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문제 정의
- 본 연구에서는 국내에서 유일하게 전통방식에 의해 생산되는 금정산성 막걸리의 발효과정에 따른 특성을 조사하였으며 특히, 16S와 28S rRNA 유전자를 이용한 PCR-DGGE분석을 이용하여 전통 막걸리의 발효과정 동안 미생물군집(세균과 진균) 구조와 다양성에 대한 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 28S rRNA gene으로 부터 DGGE-PCR을 위한 primer는 GC-clamp인 GCNL-1 primer (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3')와 LS-2 primer (5'-ATT AAA CAA CTC GAC TC-3')[5] 이었으며 PCR을 위한 조건은 16S rRNA gene 의 경우와 동일하게 수행하였다.
- Genomic DNA의 추출은 권과 손[17]에 기술된 방법에 의해 수행하였다. Genomic DNA를 주형으로 하여 16S rRNA와 28S rRNA gene을 증폭하여 PCR산물을 획득하였다. 세균은 16S rRNA gene 증폭을 위한 universal primer인 27F primer (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1492R primer (5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 이용하여 증폭하였다[18].
- 결정된 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)에 등록되어 있는 database를 사용하여 검색하였으며, 높은 유사성을 가지는 염기서열을 기초로 하여 group별로 정리한 후, PHYDIT (developed by Dr. J. Chun, version 3.2) 운영프로그램을 이용하여 CLUSTAL_X software, version 1.64b[32]에 의한 alignment와 similarity를 통해 sequence data들을 비교하였다.
- 균질화된 막걸리 1 ml를 생리식염수 9 ml에 첨가한 후 연속희석법에 의해 희석한 후 일반세균은 Plate Count Agar (PCA; Difco, USA)배지에 진균은 Potato Dextrose Agar (PDA; Difco, USA)배지에 도말하여 접종하였다. 배양은 25℃에서 수행하였으며 PCA는 3일간 그리고 PDA는 5일간 배양 한 후 성장된 집락(colony)을 계수하였다.
- 금정산성 막걸리로부터 세균과 진균의 genomic DNA 추출을 위해 잘 균질화된 30 ml 막걸리는 원심분리(15,000× g, 4℃, 15 min)한 후 침전물을 회수하여 동결건조하였다.
- 막걸리의 제조는 (유)금정산성토산주에서 제조하는 금정산성 막걸리의 전통제조방식에 의해 조제하였다. 냉각순환 시스템이 설치된 1,000 l 용량의 스테인레스 용기에 증자된 멥쌀, 전통누룩((유)금정산성토산주 자체생산), 물을 첨가하여 혼합시켰다. 이후 25℃로 유지하여 6일간 발효시켰다.
- 금정산성 막걸리로부터 세균과 진균의 genomic DNA 추출을 위해 잘 균질화된 30 ml 막걸리는 원심분리(15,000× g, 4℃, 15 min)한 후 침전물을 회수하여 동결건조하였다. 동결건조된 분말을 막자 사발에 넣어 액체질소를 이용하여 세포파쇄를하였으며 동일과정을 4회 반복하였다. Genomic DNA의 추출은 권과 손[17]에 기술된 방법에 의해 수행하였다.
- 발효기간 동안 총 18개의 구별되는band를 확인할 수 있었다. 또한 각 band로부터 DNA는 회수되어 염기서열을 결정하였으며 NCBI의 BLAST search를 통하여 similarity가 가장 높은 종으로 동정하였다(Fig. 4B). 그 결과 진균의 PCRDGGE profile에서 확인된 종은 Pichia kudriavzevii, Saccharomyces cerevisiae, Asidia idahoensis, Kluyveromyces marxianus, Saccharomycopsis fibuligera 및 Torulaspora delbrueckii 6종이었다(Fig.
- 막걸리의 제조는 (유)금정산성토산주에서 제조하는 금정산성 막걸리의 전통제조방식에 의해 조제하였다. 냉각순환 시스템이 설치된 1,000 l 용량의 스테인레스 용기에 증자된 멥쌀, 전통누룩((유)금정산성토산주 자체생산), 물을 첨가하여 혼합시켰다.
- 증폭을 위한 프로그램은 다음과 같다: 94℃에서 5분 동안 pre-denaturation 한 후, 94℃에서 denaturation 30초, 56℃에서 annealing 15초, 74℃에서 extension 1분 과정을 30 cycle 반복한 후, 74℃에서 5분 동안 post-extension하였다. 반응산물은 1.5% agarose gel 상에서 전기영동을 실시하여 EtBr로 염색하여 확인 한 다음 Gel Purification Kit (Bioneer, Korea)를 사용해 정제하였다.
- 균질화된 막걸리 1 ml를 생리식염수 9 ml에 첨가한 후 연속희석법에 의해 희석한 후 일반세균은 Plate Count Agar (PCA; Difco, USA)배지에 진균은 Potato Dextrose Agar (PDA; Difco, USA)배지에 도말하여 접종하였다. 배양은 25℃에서 수행하였으며 PCA는 3일간 그리고 PDA는 5일간 배양 한 후 성장된 집락(colony)을 계수하였다. 미생물의 분리는 성장된 집락의 모양과 색을 기준으로 동일배지를 이용하여 분리하였으며 순수 분리된 균주는 20% (v/v) glycerol용액에 현탁 한 후 -70℃에서 보존하였다.
- 세균은 16S rRNA gene 증폭을 위한 universal primer인 27F primer (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1492R primer (5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 이용하여 증폭하였다[18].
- 이후 25℃로 유지하여 6일간 발효시켰다. 시료는 0, 1, 2, 3, 5, 6일째에 발효조를 혼합한 후 2 l의 시료를 채취하여 냉장상태로 실험실에 운반한 후 미생물, 이화학 및 DGGE분석을 수행하였다.
- 1x TE buffer를 넣고 4℃에서 overnight하였다. 용출된 밴드를 주형DNA로 사용하여 16S rRNA gene은 GC338F와 518R primer로, 26S rRNA gene은 GCNL-1, LS-2 primer를 이용하여 DNA를 증폭 하였다. 증폭된 산물은 Gel Purification Kit (Bioneer, Korea)로 정제 한 뒤 (주)코스모진텍에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다.
- 용출된 밴드를 주형DNA로 사용하여 16S rRNA gene은 GC338F와 518R primer로, 26S rRNA gene은 GCNL-1, LS-2 primer를 이용하여 DNA를 증폭 하였다. 증폭된 산물은 Gel Purification Kit (Bioneer, Korea)로 정제 한 뒤 (주)코스모진텍에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다.
- 진균은 28S rRNA gene의 증폭을 위한 D1/D2영역의 eukaryotic universal primer인 LROR primer (5'-ACC CGC TGA ACT TAA GC-3')와 LR5 primer (5'-TCC TGA GGG AAA CTT CG-3')를 이용하여 증폭하였다(http://www.biology.ducke.edu/fungi/mycolab/primers.htm).
이론/모형
- DGGE는 Bio-Rad DcodeTM universal mutation detection system (Bio-Rad, USA)를 이용하였으며 권과 손[17]에 의해 기술된 방법에 의거하여 수행하였다.
- 동결건조된 분말을 막자 사발에 넣어 액체질소를 이용하여 세포파쇄를하였으며 동일과정을 4회 반복하였다. Genomic DNA의 추출은 권과 손[17]에 기술된 방법에 의해 수행하였다. Genomic DNA를 주형으로 하여 16S rRNA와 28S rRNA gene을 증폭하여 PCR산물을 획득하였다.
- 환원당은 Somogyi 변법[12]에 의해 정량하였고 포도당농도로 환산하였다. 에탄올 함량은 발효액 100 ml에 증류수 30 ml을 넣어 증류시켜 증류액 70 ml에 증류수를 첨가하여 100 ml로 정용한 후 주정계(Deakwang Inc., Korea)로 측정하였고 Gay-Lussac 표에 의해 15℃로 보정하여 % (v/v)로 표시하였다.
- 009를 곱하여 시료 중의 산을 lactic acid로 계산하였다. 환원당은 Somogyi 변법[12]에 의해 정량하였고 포도당농도로 환산하였다. 에탄올 함량은 발효액 100 ml에 증류수 30 ml을 넣어 증류시켜 증류액 70 ml에 증류수를 첨가하여 100 ml로 정용한 후 주정계(Deakwang Inc.
성능/효과
- hilgardii을 보고한 바 있다. PCR-DGGE를 이용한 본 연구의 결과와 비교하여 L. plantarum을 제외하고 8종은 처음으로 확인되었다.
- 막걸리의 발효과정 중 배양방법에 의존하여 특정 미생물군집의 변화만을 관찰할 수 있으나 종의 변화는 관찰할 수 없는 단점을 가지고 있다. PCR-DGGE분석은 막걸리의 발효과정 중 band profile과 각 band로부터 종을 신속하게 동정함으로써 미생물의 구조와 종의 변화를 함께 분석할 수 있는 장점을 가지고 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 3, 4). 본 연구에서 PCR-DGGE분석을 통하여 금정산성 막걸리는 전통누룩으로부터 유입된 총 9종의 유산균이 발효에 관여하며 이중 L.
- 3B). 그 결과 발효기간 동안 PCR-DGGE profile에서 확인된 세균은 유산균군인 Lactobacillus 속(L. curvatus, L. kisonensis, L. plantarum, L. sakei 및 L. gasseri)이 5종, Pediococcus 속(P. acidilactici, P. parvulus, P. agglomerans, P. pentosaceus)이 4종 그리고 Enterobacteriaceae과에 속하는 Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis와 Citrobacter freundii을 포함하여 총 12종이 검출되었다. 발효기간 동안 세균의 변화는 발효 2일 전후로 구별되는 차이를 보였다.
- 4B). 그 결과 진균의 PCRDGGE profile에서 확인된 종은 Pichia kudriavzevii, Saccharomyces cerevisiae, Asidia idahoensis, Kluyveromyces marxianus, Saccharomycopsis fibuligera 및 Torulaspora delbrueckii 6종이었다(Fig. 4B). 발효기간 동안 진균의 PCR-DGGE profile에서 구별되는 band 변화는 발효 3일 전후로 구분된다.
- idahoensis 로 판단된다. 그러나 배양방법을 통하여 검출되어 분리된 종을 28S rDNA gene서열을 결정하여 NCBI의 BLAST search를 통하여 동정된 균주는 Rhizopus microspores, R. azygosporus, Lichtheimia corymbifera, Mucor racemosus 그리고 Aspergillu oryzae 등이 확인되어(자료 미제시) 배양초기 전분당화에 기여한 것으로 판단된다.
- 20×1010 CFU/ml을 나타내었다. 기존 보고에서 세균과 효모의 최적성장은 대부분 108 CFU/ml 수준으로 알려져 있으나[9,31], 본 연구의 결과에서 세균과 효모의 수는 기존 보고보다 약 2 order정도 높아 발효속도가 빠른 것으로 판단된다.
- fibuligera (F12)의 band밀도는 약하지만 확인되다. 누룩으로부터 유입된 사상성 진균은 Fig. 1에서와 같이 초기에 개체군이 증가하였으나 3일 이후 급격히 감소하는 경향을 나타내었으며 PCR-DGGE분석의 결과, 사상성 진균의 주된 우점 종은 A. idahoensis 로 판단된다. 그러나 배양방법을 통하여 검출되어 분리된 종을 28S rDNA gene서열을 결정하여 NCBI의 BLAST search를 통하여 동정된 균주는 Rhizopus microspores, R.
- 3A). 따라서 금정산성 막걸리는 L. curvatus와 L. gasseri에 의한 풍부한 유산균에 의해 향과 맛 그리고 식품의 안정성과 보존성 측면에서 타 막걸리와 비하여 그 차별성을 갖는 것으로 사료된다.
- idahoensis 이며 그 외 다양한 진균을 확인하였다. 또한 알코올발효를 주도하는 균은 S. cerevisiae로 나타났다. 특히, 금정산성 막걸리는 기존 주된 막걸리 제조업체에서 사용하는 발효제인 입국방식이 아닌 전통누룩을 이용한 단발효에 의한 국내 유일의 대표적인 전통 막걸리임을 확인할 수 있었다.
- 1에서 총 효모성 진균의 변화에서 주된 종의 변화를 PCR-DGGE분석을 통하여 예측할 수 있다. 반면 0일째부터 출현된 A. idahoensis (F11)는 3일부터 band의 밀도가 급격히 감소되었으며 K. marxianus (F4), T. delbrueckii (F2) 및 S. fibuligera (F12)의 band밀도는 약하지만 확인되다. 누룩으로부터 유입된 사상성 진균은 Fig.
- 3A). 반면 발효 2일째에 주된 우점종은 L. curvatus (B10)와 L. gasseri (B15)로 나타났으며 이후 L. curvatus (B10)는 6일의 막걸리발효 종료까지 주된 우점종을 형성하였다. P.
- pentosaceus (B11), Pantoea agglomerans (B9, B12, B13, B16~B22)는 발효 2일 이후 band의 밀도가 희미하거나 검출되지 않았다. 발효 2일 이후 우점을 형성하지는 않았지만 검출된 균주는 L. kisonensis (B2), P. parvulus (B3), Citrobacter freundii (B4), L. plantarum (B5, B8)로 나타났다.
- idahoensis (F11)로 3종이 검출되었다. 발효 3일 이후 P. kudriavzevii (F16)는 급격히 band 밀도가 감소되었으며 반면 S. cerevisiae (F14)는 band밀도가 급격히 증가하여 주된 우점 종을 형성하였다. 이는 Fig.
- 2, 3). 발효과정 중 당화를 주도하는 주된 우점균은 A. idahoensis 이며 그 외 다양한 진균을 확인하였다. 또한 알코올발효를 주도하는 균은 S.
- 3에 나타내었다. 발효기간 동안 PCR-DGGE profile상에서 총 22개의 밴드가 검출되었으며(Fig. 3A), 각 band의 DNA로부터 염기서열을 결정하여 NCBI의 BLAST search를 통하여 similarity가 가장 높은 종으로 동정하였다(Fig. 3B). 그 결과 발효기간 동안 PCR-DGGE profile에서 확인된 세균은 유산균군인 Lactobacillus 속(L.
- 3, 4). 본 연구에서 PCR-DGGE분석을 통하여 금정산성 막걸리는 전통누룩으로부터 유입된 총 9종의 유산균이 발효에 관여하며 이중 L. curvatus 가 주된 우점 종을 형성한다는 사실을 알 수 있었으며 이들 유산균에 의해 생산된 풍부한 유기산에 의해 총산이 타 막걸리에 비하여 높은 특징을 갖는다는 사실을 확인 할 수 있었다(Fig. 2, 3). 발효과정 중 당화를 주도하는 주된 우점균은 A.
- 상기의 결과로부터 알코올의 생성은 pH 감소, 환원당의 증가로 효모의 성장과 알코올생산을 위한 최적조건이 성립된 후 3일 이후 알코올과 총산도의 증가라는 상관관계가 성립됨을 보여주었다. 또한 이러한 경향은 기존의 보고와 일치한다[9,20].
- 발효기간 동안 세균의 변화는 발효 2일 전후로 구별되는 차이를 보였다. 즉 0~1일째에 band의 밀도를 기준으로 주된 우점종은 P. acidilactici (B7, B14), Pantoea agglomerans (B9), L. gasseri (B15) 및 P. pentosaceus (B11)였다(Fig. 3A). 반면 발효 2일째에 주된 우점종은 L.
- 발효기간 동안 진균의 PCR-DGGE profile에서 구별되는 band 변화는 발효 3일 전후로 구분된다. 즉, 발효 0~2일 사이에 우점진균은 P. kudriavzevii (F16, F15, F17, F13)로 점진적으로 밀도가 증가되었으며 그 외 S. cerevisiae(F1, F14)와 A. idahoensis (F11)로 3종이 검출되었다. 발효 3일 이후 P.
- 01을 유지하였다. 총산도는 0일째에 0.01%에서 지속적으로 상승하여 발효 6일째에 0.76%까지 증가하였다. 환원당은 0일째에 0.
- cerevisiae로 나타났다. 특히, 금정산성 막걸리는 기존 주된 막걸리 제조업체에서 사용하는 발효제인 입국방식이 아닌 전통누룩을 이용한 단발효에 의한 국내 유일의 대표적인 전통 막걸리임을 확인할 수 있었다.
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