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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 자란의 기내조직배양용 배지로 용암해수의 종류와 농도조건을 조사하여 관상가치가 뛰어난 원예작물의 청정액비 생산의 기초자료로 활용가치가 있으며, 더 나아가 용암해수의 유용원소 함유 식, 약용식물 생산의 중요한 기초자료를 제시하고자 본 연구를 수행하였다.
- 본 연구에서는 용암해수가 지닌 독특한 미네랄 구성을 바탕으로 자란의 생육에 적합한 농도를 규명하기 위해 실험을 수행하였다. 자란의 기내배양용 고체배지구성을 위해 30 g/L sucrose와 3.
가설 설정
- A-B: Comparative growth of ED concentration, scale bar, 5 cm. C: Comparative corm growth of ED concentration, Arrows are new corms, scale bar, 1 cm.
- A-B: Growth of RO medium, scale bar, 5 cm. C: Growth of new corm, Arrow is shoot primordia, scale bar, 1.5 mm.
제안 방법
- 검체의 무기이온 함량은 ICP(Inductively Coupled Plasma), (VARIAN, 710-ES, USA) 및 ICP-MS(Inductively Coupled Plasma-mass spectrometer), (PerkinElmer, ELAN DRC II, USA)로 분석하였다. ICP로는 Na, Mg, Ca, K, Fe, Zn, Mn, Si, B, Sr, Cr, Al의 12가지 원소에 대해 분석하였고, ICP-MS로는 V, Co, Cu, Ge, As, Se, Mo, Cd, Pb의 9가지 원소에 대해 분석하였다. 표준물질로는 multi standard를 사용하여 Matrix가 복잡한 시료 분석시 Matrix 요인을 제거한 후 분석하는 표준물첨가법(standard addition)으로 분석하였다.
- 각각의 용암해수 배지에서 12주간 생장한 자란의 잎을 1 × 1 cm로 절단하여 80%의 아세톤 2 mL에 넣고, 24시간 암반응 하였다.
- 각 시료의 중량을 30 mg로 정량하여 용기에 취하고 질산 5 mL를 첨가하여 Microwave 3000(Anton Paar GmbH, Austria)를 이용하여 용액화 시킨 후 증류수로 희석하여 동일하게 여과한 시험액(20 mL)을 제조하였다. 검체의 무기이온 함량은 ICP(Inductively Coupled Plasma), (VARIAN, 710-ES, USA) 및 ICP-MS(Inductively Coupled Plasma-mass spectrometer), (PerkinElmer, ELAN DRC II, USA)로 분석하였다. ICP로는 Na, Mg, Ca, K, Fe, Zn, Mn, Si, B, Sr, Cr, Al의 12가지 원소에 대해 분석하였고, ICP-MS로는 V, Co, Cu, Ge, As, Se, Mo, Cd, Pb의 9가지 원소에 대해 분석하였다.
- 7로 조절한 다음 고온, 고압 멸균하여 배지를 제조하였다. 배지경도의 측정은 경도계(SUN rheometer, compac-100 II, Daego, Korea)를 이용하여 직경 10 mm 탐침봉으로 1.5 mm 깊이로 100 mm/sec의 속도로 하중 압력은 10 kg으로 설정하여 측정하였다.
- 용암해수 농도에 따른 자란의 생리적 발육상태를 확인하기 위하여 엽록소의 함량을 측정하였다. 각각의 용암해수 배지에서 12주간 생장한 자란의 잎을 1 × 1 cm로 절단하여 80%의 아세톤 2 mL에 넣고, 24시간 암반응 하였다.
- 용암해수가 기내 고체배지로서 적절한지 알아보기 위해서 용암해수 원수를 역삼투압법을 통해 탈염된 RO(Reverse Osmosis)탈염수와 전기투석법으로 탈염된 ED(Electrodialsis) 탈염수를 각각 10, 50, 100배 희석하여 30 g/L의 sucrose와 3.0 g/L의 gelrite 또는 8.0 g/L의 plant agar를 첨가하여 pH는 5.7로 조절한 다음 고온, 고압 멸균하여 배지를 제조하였다. 배지경도의 측정은 경도계(SUN rheometer, compac-100 II, Daego, Korea)를 이용하여 직경 10 mm 탐침봉으로 1.
- 용암해수내 미량원소의 식물체내로의 이송을 확인하기 위해 각각의 용암해수배지에서 기내배양 한 자란의 지상부만을 절단하여 80℃ 건조기에서 48시간 동안 건조한 후 검체의 무게를 측정하였다.
- 용암해수농도에 따른 자란의 생장을 알아보기 위해서 0, 50, 100% 배 희석한 RO 탈염수와 0, 1, 5, 10, 20, 50, 75, 100%의 ED 탈염수에 30 g/L의 sucrose와 8.0 g/L의 plant agar를 첨가하여 pH는 5.7로 조정한 다음 배지를 제조하였다. 제조된 배지에 초장이 1∼3 cm, 근장이 0.
- 제조된 배지에 초장이 1∼3 cm, 근장이 0.5∼1 cm로 생장한 자란의 유식물체를 치상하여 6개월간 배양한 다음 shoot 길이, shoot 직경, root 길이, root 직경, shoot와 root의 비율을 측정하였다.
- 그 후에 각 샘플들을 15,000 rpm의 속도에서 1분간 원심분리 하였다. 층이 분리되면 상등액을 분리하여 spectrophotometer를 사용하여 663.2 nm와 646.8 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 값을 다음의 식에 대입하여 chlorophyll의 함량을 구하였다(Lichtenthaler, 1987).
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 자란(Bletilla striata)은 2009년 8월 서귀포시 남원읍 한남지역에서 꼬투리를 6립 채집하였다. 채집된 꼬투리는 1개월간 4℃ 냉장고에서 저온 처리하여 무균적으로 종자를 꺼내 오키드 전용배지인 OM(Orchid Max medium, Duchefa, Netheland) 배지가 첨가된 사각배양병에서 4개월간 증식시켜 초장이 3 ~ 5 cm로 동일하게 생장한 유식물체를 선별하여 실험에 사용하였다.
- 자란의 기내배양은 온도 22 ± 1℃, 광주기 16/8시간, 광도 46 μmol m-2s-1의 배양실에서 실시하였다. 실험에 사용된 MS배지 및 용암해수(원수, RO, ED)배지에 포함된 미네랄 조성은 Table 1과 같다.
- 0 g/L의 agar를 첨가하여 배지와 실험구로 사용한 용암해수 원수는 용암해수사업단에서 분양받아 사용하였다. 용암해수배지는 30 g/L의 sucrose와 8.0 g/L의 agar를 첨가하여 제조하였다. 자란의 기내배양은 온도 22 ± 1℃, 광주기 16/8시간, 광도 46 μmol m-2s-1의 배양실에서 실시하였다.
- 채집된 꼬투리는 1개월간 4℃ 냉장고에서 저온 처리하여 무균적으로 종자를 꺼내 오키드 전용배지인 OM(Orchid Max medium, Duchefa, Netheland) 배지가 첨가된 사각배양병에서 4개월간 증식시켜 초장이 3 ~ 5 cm로 동일하게 생장한 유식물체를 선별하여 실험에 사용하였다. 자란의 생육배지로는 대조구로 MS(Murashige and Skoog 1962) 배지에 30 g/L의 sucrose와 8.0 g/L의 agar를 첨가하여 배지와 실험구로 사용한 용암해수 원수는 용암해수사업단에서 분양받아 사용하였다. 용암해수배지는 30 g/L의 sucrose와 8.
- 채집된 꼬투리는 1개월간 4℃ 냉장고에서 저온 처리하여 무균적으로 종자를 꺼내 오키드 전용배지인 OM(Orchid Max medium, Duchefa, Netheland) 배지가 첨가된 사각배양병에서 4개월간 증식시켜 초장이 3 ~ 5 cm로 동일하게 생장한 유식물체를 선별하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 변인들의 집단간 차이를 알아보기 위해서 ANOVA를 실시하였고, 유의성이 있는 경우 Duncan’s multiple range test로 사후검증을 하였다.
이론/모형
- ICP로는 Na, Mg, Ca, K, Fe, Zn, Mn, Si, B, Sr, Cr, Al의 12가지 원소에 대해 분석하였고, ICP-MS로는 V, Co, Cu, Ge, As, Se, Mo, Cd, Pb의 9가지 원소에 대해 분석하였다. 표준물질로는 multi standard를 사용하여 Matrix가 복잡한 시료 분석시 Matrix 요인을 제거한 후 분석하는 표준물첨가법(standard addition)으로 분석하였다. 사용기기의 조건은 Table 2와 같다.
성능/효과
- Table 3에서 나타냈듯이 마그네슘의 경우 대조구로 사용된 MS배지에 황화합물(MgSO4)의 상태로 공급이 되기 때문에 검출이 된 것으로 보여지고 스트론튬이나 바나듐, 셀레늄의 경우 MS 배지에는 함유되어 있지 않기 때문에 불검출이 되는 것으로 보여 진다. ED 탈염수 100%가 첨가된 배양배지에서 생육한 자란은 생육이 현저하게 억제가 되는 경향을 보였지만 엽록소의 함량은 높았다. 마그네슘은 식물체의 생육에 필수요소 중에 하나로 결핍 시 잎이 누렇게 변하는 황화현상을 유발하는 것으로 알려져 있다.
- 또한 ED 탈염수의 농도를 각각 0, 1, 5, 10, 20, 50, 75, 100%까지 달리하여 생육상태를 확인한 결과는 Table 4와 같다. ED 탈염수를 이용하여 배지를 제조한 모든 배지에서 50% 이상의 생존률을 확인할 수 있었고, 특히 ED 탈염수 0 ~ 50%까지 첨가된 처리구에서 90% 이상의 높은 생존률을 보였다. Shoot와 root의 길이는 ED 탈염수 5%와 10% 첨가 배지에서 가장 높은 결과를 보였으며, shoot와 root 직경은 ED 탈염수 10% 배지에서 가장 높은 결과를 보였다.
- 용암해수의 종류와 농도에 따른 총엽록소의 함량은 종류와 농도에 관계없이 대조구보다 높은 측정값을 나타났다. RO 탈염수와 ED 탈염수의 농도가 높아질수록 총엽록소 함량(TTC contents)이 감소하는 결과를 보였는데 이는 고농도의 염스트레스가 작용했다고 보여진다. 용암해수를 이용한 작물 및 원예식물의 재배시 식물체내 엽록소의 함량에 관한 연구는 중요한 식물 생리적 의의를 지닌다.
- ED 탈염수를 이용하여 배지를 제조한 모든 배지에서 50% 이상의 생존률을 확인할 수 있었고, 특히 ED 탈염수 0 ~ 50%까지 첨가된 처리구에서 90% 이상의 높은 생존률을 보였다. Shoot와 root의 길이는 ED 탈염수 5%와 10% 첨가 배지에서 가장 높은 결과를 보였으며, shoot와 root 직경은 ED 탈염수 10% 배지에서 가장 높은 결과를 보였다. 배양 후 6개월 정도가 지나면 기내 배양환경이 변하게 된다.
- 52 mg/L로 급격하게 증가함을 확인하였다. 또한, 용암해수만이 지니는 바나듐과 셀레늄(Se)과 바나듐(V)의 경우 대조구에서는 검출되지 않았고, RO 탈염수 50과 ED 탈염수 50%를 첨가한 배지보다 RO 탈염수 100, ED 탈염수 100%를 첨가한 배지에서 유의적으로 높은 함량을 보였다. 마그네슘, 스트론튬, 바나듐, 셀레늄외 나머지 원소(Na, Ca, K, Fe, Zn, Mn, Si, B, Cr, Al, Co, Cu, Ge, As, Mo, Cd, Pb)는 ICP 또는 ICP-MS로 검출은 되었지만 용암해수 자체의 중요 미네랄과 연관관계가 많지 않으므로 결과로 제시하지 않았다.
- Chretien(2000)은 해수의 ED 탈염수를 이용하여 토마토를 수경 재배 하였을 경우 양분공급방법 및 NaCl로 EC를 증가시킨 처리구들 사이에 차이가 없었다고 하였다. 본 실험에서도 ED 탈염수 100%를 제외하고는 모든 처리구에서 양호한 생장을 보였다(Fig. 2A). 이는 극단적인 고농도의 처리를 하지 않는 한 용암해수를 이용한 식물생장용 배양배지의 산업적 이용은 문제가 없을 것으로 보여진다.
- 이는 난의 경우 대량으로 생산하기 때문에 생산비당 원료절감을 위해 부득이하게 plant agar를 사용한다. 본 실험에서도 gelrite 보다는 agar를 첨가하였을 때 용암해수 고체배지를 좀 더 수월하게 생산할 수 있었다.
- 마그네슘(Mg)의 경우 대조구에 비해 RO 탈염수 50과 100%는 2배, ED 탈염수 50은 7배, ED 탈염수 100% 처리구는 8배의 높은 함량을 나타냈다. 스트론튬(Sr)은 대조구에서 검출되지 않았으며, RO 탈염수 50, 100%의 경우 0.05, 0.06 mg/L정도의 미미한 함량을 보였지만 ED 탈염수 50, 100%의 경우 0.42, 0.52 mg/L로 급격하게 증가함을 확인하였다. 또한, 용암해수만이 지니는 바나듐과 셀레늄(Se)과 바나듐(V)의 경우 대조구에서는 검출되지 않았고, RO 탈염수 50과 ED 탈염수 50%를 첨가한 배지보다 RO 탈염수 100, ED 탈염수 100%를 첨가한 배지에서 유의적으로 높은 함량을 보였다.
- ED배지는 ED 100%를 제외한 배지에서 모두 양호한 생장을 보였다. 엽록소 함량 분석을 통한 생리적 건전도를 측정한 결과, 대조구에서는 총엽록소 함량이 66.3 ug/ml인데 비해 RO 10%, RO 50%, RO 100%, ED 10%, ED 50%, ED 100%에서는 각각 77.3, 69.3, 76.4, 79.0, 75.7, 74.4 ug/ml로 모두 대조구보다 높은 총엽록소 함량을 나타냈다. 또한 용암해수 내 유용성분의 식물체내로의 축적은 스토론튬, 바나듐, 셀레늄 등이 원활하게 이루어짐을 확인한 바, 용암해수를 이용한 식물조직배양용 배지로의 산업적 이용가치가 높을 것으로 보이고 더 나아가 용암해수가 원예작물뿐만 아니라 유용성분 함유 약용작물의 생산에도 충분히 활용 가능할 것으로 사료된다.
- 용암해수의 농도에 따라서 배지의 굳기(경도)를 알아보기 위해서 MS배지를 기본으로 RO 탈염수 10, 50, 100%와 ED 탈염수 10, 50, 100%의 배지를 제조하여 경도를 측정한 결과, MS 배지는 2종의 교질재료(Agar와 gelrite)가 첨가된 배지의 경도가 모두 30,000 g/cm2 이상 60,000 g/cm2 이하로 측정이 되었다. 그러나 교질재료 중 gelrite의 경우 RO, ED 탈염수의 모든 농도에서 3,000 g/cm2 이하의 경도를 나타내었는데 이는 배지의 상태가 고체, 액체의 중간상태인 슬러그 상태를 나타내는 경도 값이었다.
- 용암해수의 종류(RO, ED 탈염수) 및 농도(10, 50, 100%)에 따라서 자란 내 엽록소 함량을 비교하기 위해 종류와 농도를 달리하여 배지를 제조한 후 6개월간 생장한 잎절편에서 엽록소 함량을 측정한 결과는 Table 5와 같다. 용암해수의 종류와 농도에 따른 총엽록소의 함량은 종류와 농도에 관계없이 대조구보다 높은 측정값을 나타났다. RO 탈염수와 ED 탈염수의 농도가 높아질수록 총엽록소 함량(TTC contents)이 감소하는 결과를 보였는데 이는 고농도의 염스트레스가 작용했다고 보여진다.
- 본 연구에서는 용암해수가 지닌 독특한 미네랄 구성을 바탕으로 자란의 생육에 적합한 농도를 규명하기 위해 실험을 수행하였다. 자란의 기내배양용 고체배지구성을 위해 30 g/L sucrose와 3.0과 8.0 g/L의 gelrite 및 plant agar를 동일하게 처리한 MS 배지와 RO(Reverse Osmosis) 탈염수, ED(Electrodialsis) 탈염수 배지를 각각 제조하여 배지경도를 측정한 결과, plant agar가 첨가된 MS, RO, 및 ED 배지의 경도는 각각 60,000, 40,000 및 38,000 g/cm2의 경도가 측정되었다. 하지만 gelrite가 첨가된 배지는 MS를 제외한 RO, ED배지는 2,000 g/cm2 내외의 경도를 보였다.
- 하지만 gelrite가 첨가된 배지는 MS를 제외한 RO, ED배지는 2,000 g/cm2 내외의 경도를 보였다. 제조된 배지에서 식물체의 생육을 확인한 결과, RO 탈염수 0%에서는 88%, RO 50%에서는 57%, RO 100%에서는 31%의 생존율을 보였다. 하지만 잎 길이, 엽폭은 모두 RO 탈염수 100%에서 높았다.
- RO 탈염수의 농도를 각각 0, 50, 100%까지 달리하여 6개월간 자란의 유식물체를 배양하여 생육상태를 확인한 결과는 Table 3과 같다. 평균 생존률은 RO 탈염수 0% 배지에서 88%로 가장 높았지만 shoot와 root 길이는 RO 탈염수 50%가 첨가된 배지에서 평균 신장 길이가 12.3과 6.5 cm로 가장 높았다. Shoot 직경과 root 직경은 모든 처리구에서 오차범위에서 비슷한 생장을 보였다(Table 3).
- Nelson(2003)은 주요 화훼작물의 생리장해의 특징 및 Mg 함량을 보고하였고, Winsor와 Adams(1987)는 생리장애가 발생하는 오이의 식물체를 분석하여 적정 Mg의 영역을 보고하였다. 하지만 본 실험에서는 자란의 생육에 적합한 Mg의 적정농도는 알지 못했지만 Mg이 고농도로 축적된 ED 탈염수 100%에서 생육한 자란의 생장상태와 엽록소 함량에 따른 생육상태는 확인 할 수 있었다. 스트론튬, 바나듐 및 셀레늄의 경우 용암해수 특이적인 미네랄로서 스트론튬, 바나듐의 경우 아직 식물의 생육에 미치는 영향에 관한 연구논문이 보고된 적은 없다.
후속연구
- 4 ug/ml로 모두 대조구보다 높은 총엽록소 함량을 나타냈다. 또한 용암해수 내 유용성분의 식물체내로의 축적은 스토론튬, 바나듐, 셀레늄 등이 원활하게 이루어짐을 확인한 바, 용암해수를 이용한 식물조직배양용 배지로의 산업적 이용가치가 높을 것으로 보이고 더 나아가 용암해수가 원예작물뿐만 아니라 유용성분 함유 약용작물의 생산에도 충분히 활용 가능할 것으로 사료된다.
- Lee(2005) 등은 토마토의 수경재배 시 셀레늄의 관주와 엽면시비를 복합적으로 병행한 경우 생육, 과실의 크기, 엽록소의 함량 등이 증가한다고 보고했으며, Cheong(2009) 등은 4가지 채소종자에 셀레늄의 처리농도가 증가할수록 발아와 싹의 생장에 효과적인 것을 보고하였다. 본 실험에서도 용암해수가 첨가된 모든 처리구에서 셀레늄이 검출이 되었는데 이는 셀레늄만이 아닌 용암해수가 지니는 유용 미네랄을 흡수, 축적할 수 있다는 가능성이 있음을 보여주는 것이고 기능성 향상 채소재배에 유용한 기초자료로 활용될 것으로 생각된다.
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