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문제 정의
- 이에">2009). 이에 본 연구에서는 hairless 마우스에 UVB를 반복 조사하여 피부장벽 손상 및 염증을 유발시킨 후, 우수한 항산화능으로 인해 피부노화 억제 효과가 기대되는 백차 열수추출물을 도포하여 in vivo에서 피부장벽 손상 및 염증 완화 효과에 대한 유효성을 알아보았다.
제안 방법
- Retinoic acid는 polyethylene glycol에 0.01%로 희석하여 1일 2회, 주 5일, 4주 동안 매회 200 μL씩 도포하였다.
- 생리식염수와 백차 열수추출물은 1일 2회(1%: 0.13 g/kg BW/day, 2%: 0.26 g/kg BW/day), 주 5일, 4주 동안 매회 200 μL씩 등 부위에 도포하였다.
- 후)6~7 주령의">6~7주령의 암컷 SKH-1 hairless 마우스(Charles-River, Japan)를 분양받아 사육실(온도 22±1℃, 습도 50±5%, 명암주기 12시간)에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였고 물과 사료의 양은 제한 없이 공급하였다. 실험동물은 실험종료 후 에테르로 마취한 후 개복하여 후대정맥에서 채혈하고, 피부 및 장기를 적출하였다. 적출한 피부의 일부는 10% 중성 포르말린 용액에 고정하여 조직학적 검사에 실험동물을 에테르로 마취한 후 개복하여 비장, 흉선을 적출한 다음 생리 식염수로 씻어내고 수분을 여과지로 제거한 다음 전자저울(CP224S, Sartorius, Germany)을 이용하여 측정하였다.
- 이를">2000). 이를 근거로 본 연구는 hairless 마우스를 이용 하여 피부노화 실험동물 모델을 만든 후, 높은 항산화능으로 인해 피부노화 억제 효과가 기대되는 백차 열수추출물을 도포하여 염증 및 피부장벽 손상 완화 효과를 알아보았다.
- 후)기능지표로">기능 지표로 사용되고 있다. 이에 본 연구에서는 수분함량, TEWL 측정을 통해 피부장벽 손상 정도를 확인하였다. 실험 전 기간 동안 대조군과 비교하여 모든 군은 자외선 조사장치의 광원은 302 nm의 UVB를 방출하는 sunlamp를 사용하였다. 자외선 조사량은 UV-radiometer로측정하였으며, 마우스를 자외선 조사용 cage에 가둔 후 등부위에 격일 간격으로 1주일에 3회, 12주간[1주: 60 mJ/cm2(1MED), 2주: 2MED, 3주: 3MED, 4~12주: 4MED] 조사하였고 시료 도포 기간 동안 4MED의 광량으로 주 1회 조사 하였다. 생리식염수와 절취한 피부조직을 실온에서 10% 중성 포르말린 용액에 24시간 고정한 후 통상적인 방법으로 수세, 탈수, 투명, 침투 과정을 거친 다음 paraffin에 포매하고 4 μm 두께로 절편을 만들어 H&E 염색 후 피부조직의 변화양상을 광학현미경으로 관찰하였다.
- 절취한 피부조직을 실온에서 10% 중성 포르말린 용액에 24시간 고정한 후 통상적인 방법으로 수세, 탈수, 투명, 침투 과정을 거친 다음 파라핀으로 포매하고 4 μm 두께로 절편을 만들어 Toluidine blue 염색 후 진피층 및 피하층 내 mast cell의 분포양상 및 탈과립 정도를 광학현미경으로 관찰하였다.
- 채취한 혈액을 혈액응고 방지제인 K2EDTA가 포함된 채혈 tube에 담아 coulter mixer기 위에서 5분 이상 혼합한 뒤 자동 혈구 분석기(XE-2100, Sysmex, Japan)를 이용하여 적혈구수, 백혈구수, 호중구수, 호산구수, 호염구수, 림프구수, 단핵구수, 혈소판수, 혈색소 농도, 적혈구 용적을 측정하였다.
- 후)정장치는">정 장치는 UV-radiometer (HD 9021, Delta OHM, Italy)를 사용하였다. 피부의 홍반도는 Mexameter (MX18, CK electronic GmbH, Germany), 수분함량은 Corneometer (CM825, CK electronic GmbH, Germany), 경표피수분손실량 측정은 Tewameter(TM300, CK electronic GmbH, Germany)를 이용하였다. 홍반도는 Mexameter를, 수분함량은 Corneometer를, TEWL은 Tewameter를 사용하여 비침습적 방법으로 실험기간 동안 주 1회 측정하였다.
대상 데이터
- 6~7주령의 암컷 SKH-1 hairless 마우스(Charles-River, Japan)를 분양받아 사육실(온도 22±1℃, 습도 50±5%, 명암주기 12시간)에서 1주일간 적응시킨 후 실험에 사용하였고 물과 사료의 양은 제한 없이 공급하였다.
- Hydrogen peroxide는 Junsei사(Japan)의 제품을, hematoxylin, bovine serum albumin, retinoic acid, polyethylene glycol은 Sigma사(USA)의 제품을 사용하였으며 그 외 일반시약 들은 특급품을 사용하였다.
- 백차(white tea)를 건조시킨 잎(중국 Fujian 지방에서 재배)을 600 g 구입하여 증류수 5 L를 첨가하여 초고속 감압 저온 추출기로 2시간 30분 열수추출한 후 농축 용기에 담아 농축하고 동결 건조 장치로 동결 건조시킨 홍차 열수추출물 분말을 용매(propylene glycol : ethanol : water, 5 : 3 : 2)에 용해시켜 시료로 사용하였다.
- 실험기기 중 자외선 조사장치는 UVB sunlamp (UVM-225D, Mineralight Lamp UVP, USA)를, 자외선 측정 장치는 UV-radiometer (HD 9021, Delta OHM, Italy)를 사용하였다. 피부의 홍반도는 Mexameter (MX18, CK electronic GmbH, Germany), ">사용 하였다. 실험동물은 정상군(Normal, N): 아무런 처치를 하지 않은 군, 대조군(control, C): 자외선조사+생리식염수 도포군, 양성대조군(positive control, PC): 자외선조사+0.01% retinoic acid 도포군, 실험군 1 (experimental 1, E1): 자외선조사+1% 백차 열수추출물 도포군, 실험군 2 (experimental 2, E2):자외선조사+2% 백차 열수추출물 도포군, 총 5개 군으로 나누어 군당 7마리씩 총 35마리를 실험에 사용하였다. 동물실험은 자외선 조사장치의 광원은 302 nm의 UVB를 방출하는 sunlamp를 사용하였다. 자외선 조사량은 UV-radiometer로측정하였으며, 마우스를 자외선 조사용 cage에 가둔 후 후)후대 정맥에서">후대정맥에서 채혈하고, 피부 및 장기를 적출하였다. 적출한 피부의 일부는 10% 중성 포르말린 용액에 고정하여 조직학적 검사에 사용 하였다. 실험동물은 정상군(Normal, N): 아무런 처치를 하지 않은 군, 대조군(control, C): 후)조직표 본">조직표본 관찰은 light microscope (BX51, Olympus, Japan)와 digital camera system (Progres C14 plus, Olympus, Japan)을 사용하였다.
데이터처리
- **p < 0.01 compared to the C group by ANOVA and Duncan’s multiple range tests.
- Values with different superscripts in the same row are significantly different (p < 0.001) by ANOVA and Duncan’s multiple range test.
- Values with different superscripts in the same row are significantly different (p⁄0.05) by ANOVA and Duncan’s multiple range tests.
- Values with same superscript in the same row are not significantly different (p¤0.05) by ANOVA and Duncan’s multiple range tests.
- 통계적 분석은 SPSS 18.0 for windows (SPSS Inc., USA)를 이용하여 유의성 검정을 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)으로 분석하였고, 정상군(N), 대조군(C), 양성대조군(PC), 실험군(E1, E2) 간의 차이는 Duncan’s multiple range test를 이용하여 사후분석하였다.
성능/효과
- TEWL 비교에서 실험 1주에 백차 열수추출물 도포군은 대조군에 비해 유의하게(p⁄0.01) 낮았고, 실험 4주에는 다른 모든 군에 비해 유의하게(p⁄0.001) 낮았다.
- TEWL은 실험 2주 후, 대조군(C)에 비해 양성대조군(PC)을 제외한 모든 군에서 유의하게(p < 0.001) 낮았으며, 실험 4주후대 조군에 비해 양성대조군(PC), 실험군 E1, E2는 각각 61, 79, 85% 유의하게(p < 0.001) 낮았다.
- (2008)은 우유와 혼합한 녹차의 섭취 후에 피부 장벽 기능이 증진되었음을 확인하였다. 기초적인 안전성 확인결과, 주요 면역장기인 비장과 흉선의 절대무게에서 모든 군은 유의한 차이가 없었다. 본 연구의 후)진피 내">진피내 이들 세포들의 상당수와 함께 표피와 진피층의 비후가 확인되었다. 반면 백차 열수추출물 도포군은 염증 세포가 현저히 줄어들었으며 표피와 진피층의 비후 정도도 경감되었다. 아울러 반면, 백차 열수추출물 도포군은 대조군과 비교하여 이들 수치가 유의하게(p⁄0.05) 낮았으며 정상군 수치와 비슷하였다.
- 후)백차열수추출물">백차 열수추출물 도포군 E1, E2는 대조군(C)에 비해 비만세포수와 탈과립 정도가 현저하게 줄었으며, 양성대 조군(PC)은 대조군에 비해 약간 줄어 들은 것을 확인하였다.
- 후)절대 무게에서">절대무게에서 모든 군은 유의한 차이가 없었다. 본 연구의 실험결과를 종합할 때, hairless 마우스를 이용한 in vivo 실험에서 백차 열수추출물 경피 도포는 자외선 조사로 인해 유발된 피부장벽 손상 및 염증 반응에 상당한 개선 효과가 있음을 확인하였다.
- 수분함량은 실험 전 기간 동안 모든 군은 대조군(C)에 비해 유의하게(p < 0.001) 높았으며, 실험 4주 후 대조군에 비해 양성대조군(PC), 실험군 E1, E2는 각각 190, 207, 225% 유의하게(p < 0.001) 높았다.
- 실험 전 기간 동안 대조군과 비교하여 모든 군은 수분함량이 유의하게(p⁄0.001) 높았고, 특히 백차 열수추출물 도포군은 다른 모든 군에 비해 유의하게(p⁄0.001) 높았다.
- 실험 전기간 동안 모든 군은 대조군(C)에 비해 유의하게(p < 0.001) 낮았으며, 실험 4주 후 대조군에 비해 양성대조군(PC), 실험군 E1, E2는 각각 31, 41, 46% 유의하게(p < 0.001) 낮았다.
- 후)비후정도도">비후 정도도 경감되었다. 아울러 대조 군은 비만세포가 현저히 많이 관찰되었고 탈과립 정도가 심하게 나타난 반면, 백차 열수추출물 도포군은 비만세포가 적게 관찰되었고 탈과립 정도도 경미하게 나타나 정상군과 유사한 양상을 보였다. 혈액학적 profile을 분석한 결과, 대조군은 정상군에 비해 염증성 세포인 호중구, 림프구와 함께 001) 낮았다. 이들 실험결과를 통해 백차 열수추출물이 표피층내 피부장벽 손상완화에 상당히 효과적임을 확인할 수 있었다. Heinrich et al.
- 05) 낮았으며 정상군 수치와 비슷하였다. 이러한 혈액학적 profile 결과는 조직학적 관찰 결과와 부합하는 것으로서 백차 열수추출물이 UV 조사로 인한 염증반응에 상당한 완화효과가 있음을 확인시켜 준다. UVB 노출 전에 차의 정상군(N)에 비해 대조군(C)과 양성대조군(PC)에서 염증성 세포인총 백혈구, 호중구, 림프구 수가 유의하게 많았고(p⁄0.05), 적혈구, 헤모글로빈, 헤마토크리트, 혈소판 수치는 유의하게 (p⁄0.05) 적었다.
- 1A와 같다. 정상군(N)은 표피와 진피층 배열이 규칙적이며 염증관련 세포들이 거의 보이지 않은 반면, 대조군(C)은 표피와 진피가 두꺼워졌고 진피층 내 염증관련 세포들이 상당수 관찰되었으며 피지선의 증식이 관찰되었다. 이에 비해 피부의 염증반응 정도를 알아보기 위해 비침습적인 방법으로 홍반도를 측정한 결과, 실험 전 기간 동안 모든 군은 대조군에 비해 유의하게(p⁄0.001) 낮았고, 특히 백차 열수추출물 도포군은 다른 모든 군에 비해 유의하게(p⁄0.001) 낮았다.
- 피부조직을">2010). 피부조직을 현미경으로 관찰한 결과, 정상군은 호중구, 림프구, 대식구와 같은 염증성 세포들이 거의 보이지 않은 반면, 대조군은 진피내 이들 세포들의 상당수와 함께 표피와 진피층의 비후가 확인되었다. 반면 혈액학적 profile을 분석한 결과, 대조군은 정상군에 비해 염증성 세포인 호중구, 림프구와 함께 총 백혈구 수치가 유의하게(p⁄0.05) 많았다.
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