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문제 정의
- 본 연구에서는 동규자를 이용하여 천연 오일을 비화학적 방법으로 추출하여 오일(M.V. oil)을 제조하였고, 이에 대한 항염효능 평가를 실시함으로써 아토피 및 피부염의 증상완화에 도움을 주는 오일을 제시하고자 하였다.
제안 방법
- − 시료는 건조된 동규자(아욱의 종자, Malva verticillata L.), 500 g을 초고압 장치(TFS10L, TOYO KOATSU Co., LTD, Tokyo, Japan)를 이용하여 최적 조건으로 선택한 60℃, 100 MPa의 압력을 이용하여 24시간 동안 전 처리한 후, 착유기(Oil LOVE, NATIONAL ENG CO., LRD, Seoul, Korea)로 착유하여 400 mesh에 여과하였다.
- 10 µg/ml의 농도로 LPS를 처리하고 동시에 M.V. oil 를 250 ppm, 125 ppm, 62.5 ppm의 농도로 처리하였다.
- 24시간 후에 배지를 제거하고, Trizol을 이용해 RNA isolation 하였다(the manufacturer’s instruction을 참고).
- 2시간 뒤에 시료를 제거한 후, DMSO 150 µl를 각 well 마다 첨가하여 형성된 formazan을 녹인 후 540 nm에서 흡광도를 측정, 분석 하였다.
- 5 ppm의 농도로 각각 처리하였다. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 시약을 이용해 세포 독성의 유무를 확인하기 위해 24시간 뒤에 MTT solution을 처리하였다. 2시간 뒤에 시료를 제거한 후, DMSO 150 µl를 각 well 마다 첨가하여 형성된 formazan을 녹인 후 540 nm에서 흡광도를 측정, 분석 하였다.
- RNA isolation 후 충분히 건조시키고 diethylpyrocarbonate (DEPC) treated water로 re-dissolve하였다. BioRad iScript cDNA Synthesis Kits (Hercules, CA)를 이용해 cDNA를 합성하였다. Primer 는 NCBI에서 확인 후 Bioneer (Daejon, Korea)에서 주문 제작하였고, Table I에 나타내었다.
- Fig. 2에서는 M.V. oil을 각 250 ppm, 125 ppm, 62.5 ppm 의 농도로 처리하여, 각각 RNA를 추출하여 mRNA 수준에서 COX-2, iNOS, TNF-α의 발현량을 RT-PCR로 비교하였다.
- 7 cells를 5×104 cells/well 농도로 96-well plate에 접종한 후 24시간 동안 37 ℃ 인큐베이터에서 안정화 시켰다. M.V. oil 을 250 ppm, 125 ppm, 62.5 ppm의 농도로 각각 처리하였다. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 시약을 이용해 세포 독성의 유무를 확인하기 위해 24시간 뒤에 MTT solution을 처리하였다.
- NO를 생성함으로써 염증의 다음 반응들이 순차적으로 일어나게 된다. NO의 생성을 유도시킨 후 M.V. oil을 처리하여 NO의 생성량을 측정하였다. Fig.
- Primer 는 NCBI에서 확인 후 Bioneer (Daejon, Korea)에서 주문 제작하였고, Table I에 나타내었다. Taq-polymerase (Geneall, Seoul, Korea)로 유전자증폭을 실시하였고, denaturation 95℃, elongation 72℃에서 진행하였다. 생산물은 2% argarose gel에서 전기영동 하였고, EtBr로 염색하여 GelDoc (Vilber lourmat, France and Delta2d, Decodon, Germany)확인하였다.
- − 외부의 요인으로 인해 염증반응을 일으키는 면역글로불린 외에 대식세포 역시 면역에 있어서 중요한 세포이다. 내독소인 LPS에 의해 염증 반응을 일으키는데 이를 이용하여 세포단계에서 항염증 실험을 실시한다. 생쥐의 대식세포인RAW 264.
- Taq-polymerase (Geneall, Seoul, Korea)로 유전자증폭을 실시하였고, denaturation 95℃, elongation 72℃에서 진행하였다. 생산물은 2% argarose gel에서 전기영동 하였고, EtBr로 염색하여 GelDoc (Vilber lourmat, France and Delta2d, Decodon, Germany)확인하였다.
- 생쥐의 대식세포인RAW 264.7 cells에 내독소인 LPS를 10 µg/ml 농도로 처리 하여 염증메커니즘을 유도 시켜 염증매개 사이토카인인 TNF-α와 iNOS의 발현을 증가 시키고, 각 농도의 M.V. oil 을 처리하여 사이토카인이 억제되는 정도를 확인하였다.
대상 데이터
- − Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin (PS), phosphate buffered saline (PBS)는 WelGENE (Daegu, Korea)에서 구입하였고, Ham's Nutrient Mixture F-12 (F12), Trypsin-EDTA는 Gibco (BRL, Rockville, MD)에서 구입하였다.
- − 생쥐대식세포(mouse macrophage, RAW 264.7)을 사용 하였다.
- 7)을 사용 하였다. RAW 264.7 cells는 ACTT (Manassas, VA)에서 구매하여 10% FBS가 첨가된 DMEM을 이용하여 배양하였다. 배양된 세포는 phosphate buffer saline 완충 용액(0.
- Louis, MO)에서 구입하였다. Trizol은 invitrogen (Carlsbad, CA)에서 구입하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO), MeOH, EtOH, chloroform, isopropanol, Agarose, Ethidiumbromide (EtBr), Tris은 DAEJUNG (Gyeonggi-do, Korea)에서 구입하였다.
- − Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin (PS), phosphate buffered saline (PBS)는 WelGENE (Daegu, Korea)에서 구입하였고, Ham's Nutrient Mixture F-12 (F12), Trypsin-EDTA는 Gibco (BRL, Rockville, MD)에서 구입하였다. Trypan blue는 Sigma chemical Co. (St. Louis, MO)에서 구입하였다. Trizol은 invitrogen (Carlsbad, CA)에서 구입하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO), MeOH, EtOH, chloroform, isopropanol, Agarose, Ethidiumbromide (EtBr), Tris은 DAEJUNG (Gyeonggi-do, Korea)에서 구입하였다.
데이터처리
- − 각각의 실험은 통계를 위해서 3번 이상 수행하였고, Graphpad prism으로 통계분석하였다.
이론/모형
- −산가는 AOCS 방법(AOCS Official Method Cd 3a-63)을 참고하여 측정하였다.
성능/효과
- − MTT assay를 통한 M.V. oil의 농도에 따른 세포 독성을 확인한 결과 최대 250 ppm 농도까지 세포 독성이 일어나지 않았음을 확인하였다.
- Fig. 3에서 10 µg/ml LPS만 처리하였을 때의 NO의 양에 비해 M.V. oil을 같이 처리하였을 때 125 ppm의 농도일 때 NO가 최대 91.13%까지 저해 효과가 있는 것으로 확인하였다.
- 13%까지 억제하는 효과를 확인할 수 있었다. M.V. oil은 염증을 유발하는 다양한 사이토카인 중 NO와 iNOS을 조절하는 메커니즘으로 항염 효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 M.
- 5 ppm 의 농도로 처리하여, 각각 RNA를 추출하여 mRNA 수준에서 COX-2, iNOS, TNF-α의 발현량을 RT-PCR로 비교하였다. 모든 실험 군은 house keep gene인 GAPDH로 비교 정량 한 결과 동규자의 iNOS 발현을 현저하게 억제했음을 확인 할 수 있었다. 밴드의 정량을 수행한 결과 250 ppm 농도의 M.
- 모든 실험 군은 house keep gene인 GAPDH로 비교 정량 한 결과 동규자의 iNOS 발현을 현저하게 억제했음을 확인 할 수 있었다. 밴드의 정량을 수행한 결과 250 ppm 농도의 M.V. oil에서 LPS에 의해서 유도된 iNOS 발현을 control에 비해 약 32%의 억제율을 확인 하였다. 반면 염증 관련 사이토카인인 COX-2와 TNF-α의 발현량의 차이는 없었다.
- 동규자는 아욱의 종자로 오일에 대한 효능연구, 특히 항염효과에 대한 연구는 전무한 실정이다. 본 연구에서, M.V. oil을 초고압으로 전처리하여 착유한 것으로 250 ppm 농도까지 세포의 독성이 나타나지 않았으며, 염증을 유발하는 사이토카인 중 iNOS의 발현량을 mRNA level에서 약 32%억제시켰으며, NO의 발현양을 91.13%까지 억제하는 효과를 확인할 수 있었다. M.
- 오일의 산가 변화에 대한 측정 결과 M.V. oil은 0.03이하로 기존에 알려진 olive oil(산가 1이하)과 비교하였을 때 매우 우수한 산가를 확인하여 안정성이 매우 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
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