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문제 정의
- 그러나 현재까지 동물복지 측면에서 EU를 중심으로 법적 규제 대상이 되고 있는 사육 밀도에 따른 가금의 스트레스 분석을 유전체 수준의 유전자 발현을 보고한 연구는 없는 실정이다. 따라서 본 연구는 고밀도 사양체계가 브로일러에서 간의 지놈 전사체에 어떤 영향을 미치는지 스트레스와 지방대사 연관 유전자들을 중심으로 조사하였다.
제안 방법
- Microarray 분석에서 확보한 자료 중 스트레스 및 지방대사연관 유전자들을 선발하여 유전자 heatmap을 작성하였다 (Fig. 1). Heatmap은 처리별 유전자간 발현의 차이를 색으로 나타내어 쉽게 처리에 다른 반응을 확인 할 수 있었다.
- PCR 반응물은 cDNA (10 ng) 5 μl, primer (5 pmole)는 각각 0.5 μl, SYBR Green (Bio-Rad) 10μl, ddH2O 4 μl를 넣어 총 20 μl가 되도록 혼합하고 95℃ 3분간 최초 변성을 시킨 다음 95℃ 15초간 변성, 60℃에서 15초간 접합, 72℃ 40초간 확장과정을 40회 반복하였다.
- 각 처리군의 공시동물의 조직으로부터 RNeasy kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 total RNA를 추출하였다. cDNA 합성은 Improm-II Reverse Transcription System (Promega, Fitchburg, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
- , Santa Clara, USA)과 real-time RT-PCR을 이용하여 microarray 발현 유전자들의 검증에 이용하였다. 각 처리군의 공시동물의 조직으로부터 RNeasy kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 total RNA를 추출하였다. cDNA 합성은 Improm-II Reverse Transcription System (Promega, Fitchburg, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
- 본 시험에 공시된 동물은 육용계 수컷 1일령 Ross종 162수를 (주)올품에서 구입하여 2일간 적응 기간을 거쳐 3일령에 본 시험에 이용하였다. 공시된 시험동물은 무작위로 선별하여 대조군(Control, 표준밀도)과 고밀도군(High stocking denssity, HSD; 고밀도) 으로 배치하여 본 대학교 종합농장 동물사육장에서 5 주 동안 케이지 사육을 실시하였다. 대조군 54수의 사육밀도는 495 cm2/수(닭 사육시설 소요면적 농림부 고시 제2004-89호에 준함), 고밀도군 108수는 245 cm2/수의 사육밀도를 유지하였다.
- 사양시험 종료 후 각 시험구당 평균체중에 가까운 8수씩을 처리별로 선정하여 간조직을 채취하여 액체질소에 급속 냉동하였다. 분석항목으로는 간에서 전사체 발현(global gene expression) 분석(Affymetrix Chicken Genome Array X, Affymetrix, Inc., Santa Clara, USA)과 real-time RT-PCR을 이용하여 microarray 발현 유전자들의 검증에 이용하였다. 각 처리군의 공시동물의 조직으로부터 RNeasy kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 total RNA를 추출하였다.
- 사양시험 동안 사양성적(성장 및 증체율, 사료섭취량 및 사료요구율) 및 폐사율을 조사하였다. 사료섭취량, 체중 및 사료요구율은 시험개시와 종료(35일령)시에 측정하였다. 사료요구율은 시험기간 중 평균 사료섭취량을 평균체중 증가량으로 나누어 계산하였다.
- 사료섭취량, 체중 및 사료요구율은 시험개시와 종료(35일령)시에 측정하였다. 사료요구율은 시험기간 중 평균 사료섭취량을 평균체중 증가량으로 나누어 계산하였다.
- 사양시험 동안 사양성적(성장 및 증체율, 사료섭취량 및 사료요구율) 및 폐사율을 조사하였다. 사료섭취량, 체중 및 사료요구율은 시험개시와 종료(35일령)시에 측정하였다.
- 사양시험 종료 후 각 시험구당 평균체중에 가까운 8수씩을 처리별로 선정하여 간조직을 채취하여 액체질소에 급속 냉동하였다. 분석항목으로는 간에서 전사체 발현(global gene expression) 분석(Affymetrix Chicken Genome Array X, Affymetrix, Inc.
- 육계에서 고밀도사육이 유전체의 발현에 미치는 영향을 관찰하고자 고밀도와 표준밀도에서 사육된 35일령 육계의 간에서 total RNA를 추출한 다음 mRNA microarray 분석을 실시하였다. 처리에 따른 유전자 발현차이(DEG, differentially expressed gene)를 보면, 대조구 대비 2배 이상 유전자의 발현이 증가한 유전자의 수는 602개 였으며, 발현이 감소한 유전자의 수는 942개로, 처리에 따른 총 DEG는 1,544개로 이는 현재 알려진 닭의 총 전사체(RNA transcripts) 32,773개의 4.
- 대조군 54수의 사육밀도는 495 cm2/수(닭 사육시설 소요면적 농림부 고시 제2004-89호에 준함), 고밀도군 108수는 245 cm2/수의 사육밀도를 유지하였다. 점등은 전 사양기간 동안 24시간 종일 전등을 실시하였고, 계사온도는 일령별로 32℃에서 22℃까지 본 대학의 육계 사육실 온도관리 프로그램에 따라 조절하였다.
- 표준사양군과 고밀도 사양군의 시험동물의 간에서 RNeasy kit (Qiagen)으로 추출한 total RNA는 DNALINK, INC (Seoul, Korea)에 의뢰하여 Affymetrix Chicken Genome Array X (Affymetrix, Inc.)로 microarray (Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7G)를 실시하였다. 같은 처리구의 total RNA는 동일량을 각각 취하여 합한 다음 microarray 시료로 이용하였다[15].
대상 데이터
- 본 시험에 공시된 동물은 육용계 수컷 1일령 Ross종 162수를 (주)올품에서 구입하여 2일간 적응 기간을 거쳐 3일령에 본 시험에 이용하였다. 공시된 시험동물은 무작위로 선별하여 대조군(Control, 표준밀도)과 고밀도군(High stocking denssity, HSD; 고밀도) 으로 배치하여 본 대학교 종합농장 동물사육장에서 5 주 동안 케이지 사육을 실시하였다.
데이터처리
- 본 시험에서 얻어진 결과는 평균±표준오차로 표시하였다.
- 1C). 유전자 발현을 microarray로 분석한 다음 일부 유전자들을 선택하여 real-time PCR을 실시하여 microarray 결과와 비교분석 하였다(Table 5). 대체적으로 microarray의 결과와 real-time PCR의 결과는 발현정도의 차이는 있었지만 비슷한 경향을 보였다.
- 본 시험에서 얻어진 결과는 평균±표준오차로 표시하였다. 통계분석은 Proc GLM을 이용하여 분산분석을 하였으며[22], 대조구와 처리구간 유의성 검정은 t-test를 이용하여 분석하였다.
이론/모형
- Real-time PCR은 MyiQ (Bio-Rad, Herculus, USA)을 이용하여 시행하였다. Real-time PCR을 위한 primer의 정보는 Table 1에 제시하였다.
- 5℃씩 상승시켜 형광접합물질인 SYBR Green이 떨어져 나오는 마지막 과정을 수행하였다. 유전자 발현의 상대적 발현양은 2-∆∆Ct 방법을 이용하였다[18]
성능/효과
- 35일 동안 사양 시험한결과, 대조구와 비교하여 고밀도(HSD) 사양 육계에서 체중, 증체량, 사료섭취량이 유의적(p<0.05)으로 감소되는 것으로 나타났다.
- 7%에 해당된다. DEG의 기준을 1.5배로 낮출 경우, 처리에 의해 증가된 유전자 수는 1,878개, 감소된 유전자 수는 2,380개로 증가하게 되어 총 전사체 대비 13.1%로 고밀도 사양이 유전체의 전사에 상당한 영향을 미치고 있음을 보여 주었다.
- Table 3에 제시된 바와 같이 지방산 합성에 관여하는 효소들(ACSL5, TMEM195, ELOVL6)의 유전자 발현증가와 지방산산화(β-oxidatin)에 관여하는 효소들(ACAA1, ACOX1, EHHADH, LOC423347, CPT1A)의 RNA 발현 증가를 볼 수 있었다.
- 결론적으로 본 연구는 닭의 주요 대사기관인 간에서 밀사에 의한 스트레스가 지방합성과 지방산 분해에 영향을 미치고 있음을 보여 주었다. 밀사에 의한 사육방식은 외적으로 증체량 및 사료효율 등의 사양성적에도 영향을 미치지만, 동물의 분자 수준(DNA), 세포 수준(ER stress), 면역체계(스트레스)에도 불리한 환경을 제공할 수 있음을 보여 주었다.
- ER stress는 단백질형성이 이루어지는 소포체내에서 일어나는 unfolded protein response (UPR) 현상으로 알려져 있으며, 포유동물에서 비만, 당뇨, 인슐린 저항성 및 염증반응 등을 유발하는 것으로 알려져 있다[8]. 따라서 육계의 고밀도 사양체계는 외형적으로 사양성적의 감소도 일어나지만 동물의 분자 수준(DNA), 세포 수준(ER stress), 면역체계에도 불리한 환경이 될 수 있음을 보여 주었다.
- Heatmap은 처리별 유전자간 발현의 차이를 색으로 나타내어 쉽게 처리에 다른 반응을 확인 할 수 있었다. 또한 2-fold 미만의 유전자발현 차이로 간과해서 지나칠 수 있는 유전자들(예, SCD, FASN, FABP4)의 발현도 확인 할 수 있었다. 스트레스 마커 유전자들인 HMGCR과 HSP90 (Fig.
- 결론적으로 본 연구는 닭의 주요 대사기관인 간에서 밀사에 의한 스트레스가 지방합성과 지방산 분해에 영향을 미치고 있음을 보여 주었다. 밀사에 의한 사육방식은 외적으로 증체량 및 사료효율 등의 사양성적에도 영향을 미치지만, 동물의 분자 수준(DNA), 세포 수준(ER stress), 면역체계(스트레스)에도 불리한 환경을 제공할 수 있음을 보여 주었다. 따라서 닭의 사양관리에서 사육밀도를 적절한 수준이하로 줄여 스트레스를 최소화 시키는 것이 좋을 것으로 사료된다.
- 밀사와 체지방성분 변화에 대한 연구가 필요한 것으로 사료된다. 본 연구에 의하면 밀사 후 닭의 간에서는 지방을 합성하기 위한 유전자들이 활발하게 작용을 하고, 동시에 합성된 지방산을 분해하여 에너지를 생산하기 위한 지방산의 산화도 활발하게 일어나고 있음을 볼 수 있다. 밀사는 닭에게 스트레스를 유발하고 산육 성적에도 부정적으로 나타났는데 (Table 2), 이는 근육 성장뿐만 아니라 스트레스로 인한 지방산의 과다 분해에 의하여 지방조직내 지방의 축적이 대조구에 비하여 낮은 것으로 추정된다.
- 따라서 스트레스 연관 동물 시험의 연구결과에서 대부분의 경우 HMGCR은 민감하게 반응하여 스트레스 마커로서 잘 활용되고 있음을 알 수 있다. 본 연구에서도 고밀도 사양체계에서 이 유전자의 발현이 표준 사양에 비하여 약 2.6배 증가하였음을 볼 수 있었다. HSP90α의 경우 2.
- HSPA5 (GRP78/Bip), DNAJC3 그리고 ATF4은 endoplasmic reticulum (ER) stress 관련 마커 유전자로 잘 알려져 있다[24]. 본 연구에서도 이들 유전자들은 고밀도 사양군에서 유전자의 발현이 2-3배 증가함을 볼 수 있었다. 이는 식이성 포화지방산이나 콜레스테롤등에 의해 유도되는 ER stress [6]가 고밀도 사양체계에서도 발생 할 수 있음을 알 수 있다.
- 또한 2-fold 미만의 유전자발현 차이로 간과해서 지나칠 수 있는 유전자들(예, SCD, FASN, FABP4)의 발현도 확인 할 수 있었다. 스트레스 마커 유전자들인 HMGCR과 HSP90 (Fig. 1A) 등과 ER stress의 마커유전자인 XBP1, ATF4, HSPA5 (Fig. 1A, 1B) 등이 대조구에 비하여 붉은 색에 더 가깝게 표지되어 유전자의 발현이 증가함을 보여 주었다. 지방대사 연관 유전자들인 SREBP1과 ACOX1 등은 고밀도 사양체계에서 발현의 증가를 보였으며, FABP4과 FASN 등은 처리에 큰 변화가 없음을 보여 주었다(Fig.
- 육계의 사육밀도에 따른 스트레스관련 유전자의 발현을 살펴본 결과 HMGCR, HSP90α, HSPA5 (GRP78/Bip), DNAJC3, ATF4 등과 같은 단백질은 증가 하였으며, interferon-γ, PDCD4 등은 감소하였다(Table 3, 4).
- 7%)에 비해 폐사율이 현저히 높은 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 본 실험에서 스트레스 요인으로 처리된 높은 사육밀도가 증체량, 사료섭취량 및 폐사율에 영향을 주었으며, 고밀도 사양에 의해 육계에 스트레스가 유발되었음을 확인하였다. 이는 고온 스트레스에 만성적으로 노출된 육계(32-34℃)에서 증체량, 사료섭취량, 사료효율이 감소했다는 보고[1,19]와 유사함을 보여주었다.
- 1A, 1B) 등이 대조구에 비하여 붉은 색에 더 가깝게 표지되어 유전자의 발현이 증가함을 보여 주었다. 지방대사 연관 유전자들인 SREBP1과 ACOX1 등은 고밀도 사양체계에서 발현의 증가를 보였으며, FABP4과 FASN 등은 처리에 큰 변화가 없음을 보여 주었다(Fig. 1C). 유전자 발현을 microarray로 분석한 다음 일부 유전자들을 선택하여 real-time PCR을 실시하여 microarray 결과와 비교분석 하였다(Table 5).
- 육계에서 고밀도사육이 유전체의 발현에 미치는 영향을 관찰하고자 고밀도와 표준밀도에서 사육된 35일령 육계의 간에서 total RNA를 추출한 다음 mRNA microarray 분석을 실시하였다. 처리에 따른 유전자 발현차이(DEG, differentially expressed gene)를 보면, 대조구 대비 2배 이상 유전자의 발현이 증가한 유전자의 수는 602개 였으며, 발현이 감소한 유전자의 수는 942개로, 처리에 따른 총 DEG는 1,544개로 이는 현재 알려진 닭의 총 전사체(RNA transcripts) 32,773개의 4.7%에 해당된다. DEG의 기준을 1.
- 05)으로 감소되는 것으로 나타났다. 폐사율은 HSD에서 15.4%로서 대조군(3.7%)에 비해 폐사율이 현저히 높은 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 본 실험에서 스트레스 요인으로 처리된 높은 사육밀도가 증체량, 사료섭취량 및 폐사율에 영향을 주었으며, 고밀도 사양에 의해 육계에 스트레스가 유발되었음을 확인하였다.
후속연구
- 마이크로어레이와 real-time PCR에서 제시된 바와 같이 HMGCR과 HSP90은 밀사 스트레스에 민감하게 반응하는 것으로 나타났으며, 본 연구자들에 의해 닭의 스트레스 마커인자로 보고된 바 있다[27]. 본 연구에서 확인한 바와 같이 XBP1과 HSPA5 또한 닭의 ER스트레스의 주요 마커인자로서 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
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