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문제 정의
- 이에 저자는 紅花子油약침 처치가 CIA 모델 생쥐의 관절염에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, in vitro 실험에서 CIA 모델 생쥐의 윤활관절세포 내의 CIA 유발 관련 cytokines인 MIF 및 TNF-α의 mRNA의 발현 억제 효과와, in vivo 실험에서 CIA 모델 생쥐의 윤활관절막 손상 완화 여부를 관찰하기 위하여 인체의 委中(BL40)18)에 상응하는 부위에 紅花子油약침액(Chrthami semen oil pharmacopuncture, CSOP)을 시술한 후, 발의 두께 변화, 일반적인 형태 변화, 윤활관절막 내의 혈관 신생성, 섬유화, 초기 유발 관련 cytokines 생성억제, Th 1 분화억제 및 염증억제 효과를 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- Avidin biotin complex (Vector Lab, USA)에 1시간 실온에서 반응시킨 다음 0.05% 3,3'-diaminobenzidine (DAB; Sigma, USA)과 0.01% HCl이 포함된 0.05 M tris-HC완충용액(pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- CIA 유발 제 21일 후, 각 군을 sodium pentobarbital 용액으로 마취하고 vascular rinse와 10 % neutral buffered formalin(NBF)용액으로 심장관류고정을 실시하였다. 적출된 무릎관절을 decalcification solution (BBC, UK)에 24시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 paraffin에 포매하여 5 ㎛ 두께로 연속 절편을 만들었다.
- 紅花子油약침 처치가 CIA 유발 생쥐의 관절염에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, in vitro 실험에서 생쥐의 윤활관절세포내에서 CIA 유발 유전자 발현변화 조사를 위한 MIF와 TNF-α의 mRNA 발현억제를, in vivo 실험에서 CIA 생쥐의 윤활관절막 손상완화 여부를 조사하였다. CIA 유발 제3일부터 제21일까지 매일 관절염 유발 부위인 왼쪽 委中(BL40)에 CSOP를 1 ㎕/20g 시술한 후, 발의 두께 변화, 일반적인 형태 변화, 윤활관절막 내의 혈관 신생성, 섬유화, 초기 유발 관련 cytokines 생성 억제효과, Th 1 분화 억제 효과 및 염증 억제 효과를 관찰한 결과, 다음과 같은 결론을 얻었다.
- CIA 유발 제3일부터 제21일까지, 매일 골도분촌법 에 의거하여 인체의 委中(BL40) 에 상응하는 생쥐의 왼쪽 膝窩部 부위에 30 gauge 주사기로 CSOP를 50 ㎕/㎏의 비율로 1 ㎕/20g 약침 시술하였다.
- CIA의 유발을 위해 CII와 CFA 혼합액 50 ㎕를 꼬리연결 근육부위에 피내주사를 통해 1차 접종을 하고, 2주 후에 CII와 CFA 혼합액 25 ㎕를 왼쪽 발바닥에 추가 접종하여 CIA를 유발하였다. CIA 유발 후 1주일 간격으로 발의 두께 변화를 dial thickness cage(Mitutoyo, Japan)로 측정하였다.
- CIA 유발 후 윤활관절막 내의 T 세포 분화 변화를 조사하기 위해 Th 1 세포 분화에 관여하는 CD28 분자와 interleukin (IL)-12의 생성 변화를 mouse anti mouse CD28 (1 : 2500, Santa Cruz Biotec, USA)항체 와 mouse anti mouse IL-12 (1 : 2500, Santa Cruz Biotec, USA)항체를 이용한 면역조직화학적으로 관찰하였다.
- CII와 4 ㎎/㎖의 complete Freund’s adjuvant containing mycobacterium tuberculosis strain H37RA (CFA, Chondrex, USA)를 동량으로 섞은 후 균질기를 이용하여 1,000 rpm의 속도로 혼합하였다. CIA의 유발을 위해 CII와 CFA 혼합액 50 ㎕를 꼬리연결 근육부위에 피내주사를 통해 1차 접종을 하고, 2주 후에 CII와 CFA 혼합액 25 ㎕를 왼쪽 발바닥에 추가 접종하여 CIA를 유발하였다. CIA 유발 후 1주일 간격으로 발의 두께 변화를 dial thickness cage(Mitutoyo, Japan)로 측정하였다.
- Mayer’s hematoxylin에 5분간 핵 염색한 다음 phloxine 용액 30분간 반응시킨 후, tartrazine 용액에서 분별하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- PCR 산물은 1-2% agarose gel상에서 전기 영동하여 relative intensity로 측정하였다. 한편 RT-PCR의 정확성을 평가하기 위하여 internal standard인 beta-actin의 증폭을 동시에 실시하였다.
- RT-PCR kit (Premega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 MIF, TNF-α primer를 PCR machine으로 반응시켰다(Table 1).
- 한편 RT-PCR의 정확성을 평가하기 위하여 internal standard인 beta-actin의 증폭을 동시에 실시하였다. mRNA 발현의 relative intensity는 Optimas 5.2(Optima Co., USA)를 이용한 영상분석(image analysis)을 통해 비교하였다.
- mRNA 발현의 relative intensity와 면역조직화학의 결과의 수치화를 위해 Optimas 5.2 (Optima Co., USA)를 이 용한 영상분석을 실시하였다. 영상분석 결과는 Sigmaplot 2000 (Spss Inc.
- 紅花子油약침 처치가 CIA 유발 생쥐의 관절염에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, in vitro 실험에서 생쥐의 윤활관절세포내에서 CIA 유발 유전자 발현변화 조사를 위한 MIF와 TNF-α의 mRNA 발현억제를, in vivo 실험에서 CIA 생쥐의 윤활관절막 손상완화 여부를 조사하였다.
- 그리고 1차 항체인 mouse anti mouse MIF (1 : 200, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti mouse TNF-α (1 : 200, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti mouse IL-6 (1 : 100, Santa Cruz Biotec, USA) 및 mouse anti mouse MMP-9 (1 : 100, Santa Cruz Biotec, USA)에 4℃ humidified chamber에서 72시간 반응시켰으며, 2차 항체인 biotinylated goat anti-mouse IgG (Santa Cruz Biotec, USA)에 4℃ humidified chamber에서 24시간 link 하였다.
- 대한약침학회의 GMP 기준시설하에서 씨앗의 세정, 분쇄, 껍질 제거, 스크류 프레싱(screw pressing) 과정 후 3단계 여과장치 (0.45 ㎛, 0.2 ㎛)를 거쳐 윤제를 여과하였고, 최종 윤제를 질소충전 및 포장하는 과정을 통해 紅花子油 약침액을 제조하였으며, 시술 시에는 1 cc 일회용 주사기(Safe1ne/경기의료공업, 한국)에 30 gauge 1/2" 일회용 주사침[정림의료기산업(주), 한국]을 사용하였다.
- 적출된 무릎관절을 decalcification solution (BBC, UK)에 24시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 paraffin에 포매하여 5 ㎛ 두께로 연속 절편을 만들었다. 만들어진 연속 절편은 hematoxylin과 eosin으로 염색하여 표본을 제작하였다.
- 무처치한 정상군, 관절염을 유발시킨 대조군 및 관절염 유발 후 CSOP 시술을 한 실험군으로 나누었으 며, 각 군에 10마리씩 배정하였다.
- 염증을 조절하는 전사인자 peroxisome proliferator activated receptor (PPAR)-γ의 분포 변화를 조사하기 위해 mouse anti mouse PPAR-γ (1 : 2,500, Santa Cruz Biotec, USA)항체를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다.
- 1 % collagenase에 37℃에서 1시간 처리 한 다음 3,000 rpm에 5분간 원심분리하고 37℃, 5 % CO2 incubator에서 10% fetal bovine serum(FBS; Sigma, USA)이 함유된 DMEM을 사용하여 배양하였다. 오염방지를 위해 항생제로 100 unit/㎖ penicillin과 100 ㎍/㎖ streptomycin (Gibco/BRL, USA)을 첨가하였다. 세포는 flask 내에서 80% 정도 자랐을 때 PBS로 씻어주고, Trypsin-EDTA(Gibco/BRL, USA) 를 처리하여 계대배양하였다.
- 우선 관절주변 근육을 제거하고 윤활관절주머니를 개방한 후 0.1 % collagenase가 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM; 웹진, 한국)에 2시간 반응시켜 윤활관절막을 분리하고 세절하였다.
- 우선 무릎관절 표본은 Weigert’s iron hematoxylin에서 20분간 핵 염색한 다음 Van Gieson’s 염색용액에서 5분간 collagen섬유에 대한 염색을 실시하였다.
- 윤활관절세포 -5×105 cells/well을 6 well에 plating하고 12시간 후에 phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA; Sigma, USA) 1 ng/㎖를 1시간 처리하여 CIA 유발 관련 cytokines mRNA 활성을 유도하였다.
- 윤활관절세포는 관절염 유발 후 암컷 DBA 생쥐 무릎관절에서 적출하였다. 우선 관절주변 근육을 제거하고 윤활관절주머니를 개방한 후 0.
- CIA 유발 제 21일 후, 각 군을 sodium pentobarbital 용액으로 마취하고 vascular rinse와 10 % neutral buffered formalin(NBF)용액으로 심장관류고정을 실시하였다. 적출된 무릎관절을 decalcification solution (BBC, UK)에 24시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 paraffin에 포매하여 5 ㎛ 두께로 연속 절편을 만들었다. 만들어진 연속 절편은 hematoxylin과 eosin으로 염색하여 표본을 제작하였다.
- 초기 CIA 유도 cytokine인 MIF, pro-inflammatory cytokines인 TNF)-α, IL-6R-α 및 단백분해효소인 MMP-9의 윤활관절막 내 분포변화를 조사하기 위해 면역조직화학적 염색을 실시하였다.
- PCR 산물은 1-2% agarose gel상에서 전기 영동하여 relative intensity로 측정하였다. 한편 RT-PCR의 정확성을 평가하기 위하여 internal standard인 beta-actin의 증폭을 동시에 실시하였다. mRNA 발현의 relative intensity는 Optimas 5.
대상 데이터
- 배지는 2일마다 교환하여 주었다. 실험에는 3~5회 계대배양 세포를 사용하였다.
- 오리엔트(한국)에서 분양받은 태령 4주된 DBA 암컷 생쥐를 무균사육장치 내에서 2주일 동안 적응시킨 후 체중 20 g된 생쥐를 선별하여 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험의 결과는 ANOVA test (SPSS14KO, SPSS. USA)를 통해 검증하였으며 신뢰도 95% 이상(p<0.05)일 때 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
- , USA)를 이 용한 영상분석을 실시하였다. 영상분석 결과는 Sigmaplot 2000 (Spss Inc. USA)을 통해 유의성을 검증하였다. 본 실험의 결과는 ANOVA test (SPSS14KO, SPSS.
이론/모형
- 윤활관절막 내 collagen섬유의 분포 변화 관찰은 Van Gieson’s picric acid-fuchsin 염색을 통해 이루어졌다.
- 초기 류머티스성 관절염 유발을 주도하는 cytokine인 macrophage migration inhibitory factor (MIF) mRNA와 pro-inflammatory cytokine인 tumor necrosis factor (TNF)-α의 mRNA 발현 양상을 조사하기 위해 역전사 중합효소 연쇄반응법(reverse transcriptase-polymerase chain reaction; RT-PCR)을 실시하였다.
- 혈관의 분포 변화를 조사하기 위해 phloxine-tartrazine 염색법을 실시하였다. Mayer’s hematoxylin에 5분간 핵 염색한 다음 phloxine 용액 30분간 반응시킨 후, tartrazine 용액에서 분별하여 광학현미경으로 관찰하였다.
성능/효과
- 1. CSOP가 처리된 CIA 유발 생쥐의 윤활관절세포에 서는 초기 류머티스성 관절염 유발 관련 cytokines 인 MIF와 TNF-α의 mRNA 발현이 농도의존적으로 감소하였다.
- 2. CSOP가 시술된 생쥐의 발의 두께가 유의성 있게 감소하였다.
- 3. CSOP가 시술된 생쥐의 무릎 윤활관절막 내 조직 손상, 모세혈관 분포 및 섬유화가 유의성 있게 감소하였다.
- 4. CSOP가이 시술된 생쥐의 초기 류머티스성 관절염 유발 관련 cytokines의 생성 억제 효과 실험 중 MIF, TNF-α, IL-6 및 MMP-9이 유의성 있게 감소하였다.
- 5. CSOP가 시술된 생쥐의 Th 1 세포 분화의 억제 효과 실험 중 IL-12와 CD28이 유의성 있게 감소하였다.
- 6. CSOP가 시술된 생쥐의 염증 억제 실험 중 PPAR-γ가 유의성 있게 증가하였다.
- 이런 CD28 양성반응세포는 윤활관절막 전부위에 분포하였고, 핵 주변 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. CD28 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비하여 739% 증가하였고, 실험군은 대조군에 비하여 508% 감소하였다(Table 4, Fig. 4B).
- CD28의 양성반응세포의 분포는 정상군 548±08 particles에 비하여 대조군이 4599±63 particles로 증가하였으며, 실험군은 2286±40으로서 대조군에 비하여 유의성(p < 0.05) 있는 억제를 나타내었다.
- 이런 IL-12 양성반응세포는 윤활 관절막 자유면 부위에 분포하였고, 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. IL-12 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비하여 946% 증가하였고, 실험군은 대조군에 비하여 33% 감소하였다(Table 4, Fig. 4A).
- IL-12의 양성반응세포의 분포는 정상군 493±11 particles에 비하여 대조군이 5156±65 particles로 증가하였으며, 실험군은 3457±55 particles로서 대조군에 비하여 유의성(p < 0.05) 있는 억제를 나타내었다.
- IL-6의 양성반응세포의 분포는 정상군 205±07 particles에 비하여 대조군이 3175±28 particles로 증가하였으며, 실험군군은 1510±25 particles로서 대조군에 비하여 유의성(p < 0.05) 있는 억제를 나타내었다.
- 이런 IL-6 양성반응세포는 윤활관절막 자유면 부위에 분포하였고, 핵막 주변 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. IL-6의 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비하여 1449% 증가하였고, 실험군은 대조군에 비하여 52 % 감소하였다(Table 3, Fig. 3C).
- In vivo 실험에서 type Ⅱ collagen 유발 생쥐의 관절염을 대상으로 슬관절 근위에 있고, 문헌적으로 痺證에 다용되는 인체의 委中(BL40) 18) 상응하는 부위에 紅花子油약침을 주입한 후, 발의 두께 변화를 조사한 결과 실험군이 대조군에 비하여 유의성 있게 감소되어 염증이 완화된 것을 확인하였고, 조직화학 실험으로 윤활관절막 내의 형태학적 변화에서 대조군에 비하여 실험군은 윤활관절막의 자유면 두께 증가와 유활강 쪽에서 많은 세포질 돌기를 내는 윤활세포들의 출현도 감소한 것으로 관찰되며, 또한 림프구 침윤도 적었다.
- 이런 MIF 양성반응세포는 윤활관절막 자유면 부위에 분포하였고, 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. MIF 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비하여 1,303% 증가하였고, 실험군은 대조군에 비하여 40% 감소하였다 (Table 3, Fig. 3A).
- MIF의 양성반응세포의 분포는 정상군 264±06 particles에 비하여 대조군 3704±21 particles로 증가하였으며, 실험군은 2216±42 particles로서 대조군에 비하여 유의성(p < 0.05) 있는 억제를 나타내었다.
- 이런 MMP-9 양성반응세포는 윤활관절막 자유면 부위에 분포하였고, 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. MMP-9 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비하여 974% 증가하였고, 실험군은 대조군에 비하여 52% 감소하였다(Table 3, Fig. 3D).
- MMP-9의 양성반응세포의 분포는 정상군 436±06 particles에 비하여 대조군이 4684±41 particles로 증가하였으며, 실험군은 2230±40 particles로서 대조군에 비하여 유의성(p < 0.05) 있는 억제를 나타내었다.
- PMA 자극에 의한 윤활관절세포에서의 MIF mRNA 발현은 증가하였는데, 실험군은 CSOP 처리 후 농도 의존적으로 발현이 감소되었다. 즉 PMA 자극 시 발현되는 MIF mRNA 발현량에 비하여 10-4에서 13.
- PMA 자극에 의한 윤활관절세포에서의 TNF-α mRNA 발현은 증가하였는데, 실험군은 CSOP 처리 후 농도의존적으로 발현이 감소되었다.
- PPAR-γ 양성반응세포는 윤활관절막 자유면 부위에 분포하였고, 핵막 주변 세포질에서 강한 양성반응을 보였다.
- PPAR-γ 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비하여 289% 증가하였고, 실험군은 대조군에 비하여 128% 증가하였다(Table 4, Fig. 4C).
- PPAR-γ의 양성반응세포의 분포는 정상군 354±06 particles에 비하여 대조군이 1377±38 particles로 증가하였으며, 실험군은 3134±57 particles로서 대조군에 비하여 유의성(p < 0.05)있는 증가를 나타내었다.
- TNF-α 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비하여 442% 증가하였고, 실험군은 대조군에 비하여 44% 감소하였다(Table 3, Fig. 3B).
- TNF-α의 양성반응세포의 분포는 정상군 310±06 particles에 비하여 대조군이 1619±35 particles로 증가하였으며, 실험군은 909±13 particles로서 대조군에 비하여 유의성(p < 0.05) 있는 억제를 나타내었다.
- 윤활관절막 내 Th 1 분화 억제에 미치는 영향을 조사하기 위해 Th 1 세포 분화에 관여하는 cytokine인 IL-12 양성반응의 영상분석 결과 대조군이 정상군에 비하여 946% 증가하였고 실험군은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다. Th 1세포 분화 신호기전에 관여하는 CD28 양성반응의 영상분석 결과 대조군이 정상군에 비하여 739% 증가하였고 실험군은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다. 윤활관절막 내 염증 억제에 미치는 영향을 조사하기 위해 염증 억제에 관여하는 PPAR-γ 양성반응의 영상분석 결과 대조군이 정상군에 비하여 289% 증가하였고 실험군은 대조군에 비하여 유의성 있게 증가하였다.
- pro-inflammatory cytokine인 TNF-α 양성반응의 영상분석 결과 대조군이 정상군에 비하여 422% 증가하였고 실험군은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였으며, IL-6 양성반응의 영상분석 결과 대조군이 정상군에 비하여 1,449% 증가하였고 실험군은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다.
- pro-inflammatory cytokine인 TNF-α 양성반응의 영상분석 결과 대조군이 정상군에 비하여 422% 증가하였고 실험군은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였으며, IL-6 양성반응의 영상분석 결과 대조군이 정상군에 비하여 1,449% 증가하였고 실험군은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다. 단백분해 효소인 MMP-9 양성 반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비하여 974% 증가하였고 실험군은 대조군 에 비하여 유의성 있게 감소하였다. 윤활관절막 내 Th 1 분화 억제에 미치는 영향을 조사하기 위해 Th 1 세포 분화에 관여하는 cytokine인 IL-12 양성반응의 영상분석 결과 대조군이 정상군에 비하여 946% 증가하였고 실험군은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다.
- 상응하는 부위에 紅花子油약침을 주입한 후, 발의 두께 변화를 조사한 결과 실험군이 대조군에 비하여 유의성 있게 감소되어 염증이 완화된 것을 확인하였고, 조직화학 실험으로 윤활관절막 내의 형태학적 변화에서 대조군에 비하여 실험군은 윤활관절막의 자유면 두께 증가와 유활강 쪽에서 많은 세포질 돌기를 내는 윤활세포들의 출현도 감소한 것으로 관찰되며, 또한 림프구 침윤도 적었다. 대조군의 윤활관절막 내 지방조직 사이에서 적은 수로 분포한 혈관은 대조군에서 증가되었는데 특히 윤활관절막의 자유면 기저부의 윤활세포 주변에서 모세혈관후세정맥의 출현이 증가하였으나 실험군은 일부 윤활관절막의 자유면에서만 모세혈관의 출현 증가가 관찰되었고, 류머티스성 관절염의 특징인 섬유화 또한 대조군에 비하여 감소하였고 섬유화 주변에 침적하는 섬유모세포의 수도 적었다.
- 면역조직화학 실험으로 윤활관절막 내 초기 CIA 유발 관련 cytokines 생성 억제에 미치는 영향을 조사하기 위해 CIA 유도 cytokine인 MIF 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비하여 1,303% 증가하였고, 실험군은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다. pro-inflammatory cytokine인 TNF-α 양성반응의 영상분석 결과 대조군이 정상군에 비하여 422% 증가하였고 실험군은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였으며, IL-6 양성반응의 영상분석 결과 대조군이 정상군에 비하여 1,449% 증가하였고 실험군은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다.
- 본 실험의 결과는 황13)의 녹용약침을 사용한 실험에서 류머티스성 관절염에 유효한 효과가 있다고 발표한 결과와 유사하게 나타났으며, 또한 이9)의 유근피를 사용한 실험에서 유효한 효과를 입증한 실험적 보고와도 일치하여 염증성 관절질환에 대한 치료에서 각각의 약침제제가 효과가 있음을 시사하고 있다. 이와 같은 결과를 토대로 하여 추후 각각의 약물을 배합한 혼합약제에 의한 약침제제에 대한 연구가 적극적으로 이루어진다면 더욱 우수한 치료효과가 기대된다.
- 초기 CIA 유도 cytokine인 MIF, pro-inflammatory cytokines인 TNF)-α, IL-6R-α 및 단백분해효소인 MMP-9의 윤활관절막 내 분포변화를 조사하기 위해 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 우선 절편을 blocking serum인 10% normal goat serum (1 : 20, DAKO, Denmark)에서 12시간 반응시켜 비특이적 면역반응을 억제하였다. 그리고 1차 항체인 mouse anti mouse MIF (1 : 200, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti mouse TNF-α (1 : 200, Santa Cruz Biotec, USA), mouse anti mouse IL-6 (1 : 100, Santa Cruz Biotec, USA) 및 mouse anti mouse MMP-9 (1 : 100, Santa Cruz Biotec, USA)에 4℃ humidified chamber에서 72시간 반응시켰으며, 2차 항체인 biotinylated goat anti-mouse IgG (Santa Cruz Biotec, USA)에 4℃ humidified chamber에서 24시간 link 하였다.
- 단백분해 효소인 MMP-9 양성 반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비하여 974% 증가하였고 실험군은 대조군 에 비하여 유의성 있게 감소하였다. 윤활관절막 내 Th 1 분화 억제에 미치는 영향을 조사하기 위해 Th 1 세포 분화에 관여하는 cytokine인 IL-12 양성반응의 영상분석 결과 대조군이 정상군에 비하여 946% 증가하였고 실험군은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다. Th 1세포 분화 신호기전에 관여하는 CD28 양성반응의 영상분석 결과 대조군이 정상군에 비하여 739% 증가하였고 실험군은 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다.
- 윤활관절막 내 염증 억제에 미치는 영향을 조사하기 위해 염증 억제에 관여하는 PPAR-γ 양성반응의 영상분석 결과 대조군이 정상군에 비하여 289% 증가하였고 실험군은 대조군에 비하여 유의성 있게 증가하였다.
- 이와 같은 이론적 근거를 토대로 하여 본 연구에서 생쥐에 type Ⅱ collagen으로 관절염을 유발(CIA)시킨 후 in vitro 실험에서 in vivo 실험에 사용된 동일한 생쥐의 무릎 윤활관절세포를 적출 및 배양하여 CIA 유발 관련 cytokines인 MIF, TNF-α의 mRNA 발현량을 측정한 결과 紅花子油약침액을 처리하지 않은 윤활관절세포에 비하여 紅花子油약침액을 처리한 윤활관절세포에서 MIF mRNA는 10-4에서 13.9%, 10-3에서 20.3%, 10-2에서 20.6% 및 10-1에서 52.6%가, TNF-α mRNA는 10-4에서 4%, 10-3에서 15.2%, 10-2 에서 17.8 % 및 10-1에서 18.5%가 감소하여 MIF와 TNF-α의 mRNA 발현량 모두 농도 의존적으로 감소하였다.
- 에서 서술한 痺症 중 여러 관절들이 손상되고 상하 좌우로 이동하며 교체 발작하는 임상 증상과 성질에 근거하여 周痺 및 衆痺에 속하고, 病程이 길고 관절 腫痛이 오래도록 낫지 않는다는 점에서 頑痺에 속하며, 全身 大關節이 腫痛하고 晝輕夜重하며 그 통증이 극심하다는 점에서 歷節風, 白虎歷節風, 痛風 등과 유사하다. 종합해보면 痺證2), 歷節風3), 白虎歷節風4), 및 痛風5) 등의 범주에 속한다고 볼 수 있다. 歷節風의 치료는 風寒濕의 원인을 제거하고, 淸熱시키며 鬱滯된 氣血을 소통시키는 것이 중요 관건이라 할 수 있다18).
- PMA 자극에 의한 윤활관절세포에서의 MIF mRNA 발현은 증가하였는데, 실험군은 CSOP 처리 후 농도 의존적으로 발현이 감소되었다. 즉 PMA 자극 시 발현되는 MIF mRNA 발현량에 비하여 10-4에서 13.9%, 10-3에서 20.3%, 10-2에서 20.6% 및 10-1에서 52.6%가 각각 감소하였다(Fig. 1).
- 즉 PMA 자극 시 발현되는 TNF-α mRNA 발현량에 비하여 10-4에서 4%, 10-3에서 15.2%, 10-2에서 17.8% 및 10-1에서 18.5%가 각각 감소하였다(Fig. 1).
후속연구
- 이와 같은 결과를 토대로 하여 추후 각각의 약물을 배합한 혼합약제에 의한 약침제제에 대한 연구가 적극적으로 이루어진다면 더욱 우수한 치료효과가 기대된다.
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