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문제 정의
- 본 연구는 버섯을 생산하는 농가에서 균일한 액체종균의 제조 생산에 수치화된 지표를 설정하여 비용이 저렴하고 시간 절약적인 방법인 균사의 호흡 반응량의 간이 측정으로 폭기 진행 중에 이산화탄소 농도 측정이 유용한지를 평가하였다.
- 본 연구에서는 효율적으로 팽나무버섯 액체종균을 생산할 때에 폭기(공기방울을 매우 작게하여) 배양의 효과에 대하여 액체 배지 내 이산화탄소 농도와 잔류 유리당 함량 변화로써 측정하였다. 이산화탄소 농도는 폭기 진행 중 배양 용기의 배출구에서 측정하였다.
제안 방법
- 팽나무버섯 시료를 분쇄한 후 20g을 칭량하여 80% 에탄올 100㎖를 넣은 후 85℃ 수욕조에서 30분간 초음파 추출을 실시하였다. 그 후 80% 에탄올 100㎖을 가하여 0.45㎛ membrane filter로 여과한 후 fructose, glucose, maltose, sucrose, lactose를 HPLC로 분석하였다.
- 매일매일 1ℓ용량을 분획한 후 부유된 균사를 침전하기 위하여 1시간 동안 방치시켜 부유된 균사를 침전시켜서 폭기 중의 증가되는 균사량(㎖/ℓ)을 확인하였다. 폭기가 진행되는 상태에서 상당량을 분획한 후 곧바로 1ℓ의 메스실린더로 정용하고 1시간 후에 사진 기록으로 정리하였으며, 이때 균사가 부유된 량을 상대적으로 평가하였으며, 이후 또 다른 분석을 위하여 균사의 생리활성을 정지시키고자 곧바로 냉동하였고, 이를 해빙한 후 원심분리하여 상증액과 침전균사로 분리하여 분석에 사용하였다.
- 배양실 온도는 20~22℃, 폭기 압력 2.0kg.f/㎠의 공기압, 직경 50㎜×0.2㎛의 필터(Pall Co.)를 3개 직렬로 배열하여 공기를 여과하면서 폭기 배양을 실시하였다.
- 삼각프라스크 배양은 1ℓ에 설탕 30g, 탈지대두박 3g, 펩톤 2g, MgSO4·7H2O 0.8g, KH2PO4·12H2O 0.8g, peptone 0.8g, 목초액(상품명;유기칼) 농도 1/1,500배액, antiform 204(Sigma, A-6426)를 2~3방울 첨가하여 면전하고 autoclave로 고압살균을 실시하고 살균 시간 60~80분간 유지한 후 방랭하였고 접종원은 petri dish에서 8~9개 조각을 접종하였다.
- 폭기가 진행되는 과정에서 매일 접종할 때의 배지는 동일한 조건으로 입병을 진행되게 하고 동일한 액통으로 각각의 폭기 일(4일째~8일째, 그리고 16일째)에 접종하였으며 배지의 균사 배양 일수는 27일로 동일하게 연차적으로 진행하였다. 수량은 4바구니(64병)씩을 이용하였으며, 접종 후 다음날인 1일째에 배지병에 오염방지를 위하여 크린 벤치 내에서 뚜껑을 열어 활착상태를 상대적으로 평가하고 재배과정 중의 오염빈도를 검토하였으며, 수확은 접종 후 63일째에 일괄 수확하였으며 수확량(g)을 백분율(%)로 비교 검토하였다.
- 혼합액이 들어있는 시험관을 90℃ shaking water bath(110rpm)에서 1시간 반응시켰다. 시험관을 실온에서 10분간 방치 한 후 95% ethanol 4㎖, ehrlich reagent 0.5㎖와 증류수 3㎖를 첨가하여 530㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 통상 폭기 배양 4일째 이후부터는 오염검사가 가능하며 진한 giemsa sol.에 의한 현미경검경에서 대물렌즈 100X에서 유침하여 슬라이드를 확인하여 세균류(원균, 간균)를 동정하여 오염이 없는 상태에서 액체종균을 사용하였다.
- 본 연구에서는 효율적으로 팽나무버섯 액체종균을 생산할 때에 폭기(공기방울을 매우 작게하여) 배양의 효과에 대하여 액체 배지 내 이산화탄소 농도와 잔류 유리당 함량 변화로써 측정하였다. 이산화탄소 농도는 폭기 진행 중 배양 용기의 배출구에서 측정하였다. 액체종균은 폭기 배양 3일 째에 균사생장이 급격히 증가하였으며, 이산화탄소 농도 (CO2)도 급증하였으나 폭기 5일째에는 정점을 나타낸 후 감소하였다.
- 액통의 구조는 밑면*높이의 비율이 1:3 정도의 비율이며, 폭기 구조는 내경 지름 13~15㎜에 내경 1㎜의 가 느다란 관을 10개로 분지시킨(10구로 토출되는 폭기구)를 사용하였다. 이와 같은 폭기 구조는 최종 분지된 구멍이 작고 폭기 압력을 높여서 공기 압력을 분산하였으며 액체종균의 균사와 공기(산소)와의 접종 비율이 높아지도록 하고 액의 순환 비율을 높이도록 하였다. 폭기 진행 중의 배출구에서 상대적인 이산화탄소농도의 측정은 IAQ-CALC(TSI Co.
- 접종 후 배양병의 활착 상태를 위주로 평가할 수 밖에 없는 상황이므로 접종 후 다음날인 1일째에 크린벤치 내에서 뚜껑을 열어 접종균을 육안으로 확인하였다. Table 1에서와 같이 각각의 입자는 표면 접종위치에서 습윤상태에서 벗어나 흰색의 균사 활착상태 상대적으로 확인하였다.
- 시험에 사용된 품종은 팽나무버섯(일명 고사 품종) 균주를 사용하였다. 종균계대에서 petri dish에 PDA(potato dextrose agar) 42g/1ℓ의 비율로 조제하여 고압 살균 후에 사면이나 평면 배지를 만들었다. 삼각프라스크 배양은 1ℓ에 설탕 30g, 탈지대두박 3g, 펩톤 2g, MgSO4·7H2O 0.
- H2SO4 2~3방울을 가하여 증류하였다. 증류한 0.5NH2SO4로 적정하여 총질소 함량을 계산하였다.
- 폭기가 진행되는 기간 동안에 분석을 진행하기 위하여 매일 1리터 용량을 분획하여 생리기작을 정지시키기 위하여 이를 -10℃에 냉동하였고 이를 해빙하여 원심분리하여 상증액과 침전 균사체를 분리하여 실험에 사용하였다. 침전균사는 습윤 상태로 균사 생성량을 비교하였다.
- 폭기가 진행되는 상태에서 상당량을 분획한 후 곧바로 1ℓ의 메스실린더로 정용하고 1시간 후에 사진 기록으로 정리하였으며, 이때 균사가 부유된 량을 상대적으로 평가하였으며, 이후 또 다른 분석을 위하여 균사의 생리활성을 정지시키고자 곧바로 냉동하였고, 이를 해빙한 후 원심분리하여 상증액과 침전균사로 분리하여 분석에 사용하였다. 침전된 균사량은 분석을 위하여 습윤 균사 중량(g/ℓ)으로 측정하였다.
- 환원당은 Lunchsinger와 Cormesky가 제시한 SomogyiNelson(1944) 시험방법을 준용하여 정량하였다. 팽나무버섯 액체종균을 원심분리(3,000rpm, 10min)하여 상층액 10g에 증류수 40㎖를 가하여 50㎖로 정용하였다. 시료액 1㎖에 혼합시약(A:B=25:1, A=H2O 1L in anhydrous NaHPO4 25g, C4H4O6KNa·4H2O 25g, NaHCO3 20g, anhydrose Na2SO4 200g, B: H2O 200㎖ in CuSO4·5H2O 30g, comcentrate H2SO4 4 drop)을 0.
- 폭기가 진행되는 과정에서 매일 접종할 때의 배지는 동일한 조건으로 입병을 진행되게 하고 동일한 액통으로 각각의 폭기 일(4일째~8일째, 그리고 16일째)에 접종하였으며 배지의 균사 배양 일수는 27일로 동일하게 연차적으로 진행하였다. 수량은 4바구니(64병)씩을 이용하였으며, 접종 후 다음날인 1일째에 배지병에 오염방지를 위하여 크린 벤치 내에서 뚜껑을 열어 활착상태를 상대적으로 평가하고 재배과정 중의 오염빈도를 검토하였으며, 수확은 접종 후 63일째에 일괄 수확하였으며 수확량(g)을 백분율(%)로 비교 검토하였다.
- 매일매일 1ℓ용량을 분획한 후 부유된 균사를 침전하기 위하여 1시간 동안 방치시켜 부유된 균사를 침전시켜서 폭기 중의 증가되는 균사량(㎖/ℓ)을 확인하였다. 폭기가 진행되는 상태에서 상당량을 분획한 후 곧바로 1ℓ의 메스실린더로 정용하고 1시간 후에 사진 기록으로 정리하였으며, 이때 균사가 부유된 량을 상대적으로 평가하였으며, 이후 또 다른 분석을 위하여 균사의 생리활성을 정지시키고자 곧바로 냉동하였고, 이를 해빙한 후 원심분리하여 상증액과 침전균사로 분리하여 분석에 사용하였다. 침전된 균사량은 분석을 위하여 습윤 균사 중량(g/ℓ)으로 측정하였다.
- 5㎖ 첨가하여 20분간 가열, 냉각 후 C액(total 500㎖ store at 37℃/day (NH4)6Mo7O24·4H2O 25g in d3H2O 450㎖ including, concentratrate H2SO4 21㎖ + Na2HSO4·7H2O 3g in d3H2O 25㎖)를 1㎖ 첨가, 실온에 반응 후 H2O 5㎖를 혼합하여 520㎚에서 흡광도를 측정하였다. 환원당 함량은 glucose로 검량선을 작성하여 시료의 환원당 함량을 산출하였다.
대상 데이터
- 시험에 사용된 품종은 팽나무버섯(일명 고사 품종) 균주를 사용하였다. 종균계대에서 petri dish에 PDA(potato dextrose agar) 42g/1ℓ의 비율로 조제하여 고압 살균 후에 사면이나 평면 배지를 만들었다.
- )를 3개 직렬로 배열하여 공기를 여과하면서 폭기 배양을 실시하였다. 액통의 구조는 밑면*높이의 비율이 1:3 정도의 비율이며, 폭기 구조는 내경 지름 13~15㎜에 내경 1㎜의 가 느다란 관을 10개로 분지시킨(10구로 토출되는 폭기구)를 사용하였다. 이와 같은 폭기 구조는 최종 분지된 구멍이 작고 폭기 압력을 높여서 공기 압력을 분산하였으며 액체종균의 균사와 공기(산소)와의 접종 비율이 높아지도록 하고 액의 순환 비율을 높이도록 하였다.
이론/모형
- chitin 분석은 현(2006)의 시험방법을 준용하였다. 동결된 시료 0.
- 유리당은 Im (1998), 정 (2004)의 시험방법을 준용하여 분석하였다. 팽나무버섯 시료를 분쇄한 후 20g을 칭량하여 80% 에탄올 100㎖를 넣은 후 85℃ 수욕조에서 30분간 초음파 추출을 실시하였다.
- 총질소는 경기도 농업기술원 토양 및 퇴비 분석법(2008)의 시험방법을 준용하여 Kjeldahl 증류법으로 분석하였다. 팽나무버섯 균사체 0.
- 이와 같은 폭기 구조는 최종 분지된 구멍이 작고 폭기 압력을 높여서 공기 압력을 분산하였으며 액체종균의 균사와 공기(산소)와의 접종 비율이 높아지도록 하고 액의 순환 비율을 높이도록 하였다. 폭기 진행 중의 배출구에서 상대적인 이산화탄소농도의 측정은 IAQ-CALC(TSI Co.)를 이용하였다.
- 환원당은 Lunchsinger와 Cormesky가 제시한 SomogyiNelson(1944) 시험방법을 준용하여 정량하였다. 팽나무버섯 액체종균을 원심분리(3,000rpm, 10min)하여 상층액 10g에 증류수 40㎖를 가하여 50㎖로 정용하였다.
성능/효과
- 7에서와 같이 폭기 7일째까지 지속적으로 감소하였지만 이후에는 생성된 균사량이 많아지면서 후기에는 약간 증가하였다. 5종의 당류에서 fructose와 glucose의 량이 총량에 더 많은 영향을 주었다. 여러 가지 분석에서 얻은 결과는 서로가 완전히 일치하는 패턴을 없었으나 환원 당 변화량과 균사활착의 결과로 볼 때 폭기 배양 6~7일 정도에 접종하는 것이 가장 좋은 것으로 평가되었다.
- Fig. 2와 같이 액체종균의 폭기 배양 중 상대적인 균사량을 확인 한 바에 의하면 폭기 배양 3일째에 급격한 균사량이 증가되었지만 입자는 비교적 작고 균일하게 분산되어 있었고 현미경 검경에 의하여 확인한 바 첨가된 대두박의 덩어리가 존재하였고 상증액은 뿌옇게 남아 있었다. 폭기량이 적다든지, 대두박 량이 너무 많아서 접종시에 남아있는 경우에는 병에서의 오염 원인이 되기도 하므로 대두박의 잔량이 없어지는 때까지 폭기 배양하여 접종하도록 하는 것이 좋다.
- 5종의 당류에서 fructose와 glucose의 량이 총량에 더 많은 영향을 주었다. 여러 가지 분석에서 얻은 결과는 서로가 완전히 일치하는 패턴을 없었으나 환원 당 변화량과 균사활착의 결과로 볼 때 폭기 배양 6~7일 정도에 접종하는 것이 가장 좋은 것으로 평가되었다. 하지만 농가에서 균일성을 위한 수치화된 지표를 설정하기 위하여 균사의 호흡 반응량의 간이 측정으로는 비용이 저렴하고 시간 절약적인 방법으로 상대적인 이산화탄소 농도를 측정하는 것도 유용할 것으로 판단되었다.
- 총질소(T-N)량은 폭기 11일째까지 일정한 수준으로 감소되었다. 유리당의 함량은 폭기 배양 7일째에 가장 낮았으므로 폭기 배양 6~7일째에 접종원으로 사용하는 것이 가장 효과적인 것으로 생각되었다. 그리고 액체종균의 배양 중에 배출구에서의 이산화탄소 농도 측정은 저비용으로 액체종균의 균사배양 정도를 추정하는 간이 지표로 이용할 수 있을 것으로 판단되었다.
- 에서와 같이 팽나무버섯 액체종균의 폭기 배양 중에 일변 분획된 chitin 분석에 의하면 왕성한 균사의 증식대수기(4일째)와 폭기 9일째에 높게 나왔다. 이는 영양분이 많이 존재하고 왕성한 증식기에서 키틴 함량이 높았으며 이후 영양원이 감소함에 따라 줄어들다가 균체 내에 축적된 영양원을 소모시키면서 균체량이 증식되는 현상일 것으로 판단되었으나 추정일 뿐이며 폭기 진행 중의 이산화탄소 농도의 배출 패턴과는 달랐다.
- 이산화탄소 농도 측정 결과는 유 등(1998)이 액체 배양시 접종 후 6~7일경에 PDB(potato dextrose broth), YPD(yeast extract peptone dextrose) 액체배지에서 균 총수가 최대치에 달한다고 보고한 결과와 유사한 경향을 보였다. 지금까지 대량 배양시 외관상 균사량만을 판단하여 액체종균을 제조하는 것보다는 균사 세포 호흡량의 부산물인 이산화탄소 농도를 상대적으로 측정함으로써 간단하고 시간과 분석 비용을 절약하면서도 폭기 배양의 기준을 정할 수 있는 방법이 될 것으로 판단되었다.
- 이는 투입되는 영양원과 접종 비율 등의 다양한 조건에 따라서 다르게 나타날 수 있으므로 같은 조건에서의 비교가 필요할 것이다. 침전 균사에서 총질소원의 감소와 액체종균의 상증액에서의 환원당은 폭기 진행 중에 균사의 호흡반응 그리고 균사의 증가에 따라 투입된 영양원량은 점점 감소되었다(Fig. 5).
- Table 1에서와 같이 각각의 입자는 표면 접종위치에서 습윤상태에서 벗어나 흰색의 균사 활착상태 상대적으로 확인하였다. 폭기 배양 4~5일째의 접종은 작은 입자 등의 원인으로 활착이 늦어 보였고 폭기 8일째에는 입자가 크더라도 활착은 다소 느려 보였으며, 폭기 6~7일째에 접종에서 균사활착은 가장 양호하게 보였다. 또한 16일째까지 폭기가 진행된 종균은 세포 내 영양원 고갈과 노화현상 등으로 아주 느린 활착을 보였고 배양 병에서 오염은 없었지만 균사 증식은 거의 진행되지 않았다.
- 여러 가지 분석에서 얻은 결과는 서로가 완전히 일치하는 패턴을 없었으나 환원 당 변화량과 균사활착의 결과로 볼 때 폭기 배양 6~7일 정도에 접종하는 것이 가장 좋은 것으로 평가되었다. 하지만 농가에서 균일성을 위한 수치화된 지표를 설정하기 위하여 균사의 호흡 반응량의 간이 측정으로는 비용이 저렴하고 시간 절약적인 방법으로 상대적인 이산화탄소 농도를 측정하는 것도 유용할 것으로 판단되었다.
후속연구
- 유리당의 함량은 폭기 배양 7일째에 가장 낮았으므로 폭기 배양 6~7일째에 접종원으로 사용하는 것이 가장 효과적인 것으로 생각되었다. 그리고 액체종균의 배양 중에 배출구에서의 이산화탄소 농도 측정은 저비용으로 액체종균의 균사배양 정도를 추정하는 간이 지표로 이용할 수 있을 것으로 판단되었다.
- 이 등(1992)은 운지버섯 균사체에서는 배양 6일째 환원당 함량이 거의 소비되는 것으로 보고된 것과는 다소 차이가 있었다. 이는 투입되는 영양원과 접종 비율 등의 다양한 조건에 따라서 다르게 나타날 수 있으므로 같은 조건에서의 비교가 필요할 것이다. 침전 균사에서 총질소원의 감소와 액체종균의 상증액에서의 환원당은 폭기 진행 중에 균사의 호흡반응 그리고 균사의 증가에 따라 투입된 영양원량은 점점 감소되었다(Fig.
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