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문제 정의
- 24)이렇게 분해된 세가지 형태의 생성물들과 HO-1 그 자체는 세포손상 및 사멸의 억제, 항염증 및 항산화 작용을 하는 것으로 알려져 있으며, 특히 최근에는 HO-1의 발현이 항염증작용을 통하여 세포 손상을 억제한다는 연구 결과가 보고되었다.25) 본 연구에서는 LPS로 활성화된 RAW264.7 대식세포에서 엉겅퀴 지상부의 70% 에탄올 추출물인 CJE의 HO-1 발현을 통한 항염증 효과 및 기전을 밝혔다.
- 29) 본 연구에서는 엉겅퀴 지상부의 70% 에탄올 추출물(CJE; Fig. 1)이 갖는 항염증 효과를 측정하고자 LPS로 iNOS, COX-2 단백질 발현과 그에 따른 NO, PGE2 생성을 유발시킨 RAW264.7 대식세포를 이용하여 항염증 효과와 그 기전을 연구하였다.
제안 방법
- 6). CJE 의 항염증 효과와 HO-1의 발현 간의 직접적인 관계를 알아보기 위하여, HO-1 발현 억제제인 SnPP를 이용하여 실험하였다. HO-1 발현 억제제인 SnPP를 CJE (80 μg/ml)와 함께 12시간 동안 처리한 실험에서 CJE 에 의해 억제 되었던 NO와 PGE2가 SnPP를 병용투여함으로써 부분적으로 증가되었다(Fig.
- CJE를 농도별로 RAW264.7 대식세포에 처리 하였을 때 세포 독성을 나타내지 않은 10, 20, 40, 80 μg/ml을 실험 가능한 농도로 정하고 실험을 진행 하였다(Fig. 2).
- EIA에 의한 PGE2 측정− PGE2의 측정은 항체(lyophilized prostaglandin E2 conjugate to horseradish peroxidase)를 사용하여 prostglandin E2 enzymeimmunoassay system (EIA, Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ)을 이용하였다.
- HPLC 분석 − 본 연구에서 사용한 엉겅퀴 지상부 70%에탄올 추출물(CJE)은 HPLC를 사용하여 함유 성분의 패턴을 분석하였다.
- 7대식세포에 CJE를 10, 20, 40, 80 μg/ml을 처리한 후 3시간 배양하고 LPS 1 μg/ml을 처리하였다. LPS 처리 후 24시간 후에 대표적인 염증 mediator에 영향을 주는지 확인하기 위해 iNOS, COX-2 발현을 Western blot으로 관찰하였다. LPS에 의해 증가하던 iNOS, COX-2 단백질의 발현은 CJE (10~80 μg/ml)에 의해 농도 의존 적으로 억제 되었다(Fig.
- Nitrite Assay −배양된 세포를 5×105 cells/well 수준으로 96 well plate에 100 μl씩 배양한 다음 24시간 동안 배양하고, 24시간 후 medium을 제거한 후 DMEM으로 희석된 각 농도 별 시료 처리 후 LPS (1 μg/ml)를 처리하여 24시간 후 세포에서 medium으로 분비되어 나온 NO의 양을 Griess 시약 (0.1% (w/v) N-(1-naphathyl)-ethylenediamine and 1% (w/v) sulfanilamide in 5% (v/v) phosphoric acid)을 사용하여 반응하였다.
- Western Blot Analysis − RAW264.7 대식세포를 60 mm dish에 3×105 cells/well 밀도로 24시간 배양한 후 각각의 시료를 농도별로 처리하였다.
- 기존의 배지를 제거하고 새로운 배지를 넣어준 후 DMSO에 녹인 시료를 다양한 농도(10, 20, 40, 80 μg/ml)로 DMEM 배지에 희석하여 첨가하였다.
- 7 대식세포에 RIPA buffer를 첨가한 다음, 4℃, 14,000×g에서 25분간 원심분리하고 상등액을 튜브에 옮겼다. 단백질 정량은 BSA 단백질 실험 키트를 이용하였고 각각의 시료를 12% SDSpolyacrylamide gel에서 영동하고 nitrocellulose membrane(NC membrane)으로 전사하였다. 전사된 NC membrane을 5% 무지방유가 포함된 신선한 blocking buffer (0.
- 시료를 2.5 mg/ml의 농도로 메탄올에 용해시켜 검액을 만들고, 10 μl 씩 TLC판에 점적하여 CHCl3 : MeOH (20 : 1)의 용매 조건으로 전개시키고 이를 10% 황산에 발색하였으며, Rf값이 각각 0.3, 0.45, 0.75, 0.91인 네 개의 반점들이 확인 되었다.
- 7 ml이었다. 크로마토그램은 Sykam S3200 UV/VIS Detector (Sykam, 독일)를 이용하여 210 nm에서 검출하였다. 이동상 용매로는 acetonitrile:water(1:4)에서 acetonitrile:water (4:1)의 조성으로 40분 동안 변화시켰다.
- 96-Well tissue culture plates와 기타 tissue culture dishes는 Falcon사 제품을 이용하였다. 흡광도는 BioRad사의 Microplate Reader를 이용하여 측정하였다. TLC plate는 Merck사의 Silica gel 60 F254 plate를 이용하였다.
대상 데이터
- Lipopolysaccharide (LPS)와 3'-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)는 Sigma사에서 구입하였다. 96-Well tissue culture plates와 기타 tissue culture dishes는 Falcon사 제품을 이용하였다. 흡광도는 BioRad사의 Microplate Reader를 이용하여 측정하였다.
- HO-1의 발현 실험에는 HO-1의 유도물질로 알려진 CoPP (20 μM)를 양성 대조약물로 사용하였다.
- Lipopolysaccharide (LPS)와 3'-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)는 Sigma사에서 구입하였다.
- RAW264.7 대식세포는 FBS (10%)과 penicillin(100 U/ml)와 streptomycin sulfate (100 μg/ml)가 함유된 DMEM배지에서 습한 조건의 37℃, 5% CO2 Incubator에서 배양하였다.
- 사용한 HPLC 장치는 Sykam S2100 system(Sykam, 독일)이었으며, 컬럼은 Inertsil ODS-3 (GL Sciences Inc., 4.6 × 150 m, 5 μm, 일본)을 사용하였다.
- 세포배양− RAW264.7 대식세포는 ATCC에서 동결상태로 구입하였다.
- 시약 및 기기 − DMEM 배지와 trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), fetal bovine serum (FBS)는 Gibco Laboratories사에서 구입하였다.
- 실험재료 −본 실험에 사용한 엉겅퀴 지상부는 2011년 6월 전북 진안군 성수면 좌포리에서 채집 하였으며, 형태학적 평가를 통하여 동정하였고 표본시료는 천연물 신약 표준화 소재은행에 보관하였다.
- 실험재료 −본 실험에 사용한 엉겅퀴 지상부는 2011년 6월 전북 진안군 성수면 좌포리에서 채집 하였으며, 형태학적 평가를 통하여 동정하였고 표본시료는 천연물 신약 표준화 소재은행에 보관하였다. 엉겅퀴 지상부 70% 에탄올 추출물 (CJE) 은 천연물 신약 표준화 소재 은행(소재번호 : NNMBS000283)에서 분양 받아 사용하였다.
- 6 × 150 m, 5 μm, 일본)을 사용하였다. 이동상은 acetonitrile, water (JT Baker, 미국)을 사용하였으며, 온도는 실온이었으며, 유속은 분당 0.7 ml이었다. 크로마토그램은 Sykam S3200 UV/VIS Detector (Sykam, 독일)를 이용하여 210 nm에서 검출하였다.
데이터처리
- 형성된 formazan의 각 well에 DMSO 20 μl를 첨가한 후 orbital shaker를 이용하여 녹이고, 30분 후 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은3회 반복 실시하여 평균값을 구하였으며, Control의 흡광도 값을 기준으로 세포 생존율을 비교하였다.
- 시료는 실험에 사용한 배지에 녹여서 사용하였다. 제조된 시료(CJE)는 박층크로마토그래프(TLC)법으로 함유 성분 패턴 분석을 하였다. 시료를 2.
- 통계처리 −본 실험의 통계처리는 Student’s test 방법을 사용하였으며, 값은 평균과 표준오차로 나타내었다.
이론/모형
- 30,31) CJE에 의한 Nrf2의 전사 여부를 알아보기 위하여 80 μg/ml 농도의 CJE 를 시간별로 처리하고 Western blot을 이용하여 분석하였다.
- Heme Oxygenase Activity − HO 효소 활성을 Tenhunen 등의 방법27)에 의해 다음과 같이 측정하였다.
- 세포독성−본 실험에서 RAW264.7 대식세포에 대한 세포독성 및 실험 시 처리 농도를 결정하고, 엉겅퀴 지상부 추출물의 세포독성을 측정하기 위해 MTT assay를 사용하였다.
- 4), 50 mM glycerophosphate, 20 mM NaF, 20 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 mM Na3VO4, protease inhibitors]를 첨가하고 4℃에서 15분간 혼합한 후 4℃, 16,000×g에서 15분간 원심분리 하였다. 이후의 과정은 앞에서 설명한 western blotting 방법을 이용하였다.
성능/효과
- HO-1 발현 억제제인 SnPP를 CJE (80 μg/ml)와 함께 12시간 동안 처리한 실험에서 CJE 에 의해 억제 되었던 NO와 PGE2가 SnPP를 병용투여함으로써 부분적으로 증가되었다(Fig. 7).
- 따라서, 본 연구를 통해 엉겅퀴 지상부 70% 에탄올 추출물(CJE) 은 RAW264.7 대식세포에서 Nrf2를 핵 내로 전사하고 이를 통하여 HO-1 단백질 발현을 함으로써 LPS에 의한 염증성 사이토카인으로부터 보호활성을 나타낸다는 사실을 확인하였다.
- 또한, 산화적 스트레스로부터의 뇌세포 보호기전에 관여하는 중요한 단백질인 heme oxygenase (HO)-1의 발현 정도를 알아보기 위하여 시료를 12 시간 동안 RAW264.7 대식세포에 처리한 결과, CJE (10~80 μg/ml)을 처리하였을 때 HO-1의 발현이 농도 의존적으로 뚜렷하게 증가 하였고 18시간 후에 극대 효과를 나타냈으며, HO activity 역시 증가함을 나타냈다(Fig. 5).
- 30,31) CJE에 의한 Nrf2의 전사 여부를 알아보기 위하여 80 μg/ml 농도의 CJE 를 시간별로 처리하고 Western blot을 이용하여 분석하였다. 시간이 경과함에 따라 세포질의 Nrf2는 점점 감소하는 반면, 핵 내부의 Nrf2는 증가하는 양상을 보이는 것으로 보아 Nrf2의 핵 내로의 전사가 이루어졌음을 확인할 수 있었다(Fig. 6). CJE 의 항염증 효과와 HO-1의 발현 간의 직접적인 관계를 알아보기 위하여, HO-1 발현 억제제인 SnPP를 이용하여 실험하였다.
- 엉겅퀴 지상부 추출물의 항염증 효과와 그 보호 기전을 탐색하였으며, 그 결과 엉겅퀴의 70% 에탄올 추출물(CJE)이 LPS로 유발한 RAW264.7 대식세포의 NO 및 PGE2 생성 억제와 iNOS 및 COX-2 발현 억제를 통한 유의한 항염증 효과를 나타내었다. 이는 Nrf2의 핵 내 전사 유도를 통한 HO-1 단백질 발현 기전과 관여되어 있다고 판단된다.
후속연구
- 이는 Nrf2의 핵 내 전사 유도를 통한 HO-1 단백질 발현 기전과 관여되어 있다고 판단된다. 이러한 결과를 바탕으로 향후 CJE 의 추가적인 다른 항염증 기전 연구와 활성물질의 분리 동정 연구가 필요하다고 판단된다.
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