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문제 정의
- 그러므로 본 연구에서는 황련해독탕 물추출물이 뇌출혈에 의한 뇌부종에 미치는 영향과, 뇌부종에 관여하는 주요인자인 AQPs 발현에 대한 작용을 관찰하고자 하였다. 흰쥐의 선조체 내에 콜라겐분해효소 (collagenase)를 주입하는 방법으로 뇌출혈을 유발하였고, 황련해독탕 물추출물을 경구투여한 후 뇌출혈 크기와 이에 따른 호중성백혈구의 침윤, 뇌부종 비율과 뇌조직 수분함량 등에 대한 영향을 관찰하였으며, 뇌부종 발생에 관여하는 인자인 AQP4와 AQP9 발현의 변화를 관찰한바 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
- 그러므로 본 연구에서는 황련해독탕 물추출물이 뇌출혈에 의한 뇌부종에 미치는 영향과, 뇌부종에 관여하는 주요인자인 AQPs 발현에 대한 작용을 관찰하고자 하였다. 흰쥐의 선조체 내에 콜라겐분해효소 (collagenase)를 주입하는 방법으로 뇌출혈을 유발하였고, 황련해독탕 물추출물을 경구투여한 후 뇌출혈 크기와 이에 따른 호중성백혈구의 침윤, 뇌부종 비율과 뇌조직 수분함량 등에 대한 영향을 관찰하였으며, 뇌부종 발생에 관여하는 인자인 AQP4와 AQP9 발현의 변화를 관찰한바 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
- 이렇게 황련해독탕과 그 구성 약재들에 대한 다양하게 연구가 이루어져 왔으나 뇌출혈과 뇌부종에 대한 효과에 대해서는 아직 보고된 바가 없었다. 그러므로 본 연구에서는 황련해독탕 물추출물이 뇌출혈에 의한 뇌부종에 미치는 영향을 살펴보고, 뇌부종 형성에 관여하는 것으로 알려진 AQPs 발현에 미치는 작용을 관찰하고자 하였다.
- 본 실험에서는 황련해독탕이 뇌부종에 미치는 영향을 관찰하기 위해 뇌부종 비율의 변화와 뇌조직 수분함량의 변화를 측정하였다. 뇌부종의 비율적 변화를 보기 위해 뇌출혈 흰쥐에 황련해독탕 물추출물을 투여한 후 정상측 대뇌반구에 대한 출혈측 대뇌반구의 면적 증가율을 계산하였으며, 그 결과 ICH48+HHT군은 ICH48군에 비해 유의성 있는 뇌부종 비율의 감소를 나타내었다(Fig.
- 본 연구에서는 황련해독탕이 AQP4와 AQP9의 발현에 미치는 영향을 면역조직화학염색을 통해 관찰하였다. 그 결과 뇌조직내출혈이 유발된 대뇌반구의 뇌출혈 주변부에서 강한 AQP4 양성반응을 나타내는 세포들이 많이 관찰된 것에 비해 ICH48+HHT군에서는 AQP4 양성반응 세포들의 발현 강도와 세포 수가 ICH48군에 비하여 현저히 감소되었다.
- 본 연구에서는 황련해독탕이 뇌출혈에 의한 뇌부종과 뇌부종 형성에 중요한 역할을 하는 aquaporin 발현에 미치는 영향을 관찰하였다. 이를 위해 흰쥐의 선조체에 collagenase를 주입하여 뇌출혈에 의한 뇌부종을 유발하였으며, 황련해독탕 물추출물을 경구투여한 후 뇌출혈 부위의 크기와 호중성백혈구 침윤의 변화, 뇌부종의 비율, 뇌조직 수분함량 등에 대한 영향을 관찰하였으며, 뇌부종 발생에 관여하는 주요 인자인 AQP4와 AQP9 발현의 변화를 면역조직화학 염색을 통해 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
제안 방법
- 본 실험에 사용한 한약물은 황련해독탕 Hwangnyeonhaedok-tang(HuanglianJiedu-tang, HHT)으로 (주)허브메디에서 구입한 황련(Coptidis rhizoma), 황금(Scutellariae radix), 황백(Phellodendri cortex), 치자(Gardeniae fructus) 각 5 g으로 구성하였으며, 총 200 g의 약재에 3,000 ml의 물을 가하여 90분간 전탕하고, 여과액을 rotary evaporator로 감압 농축한 후 동결건조 하였다. 추출물 30.5 g을 얻어 수율은 15.3% 이었으며, 1,000 mg/kg을 실험동물의 1회 투여량으로 하여 뇌출혈 유발 4시간 후부터 약 20시간 간격으로 3회 경구투여하였다.
- 두개골의 bregma로부터 전방으로 0.2 mm, 우측으로 3.5 mm 위치에 전기드릴을 사용하여 약 1 mm 직경으로 두개골을 천공하고, 뇌정위고정장치에 장착된 Hamilton 주사기(26-gauge, 10 μl, Hamilton, USA)를 뇌경막(dura mater)으로부터 5.5 mm 깊이로 선조체에 삽입하였다.
- 뇌출혈에 대한 황련해독탕의 효능을 관찰하기 위해 실험군은 다음과 같이 구분하였다. 마취와 두정부의 피부절개 및 두개골 천공 후 선조체에 needle을 삽입하였으나 collagenase를 주입하지 않은 정상대조군 (Sham)과 이러한 사전준비에 이어 선조체에 collagenase를 주입하여 뇌출혈을 유발시킨 대조군 (ICH)으로 나누었다. 특히 대조군은 뇌출혈 유발 후 24, 48 및 72 시간째에 희생하여 뇌출혈의 크기를 측정한 군은 각각 ICH24, ICH48 및 ICH72로 표시하였다.
- 마취와 두정부의 피부절개 및 두개골 천공 후 선조체에 needle을 삽입하였으나 collagenase를 주입하지 않은 정상대조군 (Sham)과 이러한 사전준비에 이어 선조체에 collagenase를 주입하여 뇌출혈을 유발시킨 대조군 (ICH)으로 나누었다. 특히 대조군은 뇌출혈 유발 후 24, 48 및 72 시간째에 희생하여 뇌출혈의 크기를 측정한 군은 각각 ICH24, ICH48 및 ICH72로 표시하였다. 또한 대조군과 같이 뇌출혈을 유발한 다음 48시간 동안에 황련해독탕 물추출물을 3회 경구투여한 군은 황련해독탕투여군 (ICH48+HHT)으로 하였다.
- 특히 대조군은 뇌출혈 유발 후 24, 48 및 72 시간째에 희생하여 뇌출혈의 크기를 측정한 군은 각각 ICH24, ICH48 및 ICH72로 표시하였다. 또한 대조군과 같이 뇌출혈을 유발한 다음 48시간 동안에 황련해독탕 물추출물을 3회 경구투여한 군은 황련해독탕투여군 (ICH48+HHT)으로 하였다. 실험동물은 총 60마리를 사용하였다.
- 마취된 흰쥐의 머리를 뇌정위고정장치(Stoelting, USA)에 고정한 다음 두정부의 정중선을 따라 피부를 절개하고 두개골이 드러나게 하였다. 두개골의 bregma로부터 전방으로 0.
- 뇌출혈 유발 24, 48 및 72시간 후에 실험동물을 과용량의 pentobarbital sodium 복강주사로 희생시킨 후 즉시 단두하고 뇌를 적출한 다음 흰쥐용 brain matrix (ASI Instruments, USA)를 사용하여 1 mm 두께의 뇌 절편을, collagenase 주입 위치를 기준으로 하여 전후로 총 6장의 절편을 만들었다. 염색 없이 즉시 뇌 절편을 digital camera로 촬영한 다음 ImageJ software(ver.
- 뇌출혈 유발 24, 48 및 72시간 후에 실험동물을 과용량의 pentobarbital sodium 복강주사로 희생시킨 후 즉시 단두하고 뇌를 적출한 다음 흰쥐용 brain matrix (ASI Instruments, USA)를 사용하여 1 mm 두께의 뇌 절편을, collagenase 주입 위치를 기준으로 하여 전후로 총 6장의 절편을 만들었다. 염색 없이 즉시 뇌 절편을 digital camera로 촬영한 다음 ImageJ software(ver. 1.41, NIH)를 사용하여 각 뇌 절편 영상으로부터 정상측 대뇌반구(intact hemisphere)와 출혈측 대뇌반구(hemorrhagic hemisphere) 및 뇌출혈 부위의 면적을 측정하고, 각각의 면적에 뇌 절편의 6장의 두께를 곱하여 체적을 계산하였다. 그러므로 실험결과 자료로 제시된 대뇌반구의 체적은 좌우 대뇌반구의 총체적이 아니라 collagenase 주입 위치를 기준한 6장 뇌 절편의 대뇌반구 체적이다.
- 그러므로 실험결과 자료로 제시된 대뇌반구의 체적은 좌우 대뇌반구의 총체적이 아니라 collagenase 주입 위치를 기준한 6장 뇌 절편의 대뇌반구 체적이다. 뇌부종 비율은 뇌출혈 유발 48시간 후에 정상측 대뇌반구 체적에 대한 출혈측 대뇌반구 체적의 증가 비율로 계산하였다.
- 뇌출혈 유발 48시간 후 실험동물을 과용량의 pentobarbital sodium 복강주사로 희생시킨 후 즉시 단두하고 뇌를 적출한 다음 소뇌와 뇌간을 제거하고 뇌를 정상측과 출혈측 대뇌반구로 이등분 하였다. 각 대뇌반구의 무게를 chemical balance(Mettler, AM100, Switzerland)로 측정한 다음 120℃의 dry oven(Daeil Engineering, DMC121, Korea)에서 48시간동안 건조한 후 다시 무게를 측정하였다.
- 뇌출혈 유발 48시간 후 실험동물을 과용량의 pentobarbital sodium 복강주사로 희생시킨 후 즉시 단두하고 뇌를 적출한 다음 소뇌와 뇌간을 제거하고 뇌를 정상측과 출혈측 대뇌반구로 이등분 하였다. 각 대뇌반구의 무게를 chemical balance(Mettler, AM100, Switzerland)로 측정한 다음 120℃의 dry oven(Daeil Engineering, DMC121, Korea)에서 48시간동안 건조한 후 다시 무게를 측정하였다. 수분함량은 각 대뇌반구의 건조 전후 무게 차이를 비율로 계산하여 자료로 사용하였다.
- 각 대뇌반구의 무게를 chemical balance(Mettler, AM100, Switzerland)로 측정한 다음 120℃의 dry oven(Daeil Engineering, DMC121, Korea)에서 48시간동안 건조한 후 다시 무게를 측정하였다. 수분함량은 각 대뇌반구의 건조 전후 무게 차이를 비율로 계산하여 자료로 사용하였다.
- 양성반응 세포 수 측정을 위해서 각각의 영상을 영상분석시스템에 저장하고, ImageJ software(ver. 1.41, NIH, USA)를 사용하여 뇌출혈 주변부에서 양성반응 세포 수를 측정한 다음 일정면적(105 μm2)으로 보정하여 자료로 사용하였다.
- 다음 0.05% 3,3'-diaminobenzidine tetrachloride (DAB, Sigma-Aldrich, USA)에서 2분간 발색 반응시키고, 수세한 다음 탈수, 봉입하여 조직표본을 제작하였다.
- 각 실험동물을 pentobarbital sodium의 복강주사로 깊게 마취한 다음 개흉하고 심장을 통하여 0.05 M phosphate buffered saline (PBS)과 4% paraformaldehyde로 충분히 관류하였다. 이후 뇌를 적출한 다음 24시간 정도 post-fixation하고, sucrose 용액에 담가 침전시켰다.
- Aquaporin(AQP) 발현 관찰을 위해서 anti-AQP4(1:500, SC-20812, SantaCruz, USA) 및 anti-AQP9 (1:500, AQP91-A, ADI, USA)를 사용하였으며, PBS와 Triton X-100을 섞은 용액으로 희석한 후 4℃에서 반응시켰다. 다음 biotinylated anti-rabbit secondary antibody (1:200, Vector Laboratories, USA)에 실온에서 1시간동안 반응시키고, 조직을 PBS로 씻어낸 후 avidin-biotin immuno-peroxidase의 방법에 따라 각각 1시간씩 반응시켰다. 다음 0.
- 면역형광염색을 위한 조직처리 및 기본적인 염색 과정은 위의 기술과 동일하며, 호중성백혈구침윤 관찰을 위해 호중성백혈구 표식자인 myeloperoxidase (MPO)에 대해서 1차항체는 anti-MPO (1:250, A-0398, DAKO, USA)를, 2차항체는 Cy5-conjugated goat anti-rabbit(1:200, ab6564, Abcam, UK)를 사용하였다. 또한 AQP4와 GFAP 및 lectin의 이중 면역 형광염색에서 1차항체는 anti-rabbit AQP4(1:200, SC-20812, SantaCruz, USA)와 anti-mouse GFAP (1:100, G3893, Sigma-Aldrich, USA) 및 FITC-conjugated tomato lectin(1:100, L0401, Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다.
- 2차항체는 AQP4에 대하여 Cy5-conjugated goat anti-rabbit(1:200, ab6564, abcam, UK)를, GFAP에 대하여는 FITC-conjugated goat anti-mouse(1:100, ab6785, abcam, UK)을 사용하였다. 형광염색된 뇌조직은 confocal laser-scanning microscopy(LSM510 META, CarlZeiss, Germany)를 사용하여 관찰하였다.
- 면역형광염색된 MPO 발현은 confocal laser-scanning microscopy(LSM510 META, CarlZeiss, Germany)를 사용하여, 면역조직화학법으로 염색된 AQP4 및 AQP9 발현은 CCD카메라 (DP70, Olympus, Japan)가 장착된 광학현미경(BX51, Olympus, Japan)을 사용하여 관찰하였다. 각각의 발현 정도는 양성 반응 세포 수를 측정하여 비교하였다.
- 면역형광염색된 MPO 발현은 confocal laser-scanning microscopy(LSM510 META, CarlZeiss, Germany)를 사용하여, 면역조직화학법으로 염색된 AQP4 및 AQP9 발현은 CCD카메라 (DP70, Olympus, Japan)가 장착된 광학현미경(BX51, Olympus, Japan)을 사용하여 관찰하였다. 각각의 발현 정도는 양성 반응 세포 수를 측정하여 비교하였다. 양성반응 세포 수 측정을 위해서 각각의 영상을 영상분석시스템에 저장하고, ImageJ software(ver.
- 황련해독탕이 뇌출혈에 미치는 영향을 ICH를 유발한 흰쥐에 48시간 동안 황련해독탕을 투여하여 뇌출혈 크기의 변화와 뇌출혈 주변조직의 호중성백혈구 침윤의 변화를 통해 관찰하였다.
- 황련해독탕이 뇌부종에 미치는 영향은 뇌부종 비율의 변화와 뇌조직 수분함량의 변화를 통해 관찰하였다.
- 황련해독탕이 뇌부종 유발 관련인자인 aquaporin(AQP) 발현에 미치는 영향은 뇌출혈 주변조직에서 발현되는 AQP4 및 AQP9의 변화를 통해 관찰하였다.
- 7, ICH48+HHT-1, 2, arrows). 면역조직화학 염색의 DAB 양성반응에서 AQP4가 발현된 세포들이 신경세포인지 신경아교세포인지 또는 혈관세포 인지 명확히 구분할 수 없었으므로, AQP4가 주로 발현되는 것으로 보고된 성상아교세포의 표지인 GFAP와 AQP4를 이중 면역형광염색을 실시하여 관찰하였다. 그 결과 GFAP가 발현된 성상아교세포 (Fig.
- AQP9 발현세포의 특성을 관찰하기 위해서 AQP9가 주로 발현되는 것으로 보고된 혈관내피세포의 표지인 lectin과 AQP9를 이중 면역형광염색을 실시하여 관찰하였다. 그 결과 lectin에 표지된 혈관내피세포(Fig.
- 이 실험에서는 흰쥐의 두개골 천공을 통해 선조체에 collagenase를 주입하여 뇌출혈과 뇌부종을 유발시켰다. 혈관의 기저막이 type IV collagen으로 구성되어 있으므로 collagenase를 주입하면 기저막이 파괴되어 출혈이 일어난다17).
- Collagenase를 주입한 다음 뇌출혈 크기가 언제 가장 명확하게 최고에 달하는가를 관찰하기 위해서 24, 48 및 72시간째에 뇌출혈 크기를 관찰하였으며, 그 결과 뇌출혈 유발 후 48시간째에 뇌출혈이 가장 크게 형성되는 것으로 나타났다. 따라서 본 실험에서는 황련해독탕을 투여한 다음 뇌출혈 유발 후 48시간째에 그 효능을 관찰하였다. 뇌출혈을 유발시킨 후 황련해독탕 물추출물을 경구투여한 다음 뇌출혈 크기를 측정하였고, 그결과 ICH48+HHT군은 ICH48군에 비하여 유의하게 뇌출혈 크기를 감소시키는 것으로 확인되었다(Fig.
- 본 연구에서는 황련해독탕이 뇌출혈에 의한 뇌부종과 뇌부종 형성에 중요한 역할을 하는 aquaporin 발현에 미치는 영향을 관찰하였다. 이를 위해 흰쥐의 선조체에 collagenase를 주입하여 뇌출혈에 의한 뇌부종을 유발하였으며, 황련해독탕 물추출물을 경구투여한 후 뇌출혈 부위의 크기와 호중성백혈구 침윤의 변화, 뇌부종의 비율, 뇌조직 수분함량 등에 대한 영향을 관찰하였으며, 뇌부종 발생에 관여하는 주요 인자인 AQP4와 AQP9 발현의 변화를 면역조직화학 염색을 통해 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
대상 데이터
- 실험동물은 샘타코(Samtako, Korea)에서 구입한 11주령, 약 300 g 전후의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 사용하였다. 흰쥐는 온도(21-23℃), 습도(40-60%), 조명 (12시간 명/암)이 자동적으로 유지되는 사육실에서 무균음수와 사료를 자유롭게 공급하며 사육되었고, 실험실 환경에 1주 이상 적응시킨 후 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 한약물은 황련해독탕 Hwangnyeonhaedok-tang(HuanglianJiedu-tang, HHT)으로 (주)허브메디에서 구입한 황련(Coptidis rhizoma), 황금(Scutellariae radix), 황백(Phellodendri cortex), 치자(Gardeniae fructus) 각 5 g으로 구성하였으며, 총 200 g의 약재에 3,000 ml의 물을 가하여 90분간 전탕하고, 여과액을 rotary evaporator로 감압 농축한 후 동결건조 하였다. 추출물 30.
- 또한 대조군과 같이 뇌출혈을 유발한 다음 48시간 동안에 황련해독탕 물추출물을 3회 경구투여한 군은 황련해독탕투여군 (ICH48+HHT)으로 하였다. 실험동물은 총 60마리를 사용하였다.
- 41, NIH)를 사용하여 각 뇌 절편 영상으로부터 정상측 대뇌반구(intact hemisphere)와 출혈측 대뇌반구(hemorrhagic hemisphere) 및 뇌출혈 부위의 면적을 측정하고, 각각의 면적에 뇌 절편의 6장의 두께를 곱하여 체적을 계산하였다. 그러므로 실험결과 자료로 제시된 대뇌반구의 체적은 좌우 대뇌반구의 총체적이 아니라 collagenase 주입 위치를 기준한 6장 뇌 절편의 대뇌반구 체적이다. 뇌부종 비율은 뇌출혈 유발 48시간 후에 정상측 대뇌반구 체적에 대한 출혈측 대뇌반구 체적의 증가 비율로 계산하였다.
- 뇌조직은 cryocut으로 20 μm 두께의 관상절편으로 제작하여 염색에 사용하였다.
- 면역형광염색을 위한 조직처리 및 기본적인 염색 과정은 위의 기술과 동일하며, 호중성백혈구침윤 관찰을 위해 호중성백혈구 표식자인 myeloperoxidase (MPO)에 대해서 1차항체는 anti-MPO (1:250, A-0398, DAKO, USA)를, 2차항체는 Cy5-conjugated goat anti-rabbit(1:200, ab6564, Abcam, UK)를 사용하였다. 또한 AQP4와 GFAP 및 lectin의 이중 면역 형광염색에서 1차항체는 anti-rabbit AQP4(1:200, SC-20812, SantaCruz, USA)와 anti-mouse GFAP (1:100, G3893, Sigma-Aldrich, USA) 및 FITC-conjugated tomato lectin(1:100, L0401, Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다. 2차항체는 AQP4에 대하여 Cy5-conjugated goat anti-rabbit(1:200, ab6564, abcam, UK)를, GFAP에 대하여는 FITC-conjugated goat anti-mouse(1:100, ab6785, abcam, UK)을 사용하였다.
- 또한 AQP4와 GFAP 및 lectin의 이중 면역 형광염색에서 1차항체는 anti-rabbit AQP4(1:200, SC-20812, SantaCruz, USA)와 anti-mouse GFAP (1:100, G3893, Sigma-Aldrich, USA) 및 FITC-conjugated tomato lectin(1:100, L0401, Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다. 2차항체는 AQP4에 대하여 Cy5-conjugated goat anti-rabbit(1:200, ab6564, abcam, UK)를, GFAP에 대하여는 FITC-conjugated goat anti-mouse(1:100, ab6785, abcam, UK)을 사용하였다. 형광염색된 뇌조직은 confocal laser-scanning microscopy(LSM510 META, CarlZeiss, Germany)를 사용하여 관찰하였다.
데이터처리
- 측정된 자료는 ICH48군과 ICH48+HHT군 사이, 또는 Sham군, ICH48군 및 ICH48+HHT군 사이에서 일원분산분석 (one-way ANOVA)을 통해 P<0.05의 유의수준으로 검정하였다.
이론/모형
- 뇌출혈의 유발은 Rosenberg 등의 방법17)에 따랐으며, 수술과정은 electronic temperature controller(CMA150, CMA, Sweden)를 통하여 정상체온(37±0.5℃)이 유지되는 상태에서 2% isoflurane을 포함한 70% N2O와 30% O2 gas의 흡입마취를 사용하였고, 필요한 경우 추가적으로 pentobarbital sodium(50 mg/kg)을 복강주사 하였다.
- 5 mm 깊이로 선조체에 삽입하였다. 선조체의 정위는 Paxonis와 Watson의 rat brain atlas18)를 참고하였다. 이어서 0.
성능/효과
- 흰쥐의 선조체 내에 뇌출혈을 유발한 다음 24, 48및 72시간째에 뇌출혈 크기를 측정한 결과 ICH24군은 30.9±3.2mm3, ICH48군은 38.1±5.9mm3, ICH72군은 22.5±3.6mm3로 뇌출혈의 크기가 48시간 후에 가장 크게 형성되었다가 72시간에는 감소하기 시작하였다.
- 뇌출혈 유발 48시간 후에 뇌출혈 주변조직에서 MPO의 형광염색에 양성반응을 보이는 호중성백혈구의 침윤을 관찰한 바 Sham군에서는 관찰되지 않았으며, ICH48군은 103.8±22.6 개가 관찰되었고, 이에 비하여 ICH48+HHT군은 63.2±20.7 개가 관찰되어 P<0.01의 유의성 있는 호중성백혈구 침윤의 감소를 나타내었다(Fig. 3, Fig. 4).
- 뇌출혈 흰쥐에 황련해독탕을 투여한 후 정상측 대뇌반구에 대한 출혈측 대뇌반구의 면적 증가율을 계산하여 뇌부종 비율을 측정한 결과, Sham군은 102.4±1.4% 이었으며, ICH48군은 118.7±3.8%로 증가하였다.
- 면역조직화학 염색의 DAB 양성반응에서 AQP4가 발현된 세포들이 신경세포인지 신경아교세포인지 또는 혈관세포 인지 명확히 구분할 수 없었으므로, AQP4가 주로 발현되는 것으로 보고된 성상아교세포의 표지인 GFAP와 AQP4를 이중 면역형광염색을 실시하여 관찰하였다. 그 결과 GFAP가 발현된 성상아교세포 (Fig. 8, red)와 AQP4 발현(Fig. 8, green)이 뇌조직의 혈관(Fig. 8, white asterisk) 주위에서 일치하는 것으로 관찰되어 AQP4가 성상아교세포에서 발현되는 것이 확인되었다.
- AQP9 발현세포의 특성을 관찰하기 위해서 AQP9가 주로 발현되는 것으로 보고된 혈관내피세포의 표지인 lectin과 AQP9를 이중 면역형광염색을 실시하여 관찰하였다. 그 결과 lectin에 표지된 혈관내피세포(Fig. 10, green)와 AQP9 발현(Fig. 10, red)이 뇌조직 혈관 (Fig. 10, white asterisk)의 내피세포에서 발현이 일치하는 것을 관찰할 수 있었으며(Fig. 10, white arrowhead), 또한 혈관 주위의 뇌조직 세포들에서도 AQP9가 발현되는 것이 확인되었다(Fig. 10, white arrow).
- 혈관의 기저막이 type IV collagen으로 구성되어 있으므로 collagenase를 주입하면 기저막이 파괴되어 출혈이 일어난다17). Collagenase를 주입한 다음 뇌출혈 크기가 언제 가장 명확하게 최고에 달하는가를 관찰하기 위해서 24, 48 및 72시간째에 뇌출혈 크기를 관찰하였으며, 그 결과 뇌출혈 유발 후 48시간째에 뇌출혈이 가장 크게 형성되는 것으로 나타났다. 따라서 본 실험에서는 황련해독탕을 투여한 다음 뇌출혈 유발 후 48시간째에 그 효능을 관찰하였다.
- 그러므로 MPO는 염증질환의 진단지표와 함께 호중성백혈구의 면역염색 표식자로도 활용되고 있다23). 본 실험에서 호중성백혈구 침윤을 관찰한 결과, ICH48+ HHT군에서는 ICH48군에 비하여 뇌출혈 주변부에 침윤된 호중성백혈구의 수가 유의하게 감소된 것으로 나타났다 (Fig. 3, Fig. 4). 이러한 결과는 황련해독탕이 뇌조직의 염증반응을 억제하는 작용이 있음을 보여준다.
- 본 실험에서는 황련해독탕이 뇌부종에 미치는 영향을 관찰하기 위해 뇌부종 비율의 변화와 뇌조직 수분함량의 변화를 측정하였다. 뇌부종의 비율적 변화를 보기 위해 뇌출혈 흰쥐에 황련해독탕 물추출물을 투여한 후 정상측 대뇌반구에 대한 출혈측 대뇌반구의 면적 증가율을 계산하였으며, 그 결과 ICH48+HHT군은 ICH48군에 비해 유의성 있는 뇌부종 비율의 감소를 나타내었다(Fig. 5). 수분함량의 변화는 뇌출혈 흰쥐에 황련해독탕 물추출물을 투여한 후 출혈측 대뇌반구의 무게와 건조 무게의 차이로 수분함량을 측정하여 확인하였으며, ICH+HHT군은 ICH군에 비해 유의성 있는 뇌조직 수분함량의 감소를 나타내었다(Fig.
- 5). 수분함량의 변화는 뇌출혈 흰쥐에 황련해독탕 물추출물을 투여한 후 출혈측 대뇌반구의 무게와 건조 무게의 차이로 수분함량을 측정하여 확인하였으며, ICH+HHT군은 ICH군에 비해 유의성 있는 뇌조직 수분함량의 감소를 나타내었다(Fig. 6). 이러한 결과를 통해 황련해독탕이 뇌부종을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있다.
- 본 연구에서는 황련해독탕이 AQP4와 AQP9의 발현에 미치는 영향을 면역조직화학염색을 통해 관찰하였다. 그 결과 뇌조직내출혈이 유발된 대뇌반구의 뇌출혈 주변부에서 강한 AQP4 양성반응을 나타내는 세포들이 많이 관찰된 것에 비해 ICH48+HHT군에서는 AQP4 양성반응 세포들의 발현 강도와 세포 수가 ICH48군에 비하여 현저히 감소되었다. 또한 ICH48+HHT군에서는 ICH군에 비해 AQP9 발현 세포 수도 감소되었다.
- 1. 황련해독탕 물추출물은 뇌출혈 체적을 유의하게 감소시켰다.
- 2. 황련해독탕 물추출물은 뇌출혈로 인한 호중성 백혈구의 침윤을 유의하게 감소시켰다.
- 3. 황련해독탕 물추출물은 뇌출혈로 인한 뇌부종 비율을 유의하게 감소시켰다.
- 4. 황련해독탕 물추출물은 뇌출혈로 인하여 증가된 뇌조직 수분함량을 유의하게 감소시켰다.
- 5. 황련해독탕 물추출물은 뇌출혈 주변부에서 AQP4 양성반응 세포수를 유의하게 감소시켰다.
- 6. 황련해독탕 물추출물은 뇌출혈 주변부에서 AQP9 양성반응 세포수를 유의하게 감소시켰다.
- 이상의 결과로 보아, 황련해독탕은 뇌출혈 체적을 줄이고 AQP4와 AQP9의 발현을 감소시켜서 뇌부종을 억제하는 것으로 생각된다.
- 뇌출혈 흰쥐에 황련해독탕을 투여한 후 출혈측 대뇌반구의 무게와 건조 무게의 차이로 수분함량을 측정한 결과, Sham군은 78.32±1.07% 이었으며, ICH48군은 80.65±1.12%로 증가하였다.
- 따라서 본 실험에서는 황련해독탕을 투여한 다음 뇌출혈 유발 후 48시간째에 그 효능을 관찰하였다. 뇌출혈을 유발시킨 후 황련해독탕 물추출물을 경구투여한 다음 뇌출혈 크기를 측정하였고, 그결과 ICH48+HHT군은 ICH48군에 비하여 유의하게 뇌출혈 크기를 감소시키는 것으로 확인되었다(Fig. 1, Fig. 2). 이는 황련해독탕이 뇌조직출혈 손상에 대하여 유의한 효과가 있음을 보여준다.
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