제분유의 조지방 함량은 17.21～23.51%이었고, K5의 조 지방 함량이 23.51%로써 분석된 조제분유들 중에서 가장 높았으며, K1은 17.21%로써 가장 낮게 나타났다. 분석된 조 제분유들의 30종의 지방산 조성은 Table 2에 나타내었다.
- 시중에 유통되고 있는 조제분유의 지방산 및 TAG 조성 을 알아보기 위하여 국내외 조제분유 총 11 품목을 선정하였 고, Folch법을 이용하여 지방을 추출한 다음 총 지방산과 sn-2 위치의 지방산 및 silver ion HPLC를 이용한 단일불포 화-포화-단일불포화 glycerol(MSM)의 조성을 분석하였다. 조제분유의 조지방의 함량은 17.21～23.51%이었고, 특히 K5의 조지방 함량이 23.51%로써 분석된 조제분유들 중에서 가장 높게 나왔으나, K1은 17.21%의 함량을 보이면서 가장 낮게 나타났다. 분석된 조제분유들의 주요 포화지방산은 lauric acid(C12:0), myristic acid(C14:0), palmitic acid(C16: 0), stearic acid(C18:0)이었다.
- 분석된 조 제분유들의 30종의 지방산 조성은 Table 2에 나타내었다. 총포화지방산의 함량은 K5가 57.63%로써 분석된 조제분유 들 중에서 가장 높게 나타난 것에 반해 F1의 총 포화지방산 의 함량은 34.40%로 가장 낮게 나타났다. 분석된 조제분유 들의 주요 포화지방산은 lauric acid(C12:0), myristic acid (C14:0), palmitic acid(C16:0), stearic acid(C18:0)이었다.
- 89%로써 분석된 조제 분유들은 전반적으로 sn-2 위치에서의 lauric acid 함량이 20% 이상으로 높게 나타났다. 특히, 분석된 조제분유들의 sn-2 위치에 존재하는 palmitic acid의 함량은 1.84～38.74% 의 범위로써 K8과 F3이 각각 38.55%와 38.90%의 높은 함량 을 나타냈다. 따라서 대부분의 국내외 조제분유들을 구성하 는 triacylglycerol(TAG)의 sn-2 위치에서의 palmitic acid 함량이 모유와 비교하였을 때 낮은 경향을 보임을 알 수 있 었다.
- 50%에 비해서 낮은 함량을 나타냈는데, 이는 oleic acid의 많은 부분이 sn-1,3 위치에 존재한다는 것을 의미한다. 필수지방산인 linoleic acid 함량 은 0.66～22.81%의 범위로써 K1, K2와 K7가 각각 20.01%, 22.81%와 21.04%를 보이면서 분석된 조제분유들 중에서 비 교적 높게 나타났으나, K4, K5, K8은 4.55%, 0.66%와 6.28% 로써 다른 시료들보다 낮은 함량을 보였다. 따라서 위치별 지방산 조성의 분석 결과로부터 대부분의 국내외 조제분유 들은 모유와 비교하였을 때 특히 sn-2위치의 palmitic acid 함량이 낮은 경향을 보임을 알 수 있었다(Table 3).
- 한편, 분석된 조제분유들의 sn-2 위치의 palmitic acid 함 량은 1.84～38.74%의 넓은 범위를 보였는데 분석된 시료들 중 K8과 F3이 각각 37.95%와 38.74%의 높은 함량을 나타냈 으며, 이는 이들 시료의 많은 palmitic acid가 sn-2 위치에 존재하는 것을 의미한다. 반면에 F1의 경우, 총 지방산 조성 에서의 palmitic acid의 함량은 7.
- 34%로 분석되어 15%보다 높은 함량을 나타냈다. 한편, 분석된 조제분유의 palmitic acid의 함량은 7.59～21.65%의 범위로써 K2, K3, K6, F1에서 각각 14.64%, 8.29%, 13.47% 및 7.59%로써 낮은 함량을 나타냈다. 불포화 지방산들 중에서 단일불포화지방산(C14:1, myristoleic acid; C16:1, palmitoleic acid; C17:1, heptadecenoic acid; C18:1, oleic acid; C18:1t, elaidic acid)의 함량은 20.
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