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문제 정의
- 본 연구에서는 한국산 겨우살이의 메탄올 추출물 및 용매분획물에 대하여 주요 식중독세균의 증식 억제 효과 및 항산화 효과를 조사하여 식품 소재로서의 활용을 증진하고 나아가 천연보존료 개발 관련 연구에 도움이 되고자 하였다.
가설 설정
- 3)All values are expressed as mean±SD of triplicate determinations.
제안 방법
- Folin-Ciocalteu reagent 시약을 이용하여 시료 중의 총페놀화합물 함량을 분석하였다(15). 시료 100 μL에 2 N Folin-Ciocalteau’s phenol reagent 50 μL와 20% Na2CO3 300μL를 가하여 실온에서 15분간 방치한 후 증류수 1 mL을 넣고 10,000 rpm으로 원심분리하고 그 상등액을 725 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 겨우살이 추출물 및 용매분획물의 항균활성을B. cereus, B. subtilis, E. coli, L. monocytogenes, S. typhimurium, S. aureus 의 6 종의 식중독세균에 대하여 paper disc diffusion method를 이용하여 항균활성을 측정하고 간장, 청량음료 등의 식품보존제로 사용되는 benzoic acid와 비교하였다. Table 2에서 보는 것과 같이 겨우살이 methanol 추출물은 n-hexane, butanol, water 분획물과 같이 15 mg/disc 농도에서는 공시 균주에 대하여 항균활성을 나타내지 않았다.
- 각 균주의 생육과 보존을 위해 brain heart infusion, nutrient broth, tryptic soy broth에 agar (Difco, USA)를 첨가한 배지를 사용하여 B. cereus, B. subtilis는 30℃, E. coli O157, L. monocytogenes, S. typhimurium, S. aureus를 37℃에서 18∼24시간 동안 배양하여 사용하였다.
- 겨우살이 추출물과 분획물의 항산화 효과는 DPPH radical 소거 활성으로 측정하였다(16). 시료 100 μL와 DPPH 용액 900 μL를 혼합하고, 암실에서 30 분 간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 국내산 겨우살이를 천연소재 및 천연 보존료로서 활용가능성을 탐색하기 위하여 겨우살이의 methanol 조추출물과 n-hexane, ethyl ether, ethyl acetate, butanol 분획물의 식중독 세균 억제 활성과 항산화활성을 조사하였다. Ethyl ether와 ethyl acetate 분획물은 공시균주에 대하여 0.
- 멸균된 paper disc (Toyo Roshi 27, 8 mm)를 평판배지 표면에 밀착시키고 시료를 50 μL 만큼 흡수시켜 건조한 후, 30℃와 37℃ incubator에서 12∼24시간 배양하여 캘리퍼스 (Dial calipers, Alltrade, US)를 이용하여 paper disc 주위의 inhibition zone의 직경(mm)을 측정하였다.
- 실험을 위해서 각 broth에 균주를 접종하여 Bacillus 2종은 30℃, 나머지 균주들은 37℃ incubator에서 배양하여 활성화 시킨 균을 UV/Visspectrophotometer (UV/Vis 1601 PC, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)를 이용하여 660 nm에서 흡광도를 0.4로 조절한 후각 평판배지에 200 μL씩 접종 도말하였다.
- 시료 100 μL에 2 N Folin-Ciocalteau’s phenol reagent 50 μL와 20% Na2CO3 300μL를 가하여 실온에서 15분간 방치한 후 증류수 1 mL을 넣고 10,000 rpm으로 원심분리하고 그 상등액을 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 gallic acid를 사용하여 얻은 표준곡선의 회귀식에서 시료 중의 총페놀화합물의 함량을 환산하였다.
대상 데이터
- Benzoic acid, 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH), Folin-Ciocalteau's phenol reagent, gallic acid, 2,4,6-Tris(2-pyridyl)-1,3,5-triazine (TPTZ), trolox는 Sigma chemical Co (St. Louis. Mo, USA) 제품을 사용하였고, 추출 용매로 사용한 butanol, ethyl acetate, ethyl ether, n-hexane, methanol, dimethylsulfoxide (DMSO)는 분석용 일급 시약(Merck Co, Darmstadt, Germany)을 사용하였다.
- 멸균된 paper disc (Toyo Roshi 27, 8 mm)를 평판배지 표면에 밀착시키고 시료를 50 μL 만큼 흡수시켜 건조한 후, 30℃와 37℃ incubator에서 12∼24시간 배양하여 캘리퍼스 (Dial calipers, Alltrade, US)를 이용하여 paper disc 주위의 inhibition zone의 직경(mm)을 측정하였다. 대조군으로는 benzoic acid를 사용하였다. 최소저해농도 (minimum inhibitory concentration, MIC) 측정은 96-well plate를 이용한 액체배지희석법으로 측정하였다.
- 실험에 사용한 겨우살이는 2008년도에 지리산 일대에서 채취하여 실온에서 건조하여 냉암소에 보관하면서 사용하였다. Benzoic acid, 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH), Folin-Ciocalteau's phenol reagent, gallic acid, 2,4,6-Tris(2-pyridyl)-1,3,5-triazine (TPTZ), trolox는 Sigma chemical Co (St.
- 항균성 실험에 사용한 균주는 그램 양성균인 Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus 4종, 그램 음성균인 Escherichia coli O157, Salmonella typhimurium 2종을 사용하였다 (Table 1). 각 균주의 생육과 보존을 위해 brain heart infusion, nutrient broth, tryptic soy broth에 agar (Difco, USA)를 첨가한 배지를 사용하여 B.
데이터처리
- 또한 SAS (statistical analysis system, version 8.0, 2004)를 이용하여 Duncan의 다중검정법으로 유의차를 검정하였다(p<0.05).
- 실험은 3회 반복하여 수행하였으며 측정한 결과를 평균치±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- FRAP 활성은 시료 중의 항산화 물질에 의해 Fe(Ⅲ)-TPTZ가 Fe(Ⅱ)-TPTZ 혼합물로 환원되는 원리에 의한 Benzie등(17)의 방법으로 측정하였다. 반응용액 (cocktail solution)을 acetate buffer (pH 3.
- 대조군으로는 benzoic acid를 사용하였다. 최소저해농도 (minimum inhibitory concentration, MIC) 측정은 96-well plate를 이용한 액체배지희석법으로 측정하였다. 준비한 plate에 각각의 broth와 일정한 농도의 시료를 각각 0.
- 항균활성의 측정은 paper disc를 이용한 agar diffusion method(3,14)를 사용하였다. 실험을 위해서 각 broth에 균주를 접종하여 Bacillus 2종은 30℃, 나머지 균주들은 37℃ incubator에서 배양하여 활성화 시킨 균을 UV/Visspectrophotometer (UV/Vis 1601 PC, Shimadzu Co.
성능/효과
- 25∼25 mg/mL로 나타났다. Ethyl ether 분획물은 L. monocytogenes, E. coli, S. aureus에 대하여 낮은 MIC 값을 나타내었으며 B. subtilis, S. typhimurium에 대하여는 ethyl acetate 분획물이 보다 낮은 억제 효과를 나타내었다. 특히, ethyl ether 분획물은S.
- 8 mm의 inhibition zone을 나타내었으며 특히 ethyl ether는B. cereus에 대하여 가장 강한 항균효과를 보였다. 또한 겨우살이의 ethyl ether 분획물은 S.
- 겨우살이 ethyl ether 분획물은 B. cereus에 대해 inhibition zone이 1.8±0.2 mm로서 공시 균주 중에서 가장 우수한 항균력을 보였고, E. coli를 제외하고 나머지 균주에서도 1.3∼1.4 mm의 저해환을 나타내어서 대조구로 사용된 benzoic acid (2.5 mg/mL)보다 높거나 비슷한 항균활성을 나타내었다.
- 그리고 이들 식중독세균에 대한 겨우살이 추출 및 분획물의 최소저해농도를 측정한 결과를 Table 3에 나타내었다. 겨우살이 methanol 추출물 및 헥산분획물의 최소저해농도는 실험에 사용한 모든 식중독 세균에 대하여 50 mg/mL으로 낮은 억제 효과를 보였다. 그러나 용매분획물 중 ethyl ether, ethyl acetate분획물은 모든 균주에 대하여 최소저해농도가 보다 낮은 6.
- 25 mg/mL의 MIC를 나타내었다. 겨우살이 추출물 및 용매분획물의 항산화 활성은 ethyl ether 분획물에서 가장 높게 나타났다. 겨우살이의 총 페놀함량은 ethyl ether 획분에서 가장 높았으며 ethyl acetate, n-hexane, butanol 및 methanol 조추출물과 water 획분의 순으로 낮게 나타났다.
- 2에 나타내었다. 겨우살이의 ethyl ether 분획물이 84% 정도로 가장 높은 DPPH radical 소거능력을 보였다. 다음으로는 ethyl acetate와 butanol 분획물이 비슷하게 51%정도의 활성을 나타내었으며 이는 표준물질로 사용한 gallic acid (100 μM)의 약 2 배 이상의 높은 수준이었다.
- 산화 및 환원 반응을 이용하는 FRAP 방법으로 겨우살이 추출 및 분획물의 항산화 활성을 조사한 결과는 Table 4와 같다. 겨우살이의 물분획물과n-hexane 분획물의 항산화 활성이 아주 낮게 나타난 것에 비하여, ethyl ether 및 ethyl acetate 분획물의 항산화 활성은 표준물질인 trolox 기준 활성으로 비교할 때 거의 10 배 이상 높게 나타났다. 이러한 결과는 앞 부분에서 서술한 DPPH radical 소거 활성의 경향과 거의 유사하였다.
- 겨우살이 추출물 및 용매분획물의 항산화 활성은 ethyl ether 분획물에서 가장 높게 나타났다. 겨우살이의 총 페놀함량은 ethyl ether 획분에서 가장 높았으며 ethyl acetate, n-hexane, butanol 및 methanol 조추출물과 water 획분의 순으로 낮게 나타났다. 따라서 ethyl ether 획분의 강한 항균활성과 항산화 활성은 획분 중에 풍부한 총페놀화합물과 상관이 있으므로 향후 이 획분 중의 활성물질의 분리 연구가 한국산 겨우살이의 기능성 소재화에 필요하다고 생각된다.
- 본 연구에서 겨우살이 추출 및 분획물에 대한 총페놀화합물의 함량을 조사한 결과를 Table 5에 나타내었다. 겨우살이의 총페놀화합물의 함량은 ethyl ether 획분에서 가장 높았으며 그 다음이 ethyl acetate, n-hexane, butanol 및 methanol 조추출물과 물 획분의 순으로 낮게 나타났다. Clark 등(23)은 식물체 중의 페놀성 물질이 항균작용을 나타낸다고 보고하였으며, 암대극 추출물에서 페놀성 화합물의 함량이 높을수록 항산화 및 항균활성이 높게 나타났다(24)는 보고가 있다.
- Table 2에서 보는 것과 같이 겨우살이 methanol 추출물은 n-hexane, butanol, water 분획물과 같이 15 mg/disc 농도에서는 공시 균주에 대하여 항균활성을 나타내지 않았다. 반면, ethyl ether 분획물과 ethyl acetate 분획물은 항균작용을 가지고 있는 것으로 나타났으며 특히 ethyl ether 분획물이 억제 효과가 우수하였다. 겨우살이 ethyl ether 분획물은 B.
후속연구
- 겨우살이의 총 페놀함량은 ethyl ether 획분에서 가장 높았으며 ethyl acetate, n-hexane, butanol 및 methanol 조추출물과 water 획분의 순으로 낮게 나타났다. 따라서 ethyl ether 획분의 강한 항균활성과 항산화 활성은 획분 중에 풍부한 총페놀화합물과 상관이 있으므로 향후 이 획분 중의 활성물질의 분리 연구가 한국산 겨우살이의 기능성 소재화에 필요하다고 생각된다.
- 따라서 sodium propionate는 1.5∼11 mg/mL(19), sorbic acid는 3.0 mg/mL (20)에서 미생물 증식 억제효과가 있었다는 보고로 미루어 보면 겨우살이의 ethyl ether 분획물은 실험에 사용한 그램(+) 및 그램(-) 식중독 균에 대하여 폭넓은 항균활성을 나타내었으므로 천연 보존제로서 이용 가능성이 있을 것으로 사료된다.
- 이러한 결과는 앞 부분에서 서술한 DPPH radical 소거 활성의 경향과 거의 유사하였다. 따라서 상업적으로 사용되는 표준물질과 비교하여 식중독세균에 대한 증식억제 활성과 항산화성이 확인된 겨우살이의 ethyl ether 및 ethyl acetate 분획물은 가공 식품의 품질 수명을 연장할 수 있는 첨가물 및 식품 보존제로서 활용이 가능한 소재로서 향후 더욱 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 따라서 ethyl ether 획분이 식중독 세균에 대한 증식 억제 활성과 항산화 활성이 높게 나타난 것은 획분 중에 풍부한 총페놀화합물이 활성인자로 작용하는 것으로 생각될 수 있다. 한국산 겨우 살이의 ethyl acetate 가용성 분획으로부터 항산화 활성이 있는 homo-flavoyadorinin-B가 분리된 보고(25)는 있으나, ethyl ether 획분 중의 활성 물질에 관하여는 보고된 바가 없으므로 항균 및 항산화 활성이 높은 페놀성 화합물의 분리가 후속 연구로서 기대된다.
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