Objectives: The aim of this study is to investigate immune enhancing effect of Houttuyniae Herba water extract(HW) on RAW 264.7 cell of mouse macrophages. Methods: Effects of HW on productions of nitric oxide(NO) and hydrogen peroxide($H_2O_2$) in RAW 264.7 mouse macrophages were measured...
Objectives: The aim of this study is to investigate immune enhancing effect of Houttuyniae Herba water extract(HW) on RAW 264.7 cell of mouse macrophages. Methods: Effects of HW on productions of nitric oxide(NO) and hydrogen peroxide($H_2O_2$) in RAW 264.7 mouse macrophages were measured. Effect of HW on production of cytokines such as interleukin(IL)-$1{\beta}$, IL-6, and tumor necrosis factor(TNF)-${\alpha}$ in RAW 264.7 cells was accessed by a multiplex bead array assay based on xMAP technology. All of results were represented P<0.05 compared to the normal. Results: 1. After 24 hr incubation, HW increased significantly NO production in RAW 264.7 cells at the concentrations of 25, 50, 100 and 200 ${\mu}g$/mL. 2. After 24 hr incubation, HW increased significantly hydrogen peroxide production in RAW 264.7 cells at the concentrations of 25, 50, 100 and 200 ${\mu}g$/mL. 3. After 24 hr incubation, HW increased significantly IL-$1{\beta}$ production in RAW 264.7 cells at the concentrations of 100 and 200 ${\mu}g$/mL. 4. After 24 hr incubation, HW increased significantly IL-6 production in RAW 264.7 cells at the concentrations of 100 and 200 ${\mu}g$/mL. 5. After 24 hr incubation, HW increased significantly TNF-${\alpha}$ production in RAW 264.7 cells at the concentrations of 50, 100, and 200 ${\mu}g$/mL. Conclusions: These results suggest that HW has immune enhancing activity related with its increasement of NO, hydrogen peroxide, IL-$1{\beta}$, IL-6, and TNF-${\alpha}$ in macrophages.
Objectives: The aim of this study is to investigate immune enhancing effect of Houttuyniae Herba water extract(HW) on RAW 264.7 cell of mouse macrophages. Methods: Effects of HW on productions of nitric oxide(NO) and hydrogen peroxide($H_2O_2$) in RAW 264.7 mouse macrophages were measured. Effect of HW on production of cytokines such as interleukin(IL)-$1{\beta}$, IL-6, and tumor necrosis factor(TNF)-${\alpha}$ in RAW 264.7 cells was accessed by a multiplex bead array assay based on xMAP technology. All of results were represented P<0.05 compared to the normal. Results: 1. After 24 hr incubation, HW increased significantly NO production in RAW 264.7 cells at the concentrations of 25, 50, 100 and 200 ${\mu}g$/mL. 2. After 24 hr incubation, HW increased significantly hydrogen peroxide production in RAW 264.7 cells at the concentrations of 25, 50, 100 and 200 ${\mu}g$/mL. 3. After 24 hr incubation, HW increased significantly IL-$1{\beta}$ production in RAW 264.7 cells at the concentrations of 100 and 200 ${\mu}g$/mL. 4. After 24 hr incubation, HW increased significantly IL-6 production in RAW 264.7 cells at the concentrations of 100 and 200 ${\mu}g$/mL. 5. After 24 hr incubation, HW increased significantly TNF-${\alpha}$ production in RAW 264.7 cells at the concentrations of 50, 100, and 200 ${\mu}g$/mL. Conclusions: These results suggest that HW has immune enhancing activity related with its increasement of NO, hydrogen peroxide, IL-$1{\beta}$, IL-6, and TNF-${\alpha}$ in macrophages.
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문제 정의
이에 본 연구에서는 어성초가 macrophage의 면역활성에 미치는 영향을 살펴보고자 어성초 물추출물을 마우스 macrophage RAW 264.7 cell에 배양한 후 NO, H2O2, IL-1β, IL-6 및 TNF-α 등의 생성량을 측정하여 유의한 변화에 대해 조사하였다.
하지만, 魚腥草의 마우스 대식세포의 면역증진 효과에 관한 다양한 인자와 농도별 연구가 부족하여 저자는 어성초 물 추출물을 mouse macrophage RAW264.7 cell의 NO, H2O2, IL-1β, IL-6 및 TNF-α 등의 생성에 미치는 영향을 조사하였고, 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
DHR(10 μM)이 담긴 배지를 30분간 각 well에 먼저 처리, 제거한 후 CF를 배지에 담아 각 well에 처리한 뒤 24 시간 동안 CO2 배양기에서 배양한 다음 spectrofluorometer를 이용하여 세포내 H2O2 생성량을 측정, 비교하였다.
배양이 끝난 후 상등액을 채취하여 Bio-Plex Suspension Array System을 이용, xMAP technology를 기반으로 한 Quantitative Multiplexed Cytokine/Chemokine Assay를 실시하여 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 등의 생성량을 측정, 비교하였다.
어성초 물추출물이 RAW 264.7 cell의 NO 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다양한 농도의 어성초 물추출물을 배지에 담아 각 well에 처리한 후 CO2배양기에서 24시간 동안 배양하고, 세포배양 상층액 100 ㎕을 채취하여 Griess reagent 100 ㎕을 혼합한 뒤 15분 동안 반응시킨 다음 microplate reader를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였는데, NO 생성량은 다음 공식으로 계산되었다.
어성초 물추출물이 RAW 264.7의 H2O2 생성에 미치는 영향에 대해 알아보기 위하여 Jirapongsananuruk 등16)의 방법을 응용, DHR 123 assay를 실시하여 측정하였는데, 96 well plate에 1×104 cells/well의 농도로 분주되도록 1×105 cells/mL의 cell을 100 ㎕씩 넣은 후 CO2 배양기에서 24시간 동안 배양한 뒤 배지를 버리고, 배양세포 표면을 PBS 용액으로 씻어주었다.
어성초 물추출물이 RAW 264.7의의 Cytokine 생성에 미치는 영향에 대해 알아보기 위하여 Politch 등17)의 방법을 응용하였는데, 96 well plate에 1×105 cells/mL의 cell을 100 ㎕씩 넣은 후 CO2 배양기에서 24 시간 동안 배양한 뒤 배지를 버리고, 배양세포 표면을 PBS 용액으로 씻어준 다음 각 well에 어성초 물추출물을 배지에 담아 처리하고, 24시간 동안 배양하였다.
어성초(Houttuynia cordata THUNB, Saururaceae)를 물추출하여 제조한 시료 HW를 대상으로 마우스 대식세포 RAW 264.7을 이용하여 NO, H2O2, IL-1β, IL-6, TNF-α 등의 면역염증매개인자 생성에 미치는 영향을 측정, 비교하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
본 실험에 사용된 기기는 filter paper(Advantec No.2, Japan), centrifuge(Hanil, Korea), CO2 incubator(NUAIRE, USA), rotary vacuum evaporator(Eyela, Japan), 75 cm2 flask(Falcon, USA), air compressor(Tamiya, Japan), homogenizer(O-mni, USA), research microscope(Olympus, Japan), fume hood(Hanil, Korea), clean bench(Jeio thec, Korea), ultrasonic cleaner(Branson, USA), deep freezer(Ilshin Lab Co, Korea), microplate reader(Bio-Rad, USA), thermo aluminum bath(Fine PCR, USA), vortex mixer(Vision Scientific Co, Korea), water bath(In-Tron biotech., Korea), ice-maker(Vision Scientific Co, Korea), Bio-Plex 200(Bio-Rad, USA) 및 spectrofluorometer(Dynex, UK) 등이다.
본 실험을 위해서 ethyl alcohol(Samchun Chemical, Korea), DMSO(Sigma, USA), DMEM(Sigma, USA), 1×PBS(Sigma, USA), EDTA(Sigma, USA), isopropanol (Sigma, USA), trypsin-EDTA(Sigma, USA), Griess reagent(Sigma, USA), dihydrorhodamine 123(Sigma, USA), Bio-Plex cytokineassay kit(Bio-Rad, USA) 및 Procarta kit(Panomics, USA) 등이 사용되었다.
실험에 사용된 魚腥草는 ㈜ 옴니허브(대구, 한국)로부터 2010년 5월에 구입하였고, 사용 전에 초음파 세척기(Branson, USA)를 이용하여 불순물을 제거한 후 실험에 사용하였다.
실험에 사용된 대식세포는 mouse macrophage RAW 264.7 cells로 한국 세포주 은행(KCLB, Korea)에서 구입하였다.
데이터처리
본 실험에서 얻은 결과는 평균치 ± 표준편차(mean ± SD)로 나타내었고, 대조군과 각 실험군과 평균의 차이는 Student's t-test와 ANOVA test로 분석하여 p-value값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
성능/효과
1. 어성초 물추출물은 마우스 대식세포의 NO 생성을 25, 50, 100 및 200 ㎍/mL등 각각의 농도에서 유의하게 증가시켰다.
2. 어성초 물추출물은 마우스 대식세포의 H2O2 생성을 25, 50, 100 및 200 ㎍/mL등 각각의 농도에서 유의하게 증가시켰다.
5. 어성초 물추출물은 마우스 대식세포의 TNF-α 생성을 50, 100 및 200 ㎍/mL등 각각의 농도에서 유의하게 증가시켰다.
NO는 일종의 세포신호전달물질로 NOS(nitric oxide synthase)에 의해 체내에서 생산되어 병원체의 증식억제나 사멸작용이 있으며35-36), H2O2는 일종의 활성산소로서 macrophage의 다양한 병원체를 공격하는데 중요한 역할을 담당하는데32,37-38), 본 실험에서 어성초 물추출물을 마우스 macrophage RAW 264.7 cell에 24시간의 배양한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 NO와 H2O2의 생성이 유의하게 증가하였다.
macrophage가 활성화되면 그 결과 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 등의 생산이 증가되는데, 본 실험에서 어성초 물추출물을 마우스 macrophage RAW 264.7 cell에 24시간의 배양한 결과 IL-1β 와 IL-6의 생성을 100과 200 ㎍/mL의 농도에서 유의하게 증가하였고, TNF-α의 생성은 50, 100 및 200 ㎍/mL 등의 모든 농도에서 유의하게 증가하였다.
어성초 물추출물을 24시간 처리한 후 RAW 264.7의 IL-1β 생성에 미치는 영향을 조사한 결과 100와 200 ㎍/mL의 농도에서 유의한 증가가 나타났다(Table 3, Fig. 3).
어성초 물추출물을 24시간 처리한 후 RAW 264.7의 IL-6 생성에 미치는 영향을 조사한 결과 100과 200 ㎍/mL의 농도에서 유의한 증가가 나타났다(Table 4, Fig. 4).
어성초 물추출물을 24시간 처리한 후 RAW 264.7의 NO 생성에 미치는 영향을 비교한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 유의한 증가가 나타났다(Table 1, Fig. 1).
어성초 물추출물을 24시간 처리한 후 RAW 264.7의 TNF-α 생성에 미치는 영향을 조사한 결과 50 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 유의한 증가가 나타났다(Table 5, Fig. 5).
어성초 물추출물을 24시간 처리한 후 RAW 264.7의 H2O2 생성에 미치는 영향을 비교한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 유의한 증가가 나타났다(Table 2, Fig. 2).
후속연구
이상의 결과 어성초 물추출물이 macrophage의 NO, H2O2, IL-1β, IL-6 및 TNF-α 등의 면역매개인자의 생성을 촉진함으로써 면역활성을 증진시키는 효능이 있음을 알 수 있었고, 이 등15)의 발효 어성초에 대한 연구를 참고하여 추후염증 자극 후 어성초 물추출물이 농도에 따른 효과를 비롯한 추후 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
魚腥草란?
魚腥草는 삼백초과(Saururaceae)에 속하는 약모밀(Houttuynia cordata THUNB)의 全草로 性味가 微寒辛하고, 淸熱解毒, 消癰排膿 및 利尿通淋 등의 효능이 있어 肺癰吐膿, 痰熱喘咳, 熱痢淋, 帶下, 産後發熱 및 癰腫瘡毒 등의 질환에 사용되며1,12), 항염효과, 항종양효과 및 면역증진 효과 등의 연구가 보고되었다13-15).
魚腥草는 어떤 효능이 있는가?
魚腥草는 삼백초과(Saururaceae)에 속하는 약모밀(Houttuynia cordata THUNB)의 全草로 性味가 微寒辛하고, 淸熱解毒, 消癰排膿 및 利尿通淋 등의 효능이 있어 肺癰吐膿, 痰熱喘咳, 熱痢淋, 帶下, 産後發熱 및 癰腫瘡毒 등의 질환에 사용되며1,12), 항염효과, 항종양효과 및 면역증진 효과 등의 연구가 보고되었다13-15).
어성초(Houttuynia cordata THUNB, Saururaceae)를 물추출하여 제조한 시료 HW를 대상으로 마우스 대식세포 RAW 264.7을 이용하여 NO, H2O2, IL-1β, IL-6, TNF-α 등의 면역염증매개인자 생성에 미치는 영향을 측정, 비교하여 얻은 결론은?
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