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문제 정의
- 본 연구는 막걸리의 장기 저장 중 산도 변화로 고유의 맛을 저해하는 원인균을 찾아 이를 개선시켜 저장성을 높이고자 했다. 그동안 산도 변화에 관한 선행연구는 주로 젖산균에 대한 것(So 등 1999; Seo 등 2005)이 주를 이루었으나, 산패의 주 원인균으로 단정하기에 미흡한 부분이 많다.
제안 방법
- 세균의 DNA는 Wizard genomic DNA purification kit(Promega. Co., Madison, WI, USA)를 이용하여 분리하고, 16S rRNA gene은 PCR(ploymerase chain reaction) 에 의해 9F(5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)와 1492R(5’- GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)을 사용하여 증폭하였다.
- 이에 따라 본 연구는 막걸리의 장기 보존 중 산패 원인은 초산균에 의한 영향이 클 것으로 추측하고, 그 원인균을 찾아 분리, 동정한 후 산도 변화를 조사하였다. 동정한 산패 원인균이 밝혀지면 그 억제 수단을 찾을 수 있게 되고 이것이 막걸리의 산패를 방지하여 막걸리 유통기간이 연장되고, 소비자들의 소비패턴에 맞는 양질의 맛 유지와 품질의 균일화에 기여할 것이라고 생각한다.
- 막걸리는 고온(25∼28℃)에서 단기간 발효했을 경우를 말하며(Technical service institute of National Tax Service 1997), 발효가 진행되면서 생성된 총산은 막걸리의 맛, 냄새와 직접 관련되며, 저장성에 영향을 준다(Hong HG 1984). 막걸리 산패 원인균을 찾기 위해 25℃에서 8일간 저장하면서 발효 기간 중의 균총 변화를 24시간마다 관찰하였으며, 균총 분석은 평판 도말법에 의하였다. 연속 희석법으로 희석된 막걸리 25 ㎕를 20 ㎖ YPD(Yeast extract 2.
- 막걸리 산패 원인균을 찾기 위해 25℃에서 8일간 저장하면서 발효 기간 중의 균총 변화를 24시간마다 관찰하였으며, 균총 분석은 평판 도말법에 의하였다. 연속 희석법으로 희석된 막걸리 25 ㎕를 20 ㎖ YPD(Yeast extract 2.5 g, Peptone 5 g, Dextrose 5 g, agar 5 g; Difco, Spark, MD, USA)와 20 ㎖ MRS(Lactobacilli MRS broth 9.75 g, agar 5 g; Difco, Spark, MD, USA) 평판 배양 배지에 도말하고, 30℃ incubator(Han Baek Scientific Co., Bucheon, Korea)에서 2일간 배양한 뒤 생성되는 colony의 형태, 색, 크기로 분류하였고, 현미경 관찰에 의해 균의 종류를 구별했다. 실험 결과, 탁주의 균총 분석에서 가장 큰 균종 다양성을 보인 YPD 평판 배양 배지를 사용하였다.
- 순수 분리한 각각의 균은 CaCO3를 1 g 첨가한 YPD와 MRS 평판 배양 배지에 도말하고, 30℃에서 3일간 배양하면서 투명대의 생성 여부를 관찰하였다. 분리균의 산 생성력은 투명대의 크기를 비교 확인하였다.
- 를 1 g 첨가한 YPD와 MRS 평판 배양 배지에 도말하고, 30℃에서 3일간 배양하면서 투명대의 생성 여부를 관찰하였다. 분리균의 산 생성력은 투명대의 크기를 비교 확인하였다.
- 산 생성 균을 5 ㎖ MRS broth 배지에 접종하여 30℃에서 2일간 배양하였고, 막걸리 50 ㎖에 배양액 1 ㎖(2%)씩을 주입하고, 30℃에서 6일간 저장하면서 산도를 관찰하였다.
- 균주의 동정은 16S rRNA 염기서열을 Database 균주들의 것과 비교하여 결정하였다. 세균의 DNA는 Wizard genomic DNA purification kit(Promega.
- PCR 반응조건은 ① 94℃ 5 min; ② 94℃ 30 sec; ③ 55℃ 30 sec; ④ 72℃ 1 min 30 sec; ⑤ 72℃ 5 min로 하였으며, ②∼④의 조건을 35 cycle 반복하였다. PCR 반응이 끝난 시료는 Wizard Ⓡ SV Gel and PCR Clean-up System(Promega. Co., Madison, WI, USA)을 이용하여 정제한 후 염기서열을 Bioneer사(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 결정하였다. 균주는 염기서열을 BLAST와 MSU Ribosomal Database Project를 사용하여 분석한 결과를 바탕으로 동정하였다.
- , Madison, WI, USA)을 이용하여 정제한 후 염기서열을 Bioneer사(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 결정하였다. 균주는 염기서열을 BLAST와 MSU Ribosomal Database Project를 사용하여 분석한 결과를 바탕으로 동정하였다.
- 25℃에서 8일간 관찰한 산패 막걸리에서 13균주를 분리하고, CaCO3를 첨가한 YPD와 MRS 평판 배양 배지에서 산 생성 활성을 비교 관찰하였다. JM8YS2가 배양 3일째 가장 큰 투명대를 형성했고, 그 외 투명대가 큰 JM4YS1과 투명대가 약한 JM3YS2와 JM4YS3를 분리하였다(Table 1).
- 산 생성이 강한 JM8YS2, JM4YS1와 산 생성이 약한 JM3YS2, JM4YS3를 시판 막걸리에 각각 따로 접종하고, 30℃에서 6일간 저장하면서 산도를 관찰하였다. 산도는 JM8YS2가 저장 5일차까지 0.
- 두 균의 시판 막걸리에서 산패 효과를 관찰하기 위해 생 막걸리 50 ㎖에 A. pasteurianus와 L. casei를 각각 그리고 혼합하여 2% 되도록 접종하고, 30℃에서 7일간 저장하면서 산도, 균총 분석을 하였다. 산도 변화는 A.
- 막걸리 산패시 A. pasteurianus와 L. casei가 각각 독자적으로 산패를 일으키는지, 막걸리에 있는 타 균에 의해 산패를 일으키는지를 확인하기 위해 생 막걸리를 1 ㎏f/㎠ 121℃(Steam Sterilizer, HS-9090, Han Shin Medical Co., Ltd., Seoul, Korea) 로 멸균하고, 이 열처리 막걸리 50 ㎖에 A. pasteurianus와 L. casei를 각각 그리고 혼합하여 2% 되도록 접종했다. 30℃에서 7일간 저장하면서 산도, 균총 분석하면서 생 막걸리와 비교 관찰하였다.
- casei를 각각 그리고 혼합하여 2% 되도록 접종했다. 30℃에서 7일간 저장하면서 산도, 균총 분석하면서 생 막걸리와 비교 관찰하였다.
- casei로 분리 동정되었다. 넷째, 막걸리를 30℃에서 7일간 저장하면서 A. pasteurianus와 L. casei를 각각 그리고 혼합 하여, 생 막걸리 및 열처리 막걸리에 접종하였다. 생 막걸리에서의 산도 변화를 보면 A.
대상 데이터
- 막걸리는 전주 생 밀 막걸리(비 살균막걸리)로 전주시 교동 한옥마을 도매상에서 공장 출하 시 바로 구입하여 사용하였다.
- , Bucheon, Korea)에서 2일간 배양한 뒤 생성되는 colony의 형태, 색, 크기로 분류하였고, 현미경 관찰에 의해 균의 종류를 구별했다. 실험 결과, 탁주의 균총 분석에서 가장 큰 균종 다양성을 보인 YPD 평판 배양 배지를 사용하였다. 종류별로 분류된 균은 각각 순수 분리한 후, 동결배지(10% glycerin) 0.
- 09로 감소했다. 대조구는 균의 성장이 없었고, L. casei는 1일째 9.33에서 7일째 8.20까지였다. 혼합 접종한경우 1일째 8.
성능/효과
- 1과 같다. 저장 1일째 산도가 0.52%에서 3일째 0.56%로 소량 증가하다가, 6일째부터 급격히 증가하여 8일째 1.13%로 최고점에 도달했다. 적정산도는 발효생성물의 정도를 나타내는 지표로서, 발효저장식품의 신선도 판정에 중요한 척도로 사용되고 있다(Lee 등 1995).
- 총 산 함량이 많으면 이상 발효에 의해 막걸리가 산패된 것으로 여겨진다(Park & Lee 2002). 따라서 본 실험에서 막걸리는 25℃에서 6일째 급격한 산도 증가로 산패됨을 알 수 있었다.
- 즉 막걸리의 산도는 효모가 사멸하는 6일째 급격히 증가하는 것으로 보아 막걸리의 산패는 효모의 사멸과 연관이 있으며, 이는 Min 등(2011)이 보고한 ‘저장 중 효모균수의 감소’와 비슷한 결과를 나타냈다. 효모가 사멸했지만 균종수와 총 균수는 변화가 없는 것을 볼 때 효모의 사멸을 시점으로 산 생성 균이 많이 생성되었음을 암시한다(Fig. 1).
- JM8YS2가 다른 균에 비해 산도가 월등히 높게 나타나 막걸리 산패의 주 원인균 중의 하나가 JM8YS2임을 확인할 수있었다.
- 50%로 산 생성이 약하였다. 두 균을 혼합한 경우, 산도의 변화는 0.32%에서 6.38%로 A. pasteurianus 단독 접종한 경우보다 산 생성이 약간 더 많은 것으로 나타났다(Fig. 3). 이러한 결과로 보면 초산균인 A.
- 총 균수 변화를 보면, A. pasteurianus의 경우, 저장 1일째 8.99(log CFU/g)에서 5일째까지 균수가 유지되다가 6일째부터는 완전 사멸하였다(Fig. 4). L.
- 초산균인 A. pasteurianus를 첨가한 열처리 막걸리의 산도는 0.32%에서 2.74%로 크게 증가되었다(Fig. 5). A.
- 5). A. pasteurianus와 L. casei를 혼합 접종한 열처리 막걸리는 A. pasteurianus 단독 첨가에 비해 산 생성이 높았고, L. casei는 0.32%에서 0.35%로 거의 증가되지 않았다. 생 막걸리의 결과와 마찬가지로 열처리 막걸리에서도 대조구와 L.
- 35%로 거의 증가되지 않았다. 생 막걸리의 결과와 마찬가지로 열처리 막걸리에서도 대조구와 L. casei 첨가구는 산 생성을 유도 하지 못하는 반면, A. pasteurianus 단독 첨가와 L. casei와 혼합 첨가는 산 생성을 크게 유도하여 A. pasteurianus가 산패 원인균 중의 하나임을 알 수 있다. 총 균수에서도 A.
- 둘째, 6∼8일째 산도가 크게 증가하지만 균종수가 5종으로 일정하고, 총 균수가 6일째 8.55에서 8일째 8.65로 일정한 것은 산 생성균이 나타나는 등 균 종류의 변화를 의미한다.
- 시판 막걸리의 유통 중 산패 원인균을 찾고자 시도한 결과를 요약하면 다음과 같다. 첫째, 막걸리를 실온 25℃에 저장 했을 때 3일째까지는 소량 증가하다가 6일째 0.63%, 8일째 1.02%로 산도의 급격한 증가와 동시에 효모의 완전 사멸로 막걸리 본연의 맛을 상실하였다. 둘째, 6∼8일째 산도가 크게 증가하지만 균종수가 5종으로 일정하고, 총 균수가 6일째 8.
- 이는 막걸리의 산패가 특정 산패 균이 발생하는 데 원인이 있음을 알 수 있다. 셋째, 산패된 막걸리에서 산 생성력이 가장 큰 균을 분리하였고, A. pasteurianus 와 L. casei로 분리 동정되었다. 넷째, 막걸리를 30℃에서 7일간 저장하면서 A.
- casei를 각각 그리고 혼합 하여, 생 막걸리 및 열처리 막걸리에 접종하였다. 생 막걸리에서의 산도 변화를 보면 A. pasteurianus 접종구가 저장 1일째 0.32%에서 7일째 6.03%로, L. casei 접종구는 0.31%에서 3.50%로 나타났으며, 혼합 접종구는 0.32%에서 6.38%로 나타나 A. pasteurianus 접종구 와 혼합 접종구에서의 산 생성이 크게 증가하였다. 열처리 막걸리에서도 생 막걸리와 마찬가지로 A.
- pasteurianus 접종구 와 혼합 접종구에서의 산 생성이 크게 증가하였다. 열처리 막걸리에서도 생 막걸리와 마찬가지로 A. pasteurianus 접종구와 혼합 접종구의 산 생성이 크게 증가하여 A. pasteurianus가 주 산패균이고, A. pasteurianus 는 L. casei와 혼합될 때 산 생성에서 synergy 효과를 나타내었다.
- 3). 이러한 결과로 보면 초산균인 A. pasteurianus가 주 산패균이며, 젖산균 L. casei와 공존하면서 산 생성에서 synergy 효과를 나타내는 것으로 보인다.
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