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문제 정의
- 본 연구에서는 현미추출물의 항염증, 항당뇨, xanthine oxidase 및 alcohol metabolizing activity 및 현미의 소화율 등 현미추출물의 기능성을 연구함으로써 현미를 이용한 식생활 개선 및 건강증진을 위한 건강식품 개발을 위한 기초자료로 제공하고자 한다.
- 하지만 SOD는 분자량이 비교적 큰 단백질로서 열이나 알칼리에 약하므로 이러한 단점을 보완할 수 있는 저분자물질로 체내에서 역할이 유사한 SOD 유사활성 물질을 찾고자 하는 연구가 진행되고 있다. 이에 본 연구에서는 SOD 유사활성을 가진 새로운 항산화 소재를 찾고자 현미 열수와 에탄올 추출물에 대해 분석하여 Table 3에 나타내었다. 그 결과 모든 용매 추출물에서 농도 의존적으로 활성이 증가하였는데, 10 mg/ml 농도의 현미 열수 추출물은 56.
- 이에, 현미로부터 당 분해를 억제할 수 있는 기능성을 더 증명하고자 본 연구에서 현미 열수와 에탄올 추출물의 α-glucosidase 저해활성을 측정하였다.
제안 방법
- ADH 활성도는 Choi 등[2]과 Racker 의 방법[21]을 변형 하여 수행하였으며, 340 nm에서 형성되는 NADH의 흡광도를 spectrophotometer (Ultrospec 3000 pro UV/Visible, Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd., Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)를 이용하여 측정하였다. 시험관에 alcohol, NAD (Sigma)수용액, 시료 0.
- ALDH의 활성도는 Tottmar등의 방법[24]을 변형하여 NADH생성에 따른 흡광도의 변화를 spectrophotometer (Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd.)를 이용하여 340 nm 에서 측정하였다. 즉, ALDH의 활성도 측정을 위해 증류수, 1 M Tris-HCl buffer (pH 7.
- Amylase를 첨가한 시료 buffer액을 37℃에서 2시간 배양한 후 3-5 dinitrosalicylic acid reagent 4 ml를 첨가하여 5분간 가열한 다음 냉각하여 증류수로 25 ml 정량한 뒤 여과하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, blank는 시료가 없는 buffer액으로 대체하였다. Maltose (JUNSEI, Japan)를 standard로 한 표준곡선을 그린 후 이를 사용하여 시료 50 mg에서 분해되어 나온 maltose의 양(mg)을계산하였다.
- 현미 열수와 에탄올 추출물에 의한 숙취 해소능을 생화학적 으로 분석하기 위해 체내 알콜 대사의 1차 관여 효소인 ADH 의 활성 증진 정도를 측정하였다. 또한 acetaldehyde의 분해에 직접적인 영향을 미치는 효소인 ALDH의 활성에 현미 열수와에탄올 추출물이 미치는 영향을 분석하였다. 숙취의 주 원인물질인 acetaldehyde는 체내에서 흡수된 알코올의 분해 시 생성되는 대사산물인데 단순히 ADH만 활성화 시키면 혈중 알콜 농도는 빠르게 감소시킬 수 있으나 간이나 혈액에 남아있는 acetaldehyde는 계속 축적이 되어 심한 숙취를 일으킬 수있는 가능성이 있다.
- 0으로 조정하여 반응용액을 준비하였다. 반응물용액은 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 520 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염을 구하였다. Blank 시험은 Griess 시약 대신 증류수를 가하여 시료와 동일하게 반응시켰으며 아질산염 소거능은 다음 식에 의해 계산하였다.
- 따라서 산성영역에서 니트로사민의 생성인자인 아질산염을 효과적으로 소거하여 니트로사민의 생성을 억제하는 물질들을 탐색하는 연구가 계속되어왔다. 본 연구에서는 현미 추출물이 아질산염 소거능에 미치는 영향을 농도 1 mg/ml에서 pH별로 분석하였는데 pH는 1.2, 3.0및 6.0으로 같은 농도의 비타민 C와 비교 분석하여 Fig. 1에 나타내었다. 현미 에탄올 추출물이 pH 1.
- 시료의 아질산염 소거능은 Gray와 Dugan의 방법[3]을 변형하여 측정하였다. 아질산염 용액에 시료 용액을 가하고 여기에 0.
- , Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)를 이용하여 측정하였다. 시험관에 alcohol, NAD (Sigma)수용액, 시료 0.1 ml를 첨가하고 0.01 M glycine-NaOH 완충용액(pH 8.8)을 총 부피가 1.8 ml가 되게 첨가한 후 25℃ 항온수조에서 10분간 반응시키고 ADH (10 unit/ml, Sigma)를 가하여 340 nm에서 spectrophotometer (Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd.)를 이용하여 흡광도의 변화를 측정하였다. 대조구는 시료대신 증류수를 사용하였으며, positive control로 사용한 hepos는 약국에서 구입한 것으로, 처방전에 따라 1/2로 희석하여 사용하였다.
- 시료의 아질산염 소거능은 Gray와 Dugan의 방법[3]을 변형하여 측정하였다. 아질산염 용액에 시료 용액을 가하고 여기에 0.1 N HCl (pH 1.2) 및 0.2 M 구연산 완충용액(pH 3.0과 6.0)을 사용하여 반응 용액의 pH를 각각 1.2, 3.0 및 6.0으로 조정하여 반응용액을 준비하였다. 반응물용액은 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 520 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염을 구하였다.
- 이때 생성된 ρnitrophenol (PNP)은 ELISA reader (Molecular Device, VersaMax Microplate Reader, Los Angeles, CA, USA)를 이용 하여 400 nm에서 흡광도를 측정하여 다음의 식으로 저해율을 구하였다.
- )를 이용하여 340 nm 에서 측정하였다. 즉, ALDH의 활성도 측정을 위해 증류수, 1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5), 3 M KCl, 시료, 20 mM NAD (Sigma), 0.33 M 2-mercaptoethanol, 0.1 M acetaldehyde (Sigma)를 혼합한 다음 25℃에서 10분간 반응시키고 ALDH (1 unit/ml, Sigma)를 가하여 340 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 이때 대조구는 시료대신 증류수를 넣은 것으로 하였다.
- 현미 열수와 에탄올 추출물에 의한 숙취 해소능을 생화학적 으로 분석하기 위해 체내 알콜 대사의 1차 관여 효소인 ADH 의 활성 증진 정도를 측정하였다. 또한 acetaldehyde의 분해에 직접적인 영향을 미치는 효소인 ALDH의 활성에 현미 열수와에탄올 추출물이 미치는 영향을 분석하였다.
대상 데이터
- )를 이용하여 흡광도의 변화를 측정하였다. 대조구는 시료대신 증류수를 사용하였으며, positive control로 사용한 hepos는 약국에서 구입한 것으로, 처방전에 따라 1/2로 희석하여 사용하였다. ADH의 활성은 반응 종료시의 최대 흡광도를 대조구의 최대 흡광도에 대한 비율로 나타내었으며 다음과 같은 식으로 계산하였다.
- 본 실험에 사용된 현미는 시중에서 구입하였으며 분말 제조시 열변성(탈습, 전분호화, 단백질 변성 등)을 방지하기 위하여 dry ice를 첨가한 고속 mill-type grinder (IKA-Labortechnik, Type A 10, JANKE & KUNKEL GMBH & Co. KG)로 분쇄한 후 90 메쉬 표준체(Chung Gye Industrial Mfg. Co., Korea)를 통과시켜 -20℃ 냉동고에 보관하며 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻은 결과는 각 시료마다 세 번씩 반복 실험을 통해 실험군당 평균과 표준편차를 계산하여 나타내었다.
이론/모형
- α-Glucosidase 활성억제 효과 측정은 Tibbot 등의 방법[18]에 따라 측정하였다.
- 이때 대조구는 시료대신 증류수를 넣은 것으로 하였다. Positive control은 ADH 활성 측정에서 사용한 것과 동일한 것으로 하였으며, ALDH의 활성은 ADH 활성 계산식에 따라 측정 되었다.
- SOD 유사활성(superoxide dismutase-like activity)은 Marklund와 Marklund의 방법[17]에 따라 활성 산소종을 과산화수소(H2O2)로 전환시키는 반응을 촉매하는 pyrogallol의 생성량을 측정하여 나타내었다. 시료를 농도별로 희석하여 10μl 96 well plate에 첨가한 후, Tris-HCl buffer (50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8.
- Xanthine oxidase 저해활성은 MBT환원법에 따라 다음과 같이 측정하였다. 반응은 50 mM phosphate buffer (pH 7.
- 전분의 소화율은 Xue [27]의 방법에 따라 건조시료 50 mg을 0.2 M phosphate buffer (pH 6.9) 2.0 ml에 녹여 시료 현탁액을 만든 뒤, 여기에 pancreatic amylase (Sigma, 90 units/mg) 20 mg을 0.2 M phosphate buffer (pH 6.9) 50 ml에 녹여 만든 amylase buffer 0.5 ml을 첨가하였다. Amylase를 첨가한 시료 buffer액을 37℃에서 2시간 배양한 후 3-5 dinitrosalicylic acid reagent 4 ml를 첨가하여 5분간 가열한 다음 냉각하여 증류수로 25 ml 정량한 뒤 여과하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, blank는 시료가 없는 buffer액으로 대체하였다.
성능/효과
- 이에 본 연구에서는 SOD 유사활성을 가진 새로운 항산화 소재를 찾고자 현미 열수와 에탄올 추출물에 대해 분석하여 Table 3에 나타내었다. 그 결과 모든 용매 추출물에서 농도 의존적으로 활성이 증가하였는데, 10 mg/ml 농도의 현미 열수 추출물은 56.4%, 같은 농도의 에탄올 추출물은 45.0%의 SOD 유사활성을 나타내었다. 이는 DPPH 라디칼 소거능에 대한 결과와 상반된 것으로 오히려 현미 열수 추출물이 에탄올 추출물보다 높은 활성을 나타내고 있다[7].
- 따라서, 양성대조구인 catechin과 비교하여 현미의 xanthine oxidase 저해활성을 Table 1에 나타내었다. 그 결과, 현미 열수와 에탄올 추출물 0.5 mg/ml과 1 mg/ml의 농도에서 활성이 전혀 나타나지 않았다. 하지만 각 시료는 농도 의존적으로 활성이 증가했는데, 10 mg/ml 농도의 열수 추출물에서는 39.
- 따라서, ADH 및 ALDH 두 효소 모두에 미치는 현미 열수와 에탄올 추출물의 영향에 대해 분석하였으며, 그 결과는 Table 4와 5에 나타내었다. 대조구는 시료대신 증류수를 넣은 것으로 ADH의 활성을 측정한 결과 100%로 나타났으며, positive control은 현재 시판되고 있는 숙취해소제 hepos로써 ADH와 ALDH 활성이 175.3, 156.0%로 나타났다. 이와 비교해 볼 때 현미 열수와 에탄올 추출물은 다소 낮은 활성을 보였으며, 현미 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 활성이 크게 나타났다.
- 0%로 측정되었다. 따라서, 현미 열수와 에탄올 추출물의 숙취해소 효과에 대해서는 그 기대치가 낮을 것으로 판단되지만, 알콜 분해와 숙취에 효과가 있는 것으로 알려진 헛개나무 추출물을 이용하여 분석한 Kim 등[10]의 보고에서 헛개나무 추출물의 ADH 활성이 108-114% 정도로 나타나고 있고, ALDH 활성은 118-124% 정도이므로 현미 에탄올 추출물에서 의미 있는 알콜 분해능을 예측할 수 있다. 특히, ADH 활성 뿐만 아니라 더 높은 ALDH의 활성 증진효능이 있으므로 숙취해소에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
- 본 연구결과에서 positive control인 acarbose 0.5 mg/ml에서는 40.4%의 α-glucosidase 저해효과를 나타냈고, 현미 에탄올 추출물은 같은 농도에서 74.6%의 저해활성을 나타냈다.
- 본 연구결과에서는 현미 에탄올 추출물이 α-glucosidase 활성을 크게 저해하고 있으므로 탄수화물의 소화 과정에서 α-glucosidase에 의한 단당류 생성을 저해하여 식사 후 혈당이 급격히 상승하는 등의 증상을 효과적으로 제어할 수 있음을 간접적으로 알 수 있다.
- 이는 DPPH 라디칼 소거능에 대한 결과와 상반된 것으로 오히려 현미 열수 추출물이 에탄올 추출물보다 높은 활성을 나타내고 있다[7]. 이는 추출용매에 따라 항산화작용에 차이가 나타날 수 있음을 보이고 있는데, SOD 유사활성에 있어서는 현미 열수 추출물이 더 효과적임을 알 수 있었다. 현미 열수 추출물의 SOD 유사 활성 정도는 positive control로 사용한 0.
- 4%로 나타났다. 이상의 결과로 볼 때 현미의 용매별 추출물은 pH 1.2의 낮은 조건에서 높은 아질산염 소거능을 보였는데 이는 인체의 위 내 pH 조건과 유사한 pH 1.2에서 활성이 좋은 것으로 확인되었다. 이는 Kang 등[5]과 Woo 등[25,26]의 보고와 유사한 경향인데, 본 연구 결과와 종합해 볼 때 우수한 아질산염 소거능이 현미에서 예측할 수 있기에 항염증에 대한 다양한기능성 식품소재로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 0%로 나타났다. 이와 비교해 볼 때 현미 열수와 에탄올 추출물은 다소 낮은 활성을 보였으며, 현미 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 활성이 크게 나타났다. 즉, 10 mg/ml 현미 열수와 에탄올 추출물의 ADH 활성이 각각 61.
- 이와 비교해 볼 때 현미 열수와 에탄올 추출물은 다소 낮은 활성을 보였으며, 현미 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 활성이 크게 나타났다. 즉, 10 mg/ml 현미 열수와 에탄올 추출물의 ADH 활성이 각각 61.8, 107.5%로 나타났고, ALDH 활성은 각각 105.7, 123.0%로 측정되었다. 따라서, 현미 열수와 에탄올 추출물의 숙취해소 효과에 대해서는 그 기대치가 낮을 것으로 판단되지만, 알콜 분해와 숙취에 효과가 있는 것으로 알려진 헛개나무 추출물을 이용하여 분석한 Kim 등[10]의 보고에서 헛개나무 추출물의 ADH 활성이 108-114% 정도로 나타나고 있고, ALDH 활성은 118-124% 정도이므로 현미 에탄올 추출물에서 의미 있는 알콜 분해능을 예측할 수 있다.
- 5 mg/ml과 1 mg/ml의 농도에서 활성이 전혀 나타나지 않았다. 하지만 각 시료는 농도 의존적으로 활성이 증가했는데, 10 mg/ml 농도의 열수 추출물에서는 39.0%로 나타났고, 에탄올 추출물은 72.9%로 보여 열수 추출물보다 아주 높게 나타났다. 이는 1 mg/ml의 catechin 보다는 낮지만 우수한 생리활성으로 알려져 있는 녹차, 오룡차, 홍차의 10 mg/ml 농도에서 89.
- 1에 나타내었다. 현미 에탄올 추출물이 pH 1.2에서 94.9%로 비타민 C 93.1%보다 높게 나타났으며, 열수 추출물은 75.4%로 나타났다. 이상의 결과로 볼 때 현미의 용매별 추출물은 pH 1.
후속연구
- 8%)과 비교해 볼때 다소 낮게 보였지만, 백미의 SOD 유사활성 보다는 높게 나타나고 있다[25,26]. 따라서, 백미보다는 현미가 쌀을 이용한 제품 개발에 좋은 재료가 될 것으로 생각된다.
- 9%로 보여 열수 추출물보다 아주 높게 나타났다. 이는 1 mg/ml의 catechin 보다는 낮지만 우수한 생리활성으로 알려져 있는 녹차, 오룡차, 홍차의 10 mg/ml 농도에서 89.2~93.2%, 88.8%, 78.7%의 xanthine oxidase 저해효과를 나타내고 있어[28], 현미 에탄올 추출물로부터 항염증에 대한 기능성이 부여된 우수한 식품 소재를 개발할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 지금까지 현미의 xanthine oxidase 저해활성에 대한 연구는 거의 보고되어 있지 않아 본 연구결과가 의미 있는 것으로 판단된다.
- 2에서 활성이 좋은 것으로 확인되었다. 이는 Kang 등[5]과 Woo 등[25,26]의 보고와 유사한 경향인데, 본 연구 결과와 종합해 볼 때 우수한 아질산염 소거능이 현미에서 예측할 수 있기에 항염증에 대한 다양한기능성 식품소재로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 따라서, 현미 열수와 에탄올 추출물의 숙취해소 효과에 대해서는 그 기대치가 낮을 것으로 판단되지만, 알콜 분해와 숙취에 효과가 있는 것으로 알려진 헛개나무 추출물을 이용하여 분석한 Kim 등[10]의 보고에서 헛개나무 추출물의 ADH 활성이 108-114% 정도로 나타나고 있고, ALDH 활성은 118-124% 정도이므로 현미 에탄올 추출물에서 의미 있는 알콜 분해능을 예측할 수 있다. 특히, ADH 활성 뿐만 아니라 더 높은 ALDH의 활성 증진효능이 있으므로 숙취해소에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
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