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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 순비기나무로부터 추출물과 용매 분획물을 제조하고, 항산화 활성에 따른 분리정제 과정을 통해 항산화 물질을 분리 하였다. 또한 활성과 구조와의 상관관계를 파악하고, 더 나아가 생리활성물질 탐색을 위한 기초 연구자료로 활용하고자 하였다. 이러한 연구의 결과로 순비기나무의 추출물로부터 3종의 flavonoid 계열 화합물들을 분리하여 이들에 대한 항산화 효과(DPPH 라디칼 및 ONOO 이러한 연구의 결과로 순비기나무의 추출물로부터 3종의 flavonoid 계열 화합물들을 분리하여 이들에 대한 항산화 효과(DPPH 라디칼 및 ONOO- 소거능, 세포내 NO, ROS, GSH 함량 증감)를 보고하고자 한다.
제안 방법
- Buffer 용액에 DHR 123 용액을 혼합한 뒤 시료와 authentic ONOO−를 첨가하고 실온에서 5분간 방치하여 측정하였으며, 3-morpholinosydnonimine(SIN-1)을 첨가할 경우, SIN-1이 DHR 123과 점진적인 산화를 일으키는 것을 고려하여 1시간 동안 방치한 후 측정하였다.
- DHR 123 fluorescence intensity는 multidetection microplate fluorescence spectrophotometer synergy HT(Bio-Tek instruments, USA)를 이용하여 λexcitation 485 nm, λemission 530 nm에서 측정하였다.
- DPPH radical을 이용한 항산화능 측정법은 주로 phenolics 구조와 aromatic amine 화합물에서 많이 사용된다. DPPH radical 소거 활성은 시험군의 안정해진 분자의 흡광도를 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 측정함으로써 백분율(%)로 나타내었다.
- 순비기나무 분획층 가운데 뛰어난 라디칼 소거능을 보이는 n-BuOH 분획층 및 85% aq. MeOH 분획층으로부터 3종의 순수한 플라보노이드계 화합물(1-3)을 분리하였으며, 이들의 구조는 NMR, IR, UV 등의 분광학적 분석과 문헌치와의 비교에 의해 차례로 luteolin(1), vitexicarpin(2) 및 artemetin(3) 임을 확인하였다(Iinuma et al. 1980; Rahman et al. 1988; Ahmad et al. 1995; Yoshioka et al. 2004; Loizzo et al. 2007) (Fig. 2). 화합물 1-3은 순비기나무의 대표적인 플라보노이드계 화합물로써 화합물 1의 항산화 효과 및 화합물 2와 3의 항암효과가 다수 보고된 바있으나(Ko et al.
- 85% aq. MeOH(21.0 g) 및 n-BuOH 분획층(15.0 g)에 대해 MeOH과 물의 혼합용매를 사용하여 RP flash column chromatography를 실시하였으며, 각각 50%(Rfc 1), 60%(Rfc 2), 70%(Rfc 3), 80%(Rfc 4), 90% aq. MeOH(Rfc 5)과 100% MeOH(Rfc 6), 그리고 100% EtOAc(Rfc 7)의 크로마토그래피 분획물을 얻었다.
- PBS로 3회 씻은 후, 2시간 동안 500 µM의 H2O2를 처리하여 세포 내 자유라디칼 생성 정도는 multidetection microplate fluorescence spectrophotometer synergy HT(Bio-Tek instruments, USA)를 이용하여 λexcitation 485 nm, λemission 528 nm에서 DCF fluorescence intensity를 측정하였다.
- 다시 각 well은 PBS 완충액으로 씻은 후 40 µM mBBr를 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 30분간 반응시킨 후 시료처리에 의한 GSH 함량의 변화를 시간별로 λexcitation 360 nm, λemission 465 nm에서 형광 분석기로 측정하였다.
- 화합물은 high performance liquid chromatography(HPLC)으로 Dionex P580 pump(USA)와 Varian 350 refractive index detector(USA)를 사용하여 분리 · 정제하였다. 단일 분리된 화합물의 구조 결정을 위해 Perkin Elmer polarimeter 341(USA)를 사용하여 비선광도를 측정하였으며, NMR 스펙트럼은 Varian Mercury 300(1H-NMR 300 MHz와 13C-NMR 75 MHz)에서 CD3OD(Merck, deuterium degree 99.95%) CDCl3(Cambridge Isotope Laboratories, Inc., USA, deuterium degree 99.8%) 용액을 사용하여 기록하였으며 Mass 스펙트럼 데이터는 한국기초과학연구원에 의뢰하여 분석하였다. 사용된 모든 유기용매는 사용하기 전 정제하여 실험에 사용하였으며, 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH), L-ascorbic acid, DL-2-amino-3-mercapto-3-methylbutanoic acid(DL-penicillamine) dihyrorodamine 123(DHR 123), 3-morpholinosydnonimine(SIN-1)와 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCF-DA)는 Sigma사(St Louis, MO, USA)에서 그리고 peroxinitrite(ONOO−)는 Cayman(Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였다.
- 염생식물 자원으로부터 생리활성물질을 탐색하는 과정에 순비기나무의 추출물과 용매 분획물이 높은 peroxynitrite 소거효과를 보여 주었다. 따라서 본 연구에서는 순비기나무로부터 추출물과 용매 분획물을 제조하고, 항산화 활성에 따른 분리정제 과정을 통해 항산화 물질을 분리 하였다. 또한 활성과 구조와의 상관관계를 파악하고, 더 나아가 생리활성물질 탐색을 위한 기초 연구자료로 활용하고자 하였다.
- 배양액을 10% FBS가 함유된 Modified Eagle medium(MEM)으로 교체한 후 준비된 sample을 1시간 동안 전처리하고, NO 생성을 유도하기 위해 lipopolysaccharide(LPS, final concentration 1 µg/ml)를 처리한 후, 48시간 동안 37℃, CO2 incubator에서 배양하였다.
- 7을 사용하였으며, 형광염료인 DCFH-DA가 세포 내 생성된 자유라디칼과 반응하여 형광물질인 DCF로 산화되는 원리를 이용하여 측정하였다. 세포 내 자유라디칼 생성은 H2O2를 이용하여 유도하였으며, 30분 간격으로 120분 동안 형광 정도를 측정하여 나타내었다. Fig.
- 순비기나무의 세포 내 자유라디칼 소거 효과는 대식세포인 Raw 264.7을 사용하였으며, 형광염료인 DCFH-DA가 세포 내 생성된 자유라디칼과 반응하여 형광물질인 DCF로 산화되는 원리를 이용하여 측정하였다. 세포 내 자유라디칼 생성은 H2O2를 이용하여 유도하였으며, 30분 간격으로 120분 동안 형광 정도를 측정하여 나타내었다.
- 7을 사용하여 검토하였다. 시료 처리 후 LPS를 48시간 동안 처리하여 NO의 생성을 유도하였으며 시료를 처리하지 않고 LPS만 처리한 것을 대조군으로 하여 백분율(%)로 비교하여 나타내었다. Fig.
- 준비된 각 sample 50 µl와 제조한 DPPH 용액을 혼합하여 10분간 상온에서 반응시킨 후 518 nm에서 흡광도를 측정한다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 유리 라디칼 소거활성을 백분율로 나타내었으며, 대조군의 UV-Vis 흡광도는 0.94-0.97이 되도록 조정하였다. 실험은 triplicate로 행하였으며 결과를 평균한 값으로 나타내었다(Blois 1998).
- 배양액을 10% FBS가 함유된 Modified Eagle medium(MEM)으로 교체한 후 준비된 sample을 1시간 동안 전처리하고, NO 생성을 유도하기 위해 lipopolysaccharide(LPS, final concentration 1 µg/ml)를 처리한 후, 48시간 동안 37℃, CO2 incubator에서 배양하였다. 이 후 생성된 NO의 양은 griess 시약(0.1% N-(1-naphtyl)etylenediamine:1% sulfanilamide = 1:1)과 배양액을 1:1로 혼합하여 15분 동안 실온에 방치한 후, multidetection microplate fluorescence spectrophotometer synergy HT(Bio-Tek instruments, USA)를 이용하여 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다(Green et al. 1982). 이 반응은 1-naphthylenediamine, sulfanilamide 그리고 NO2−가 반응하여 azo coupling을 이루는데 이 두 개의 고리 형태가 550 nm의 파장에서 최대의 흡광도 값을 나타내며 이 값을 측정하여 간접적으로 NO의 생성량을 측정할 수 있다.
- 24시간 배양 후, 1 mg/ml의 MTT 가 포함된 배지를 첨가하여 동일한 배양 조건에서 4시간 동안 배양하였다. 이때 생성된 formazan crystal은 DMSO에 녹여서 multidetection microplate fluorescence spectrophotometer synergy HT(Bio-Tek instruments, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 생존율(%)을 구하였다.
- 이상과 같이 순비기나무의 추출물 및 용매 분획물들의 항산화 활성을 확인하였으며 항산화 활성이 우수한 용매분획물로부터 3개의 flavonoid 계열의 화합물들인 luteolin(1), vitexicarpin(2), artemetin(3)을 분리하고 또한 이들 화합물들에 대해서도 항산화 활성을 측정하였다. 순비기 추출물들의 항산화 활성이 이미 이전에 보고되었으나 그 활성성분으로 보고된 화합물들 중에 여기에서 분리된 3개의 flavonoid 계열의 물질들은 포함되어 있지 않았다(Kim 2009).
- 2). 화합물 1-3은 순비기나무의 대표적인 플라보노이드계 화합물로써 화합물 1의 항산화 효과 및 화합물 2와 3의 항암효과가 다수 보고된 바있으나(Ko et al. 2000; Kim et al. 2009), 항산화 효과의 구조적 상관성을 확인하기 위하여 화합물 1-3의 항산화 효과를 다양한 방법으로 검토해 보았다.
대상 데이터
- 0 g)에 대해 MeOH과 물의 혼합용매를 사용하여 RP flash column chromatography를 실시하였으며, 각각 50%(Rfc 1), 60%(Rfc 2), 70%(Rfc 3), 80%(Rfc 4), 90% aq. MeOH(Rfc 5)과 100% MeOH(Rfc 6), 그리고 100% EtOAc(Rfc 7)의 크로마토그래피 분획물을 얻었다. n-BuOH 분획층의 Rfc 3 분획물은 역상 HPLC(YMC ODS-A, 67% aq.
- 마우스 대식세포 Raw 264.7는 한국 세포주 은행 (Korean Cell Line Bank, KCLB)으로부터 분양 받아 100 units/ml의 penicillin-streptomycin과 10%의 fetal bovine serum(FBS, Hyclone, Utah, USA)이 함유된 Dulbecco's modied Eagle's medium(DMEM, Hyclone, Utah, USA)을 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator(Forma Scientific, Japan)에서 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 순비기나무(V. rotundifolia) (3 kg)는 2003년 7월 전라남도 무안군 현경면에서 직접 채집하여 응달에서 자연 건조한 후 추출하기 전까지 −25℃에서 냉동 보관하였다.
- 사용된 모든 유기용매는 사용하기 전 정제하여 실험에 사용하였으며, 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH), L-ascorbic acid, DL-2-amino-3-mercapto-3-methylbutanoic acid(DL-penicillamine) dihyrorodamine 123(DHR 123), 3-morpholinosydnonimine(SIN-1)와 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCF-DA)는 Sigma사(St Louis, MO, USA)에서 그리고 peroxinitrite(ONOO−)는 Cayman(Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였다.
데이터처리
- 97이 되도록 조정하였다. 실험은 triplicate로 행하였으며 결과를 평균한 값으로 나타내었다(Blois 1998).
- DHR 123 fluorescence intensity는 multidetection microplate fluorescence spectrophotometer synergy HT(Bio-Tek instruments, USA)를 이용하여 λexcitation 485 nm, λemission 530 nm에서 측정하였다. 실험은 triplicate로 행하였으며, 결과는 blank를 차감한 값을 평균하여 대조군에 대한 백분율(%)로 계산하였다.
이론/모형
- ONOO−소거 활성은 Kooy 등 (1994)의 방법에 따라 dihydrorhodamine 123(DHR 123)의 산화되는 정도를 측정함으로써 검색하였다.
- 세포 내 자유라디칼 생성 정도는 DCFH-DA assay로 측정하였다(Okimoto et al. 2000). Raw 264.
- 세포내에 축적된 항산화 효소인 GSH 함량은 thiolstaining reagent인 monobromobiman(mBBr)을 이용하여 측정하였다(Poot et al. 1986). 세포는 fluorescence microtiter 96-well plates에 well 당 5×104 cells/ml 이 되도록 분주하여 24시간 배양한 후, 각 well에 농도별로 시료를 처리하여 다시 37℃ 5% CO2 incubator에서 30분간 배양하였다.
- 순비기나무 시료의 처리에 따른 세포의 생존율은 MTT assay를 이용하여 측정하였다(Hansen et al. 1989). 배양된 세포는 5×104 cells/ml이 되도록 96 well plate에 분주하여 37°C, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양 후, 배지를 제거하고 새로운 배지에 일정농도의 시료를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다.
- 순비기나무 추출물이 DPPH 자유 라디칼에 대한 전자 공여능을 Blois (1998)의 방법을 이용하여 검색하였다. DPPH radical을 이용한 항산화능 측정법은 주로 phenolics 구조와 aromatic amine 화합물에서 많이 사용된다.
- 순비기나무 추출물이 가지는 authentic ONOO−와 SIN1의 소거 효과를 Kooy 등 (1994)의 방법을 이용하여 검색하였다.
- 순비기나무에서 분리한 화합물들의 생체 내 적용 가능성을 가늠하기 위하여 화합물 1-3에 대한 세포 내 NO 생성 억제 효과를 마우스 대식세포 Raw 264.7을 사용하여 검토하였다. 시료 처리 후 LPS를 48시간 동안 처리하여 NO의 생성을 유도하였으며 시료를 처리하지 않고 LPS만 처리한 것을 대조군으로 하여 백분율(%)로 비교하여 나타내었다.
성능/효과
- Fig. 4와 같이 화합물 1-3의 NO 함량을 측정하기 위하여 MTT assay를 통한 각 화합물의 세포 독성을 측정한 결과, 화합물 1을 제외한 화합물들이 10 µM의 낮은 처리 농도에서도 강한 세포 독성이 있음이 확인되었다.
- MeOH 분획층이 L-ascorbic acid와 penicillamine에 상응하는 우수한 ONOO−소거 효과가 있음이 확인되었다.
- Vitexicarpin(2)과 artemetin(3)은 authentic peroxynitrite와 SIN-1에 대해서 농도의존적인 소거효과를 보였으며, 특히 2와 3번 화합물은 SIN-1에 의해 생성되는 ONOO−를 탁월하게 소거하여 대조군으로 사용된 L-ascorbic acid와 penicillamine에 필적하는 결과를 나타내었다.
- 하지만 50 µM의 농도에서 SIN-1에 의해 생성되는 peroxynitrite의 소거효과에서는 오히려 methoxy(OMe)기가 훨씬 많은 2번과 3번 화합물이 더 좋은 소거 효과를 보여 주었다. 그럼에도 불구하고 authentic peroxynitrite에 대한 소거 효과가 그렇게 뛰어나지 않은 것으로 보아 2번과 3번 화합물이 peroxynitrite 자체를 효과적으로 소거하기 보다는 SIN-1이 먼저 분해되면서 발생되는 NO와 ·O2−로부터 peroxynitrite가 생성되는 과정을 효과적으로 억제하는 것으로 여겨진다. 하지만 이 과정에서 OH기와 OMe기가 구체적으로 어떤 역할을 하는지는 명확하지 않다.
- 그리고 SIN-1에서 유도된 ONOO− 에 대한 소거 효과는 동일 농도에서 각각 94.2%, 118.2% 그리고 88.3%의 높은 소거 양상을 보였으며, 특히 추출물에서는 MeOH 추출물이 소거 효과가 우수하였으며, 분획층에서는 n-BuOH 및 85% aq.
- 또한, 화합물 1의 결과에는 미치지 못하지만 화합물 2와 3이 50 µM의 농도에서 각각 46%와 34%의 소거능을 보여 항산화 소재로의 가능성을 보여주었다.
- 반면에 SIN-1에서 유도된 ONOO−에 대한 소거 효과는 10 µM의 농도에서 화합물 1-3이 차례로 77%, 62%, 73%를 기록하였으며, 농도의존적으로 효능이 증가하여 50µM의 농도에서는 각각 81%, 98%, 96%를 나타내어 대조군인 L-ascorbic acid(99%)와 penicillamine(93%)에 상응하는 뛰어난 소재가 될 수 있을 것으로 사료되었다(Fig. 3b).
- 2010). 본 연구에 의해 수행된 결과에 의하면 luteolin(1)이 NO 생성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다. 이 결과는 기존에 보고된 luteolin의 NO 생성억제 효과와 잘 일치하였다(Park et al.
- 순비기나무의 추출물과 분획물에 대한 DPPH 자유 라디칼의 소거 효과는 Fig. 1(a)에 나타낸 바와 같이, 100 µg/ml의 농도에서 대조군으로 사용된 L-ascorbic acid(83.3%) 의 소거 효과보다는 다소 약한 것으로 확인되었다.
- 순비기나무의 플라보노이드계 화합물들에 의한 항산화 효소인 GSH 함량 증가 경향을 확인해 본 결과, 눈에 띄게 효소의 증가 효과를 나타내지는 않지만 농도의존적으로 5-10% 내외로 증가하는 것으로 확인되었다.
- 특히, 50 µM의 농도에서는 90% 이상의 ROS 소거능을 보여주었으며, 10 µM의 농도에서도 53%의 뛰어난 효과를 보여주었다.
- 특히, 화합물 2와 3의 ONOO−소거활성은 처음으로 보고되는 것으로, authentic ONOO−에서보다 SIN-1에 의해 생성되는 ONOO−를 소거하는 효과가 더 뛰어난 것으로 확인되었다.
- 하지만 n-BuOH 분획층의 경우, 50 및 100 µg/ml의 농도에서 각각 60.4%와 66.7%의 라디칼 소거 효과를 나타내어 DPPH 라디칼에 대한 항산화 성분이 n-BuOH 분획층으로 집중됨을 확인할 수 있었다.
- 화합물 1의 NO 생성 억제능을 대조군에 대한 백분율로 비교하여 확인해 본 결과(Fig. 4a), 50 µM의 농도에서 31%로 문헌에 보고된 것과 유사하게 NO의 생성을 억제하는 것으로 나타났으며, 이는 독성을 띄는 화합물 2와 3(29%과 19%) 보다도 억제 효과가 있다고 할 수 있겠다(Park et al. 2010).
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