상황버섯(Phellinus linteus) 균사체로부터 항보체 활성 다당류의 정제 및 특성 Purification and Characterization of Anti-complementary Polysaccharide from Phellinus linteus Mycelia원문보기
식용버섯으로부터 항보체 활성물질을 탐색하여 새로운 소재화 연구의 일환으로 상황버섯(Phellinus linteus) 균사체로부터 항보체 활성 물질을 분리, 정제를 하였으며 화학적 특성을 검토하였다. 정제는 상황버섯의 열수추출한 후, 열수추출물(PL-0)를 한외여과하여 분자량별로 5개의 획분을 얻었다. 이 중, 300kDa 이상의 획분(PL-5)을 DEAE-Sepharose FF이온교환 크로마토그래피, Sepharose CL-4B 겔여과 크로마토그래피를 실시하여 PL-5-IIIa 획분을 얻었다. PL-5-IIIa 획분을 HPLC를 행한 결과 단일 피크로 나타났으며 정제다당 PL-5-IIIa의 분자량은 800,000Da으로 측정되었다. 정제다당 PL-5IIIa는 64.2%의 당과 29.6%의 단백질로 구성되었으며 구성당은 galactose가 43.1%, mannose가 40.6%, fucose가 15.8%로 나타났다.
식용버섯으로부터 항보체 활성물질을 탐색하여 새로운 소재화 연구의 일환으로 상황버섯(Phellinus linteus) 균사체로부터 항보체 활성 물질을 분리, 정제를 하였으며 화학적 특성을 검토하였다. 정제는 상황버섯의 열수추출한 후, 열수추출물(PL-0)를 한외여과하여 분자량별로 5개의 획분을 얻었다. 이 중, 300kDa 이상의 획분(PL-5)을 DEAE-Sepharose FF 이온교환 크로마토그래피, Sepharose CL-4B 겔여과 크로마토그래피를 실시하여 PL-5-IIIa 획분을 얻었다. PL-5-IIIa 획분을 HPLC를 행한 결과 단일 피크로 나타났으며 정제다당 PL-5-IIIa의 분자량은 800,000Da으로 측정되었다. 정제다당 PL-5IIIa는 64.2%의 당과 29.6%의 단백질로 구성되었으며 구성당은 galactose가 43.1%, mannose가 40.6%, fucose가 15.8%로 나타났다.
We have isolated an anti-complementary polysaccharide from the hot water extracts of Phellinus linteus mycelia. Anti-complementary polysaccharide, PL-5-IIIa, was purified by ultrafiltration, gel permeation chromatography using Sepharose CL-4B. GPC (Sepharose CL-4B) and its homogenicity was demonstra...
We have isolated an anti-complementary polysaccharide from the hot water extracts of Phellinus linteus mycelia. Anti-complementary polysaccharide, PL-5-IIIa, was purified by ultrafiltration, gel permeation chromatography using Sepharose CL-4B. GPC (Sepharose CL-4B) and its homogenicity was demonstrated by HPLC. Using gel permeation chromatography with standard dextrans, its molecular weight was determined as about 800,000 dalton. The purified PL-5-IIIa was identified as a protein bound polysaccharide comprising of 29.6% protein and 64.2% carbohydrate which was composed of fucose(15.8%), galactose(43.1%) and mannose(40.6%).
We have isolated an anti-complementary polysaccharide from the hot water extracts of Phellinus linteus mycelia. Anti-complementary polysaccharide, PL-5-IIIa, was purified by ultrafiltration, gel permeation chromatography using Sepharose CL-4B. GPC (Sepharose CL-4B) and its homogenicity was demonstrated by HPLC. Using gel permeation chromatography with standard dextrans, its molecular weight was determined as about 800,000 dalton. The purified PL-5-IIIa was identified as a protein bound polysaccharide comprising of 29.6% protein and 64.2% carbohydrate which was composed of fucose(15.8%), galactose(43.1%) and mannose(40.6%).
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문제 정의
이에 본 연구에서는 보관균주와 임업협동조합에서 분양받은 버섯 균사체 중, 우수한 활성을 나타낸 상황버섯 (Phellinus linteus) 균사체로부터 항보체 활성 물질을 분리, 정제를 하였으며 화학적 특성을 검토하였다.
최근에는 항암활성과 더불어 다양한 생체조절기능 성분이 보고되고 있는 식용버섯으로부터 항보체 활성물질을 탐색하여 새로운 소재화 연구의 일환으로 버섯균사체 추출물들의 항보체 활성을 검색하였다.
제안 방법
5%의 가장 높은 항보체 활성을 나타냈다(data not shown). PL-5-III 은 분자량이 300 kDa 이상의 고분자 물질이므로 분획 가능한 분자량 범위를 가진 Sepharose CL-4B를 이용하여 PL-5-IIIa와 PL-5-IIIb의 2개의 획분으로 분리하였다(Fig. 3). 이 중 단백질이 함유되지 않은 PL-5-IIIa에서 항보체 활성이 97%로 높았으며 이 획분을 Sepharose CL-4B에 재획분한 결과 좌우가 대칭인 단일 피크로 확인되었다(Fig.
Sepharose CL-4B column에 의해서 단일 peak로 분리된 PL-5-IIIa 획분의 순도를 확인하기 위하여 HPLC (SAMSUNG SLC-2000/RI/Shodex ionpack S-804)를 1 ml/min의 유속으로 실시하였으며 정제다당의 분자량은 Dextran T-2000(M.W. 2 × 106), T-500(M.W. 5 × 105), T-70 (M.W. 7 × 104), T-10(M.W. 1 × 104) 그리고 glucose를 표준물질로 사용하여 Sepharose CL-4B(2.6 × 94 cm)에서 구한 표준곡선과 Kav값을 비교하여 측정하였다.
상황버섯 균사체 550 g을 분쇄하여 95∼97℃에서 4시간 동안 열수추출한 후 Fig. 1과 같은 단계로 분리와 정제를 실시하였다.
상황버섯 균사체 열수 추출물인 PL-0을 한외여과를 이용하여 분자량에 따라 PL-1, -2, -3, -4, -5의 5개 분획으로 분획하였다(Fig. 2). 이들 획분을 1,000 mg/ml의 농도에서 항보체 활성을 측정한 결과, 분자량이 증가할수록 활성이 증가하다가 300 kDa 이상 획분(PL-5)에서 현저하게 증가되었다.
식용버섯으로부터 항보체 활성물질을 탐색하여 새로운 소재화 연구의 일환으로 상황버섯(Phellinus linteus) 균사체로부터 항보체 활성 물질을 분리, 정제를 하였으며 화학적 특성을 검토하였다. 정제는 상황버섯의 열수추출한 후, 열수추출물(PL-0)를 한외여과하여 분자량별로 5개의 획분을 얻었다.
06%의 수율을 보였다. 이의 조건으로 상황버섯(P. linteus) 균사체 550 g을 열수에서 4시간동안 환류추출하였으며 추출액을 중화, 투석 및 동결건조하여 추출획분 PL-0(3 g)을 얻었다(Fig. 1).
식용버섯으로부터 항보체 활성물질을 탐색하여 새로운 소재화 연구의 일환으로 상황버섯(Phellinus linteus) 균사체로부터 항보체 활성 물질을 분리, 정제를 하였으며 화학적 특성을 검토하였다. 정제는 상황버섯의 열수추출한 후, 열수추출물(PL-0)를 한외여과하여 분자량별로 5개의 획분을 얻었다. 이 중, 300kDa 이상의 획분(PL-5)을 DEAE-Sepharose FF 이온교환 크로마토그래피, Sepharose CL-4B 겔여과 크로마토그래피를 실시하여 PL-5-IIIa 획분을 얻었다.
항보체 활성의 최적 배양조건을 검토하기 위한 배지는 PDB를 기본배지로 사용하였으며 200 ml를 500 ml baffle flask에 넣고 초기 pH 7.0, 30℃, 120 rpm에서 7일간 배양하였다. Fermentor((주) 이노바이오, 금산군, 충남) 배양은 5 L 배양조에 working volume을 2L로 하여 상기와 동일한 환경조건에서 배양하였다.
대상 데이터
접종원 배양을 위한 배지는 PDA (potato dextrose agar, Difco, Sparks, MD)를 사용하였으며 배양접시 중심부에 버섯균주를 접종하여 30℃, 7일간 배양한 후, 콜크보오러 (지름 8 mm)로 배지상의 균사를 punching하여 제조된 disk 5개를 접종원으로 사용하였다.
이론/모형
총당 함량은 glucose를 표준물질로 하여 phenol-sulfuric acid법(Lin and Pomeranz, 1968)으로 uronic acid 함량은 galacturonic acid를 표준물질로 사용하여 m-hydroxydiphenyl 방법으로 하였으며 단백질은 bovine serum albumin을 표준물질로 하여 Lowry 법(Lowry et al., 1951)으로 측정하였다.
항보체 활성은 Mayer의 방법(1961)에 따라 측정하였다. 정상인의 혈청 (NHS, normal human serum)과 2% gelatin, 3mM Ca++, 10 mM Mg++가 함유된 GVB++(gelatin veronal buffered saline, pH 7.
성능/효과
이 중, 300kDa 이상의 획분(PL-5)을 DEAE-Sepharose FF 이온교환 크로마토그래피, Sepharose CL-4B 겔여과 크로마토그래피를 실시하여 PL-5-IIIa 획분을 얻었다. PL-5-IIIa 획분을 HPLC를 행한 결과 단일 피크로 나타났으며 정제다당 PL-5-IIIa의 분자량은 800,000Da으로 측정되었다. 정제다당 PL-5IIIa는 64.
PL-5-IIIa 획분을 겔여과 컬럼을 사용한 HPLC를 행한 결과 단일 피크로 나타나 거의 순수하게 정제되었음을 확인하였으며(Fig. 5) Sepharose CL-4B column을 이용하여 분자량을 표준 dextran과 비교한 결과 분자량은 약 800,000Da 정도를 나타내었다(Fig. 6). Chihara et al.
상황버섯 균사체로부터 최종 정제된 항보체 활성 정제다당(PL-5-IIIa)의 수율은 47.6%였으며 항보체 활성은 500 mg/ml에서 98%로 높게 나타났다(Table 2). PL-5-IIIa는 단백질 함량이 29.
3). 이 중 단백질이 함유되지 않은 PL-5-IIIa에서 항보체 활성이 97%로 높았으며 이 획분을 Sepharose CL-4B에 재획분한 결과 좌우가 대칭인 단일 피크로 확인되었다(Fig. 4).
2). 이들 획분을 1,000 mg/ml의 농도에서 항보체 활성을 측정한 결과, 분자량이 증가할수록 활성이 증가하다가 300 kDa 이상 획분(PL-5)에서 현저하게 증가되었다. 이는 항보체 활성 물질이 고분자 물질임을 알 수 있으며 각 획분에서 대부분의 저분자 물질이 제거된 것으로 나타났다.
PL-5-IIIa 획분을 HPLC를 행한 결과 단일 피크로 나타났으며 정제다당 PL-5-IIIa의 분자량은 800,000Da으로 측정되었다. 정제다당 PL-5IIIa는 64.2%의 당과 29.6%의 단백질로 구성되었으며 구성당은 galactose가 43.1%, mannose가 40.6%, fucose가 15.8%로 나타났다.
추출물의 항보체 활성과 수율은 열수 > 냉수 > 1N NaOH > 0.1N HCl의 순으로 열수 추출에서 높게 나타났으며 일반적으로 산, 알칼리 추출물이 물추출물보다 낮게 나타났다.
이는 항보체 활성 물질이 고분자 물질임을 알 수 있으며 각 획분에서 대부분의 저분자 물질이 제거된 것으로 나타났다. 한외여과에서 가장 높은 활성을 나타낸 PL-5 획분을 음이온 교환수지인 DEAE-Sepharose FF를 이용하여 이온강도에 따라 PL-5-I, II, III, IV, V의 5개의 분획을 얻었으며 그 중, PL-5-III가 84.5%의 가장 높은 항보체 활성을 나타냈다(data not shown). PL-5-III 은 분자량이 300 kDa 이상의 고분자 물질이므로 분획 가능한 분자량 범위를 가진 Sepharose CL-4B를 이용하여 PL-5-IIIa와 PL-5-IIIb의 2개의 획분으로 분리하였다(Fig.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
자연계에 존재하는 천연물질 중에서 인체에 대해 각종 생리활성을 나타내는 다당류들을 분리할 수 있는 것들은?
현재 자연계에 존재하는 천연물질 중에서 인체에 대해 각종 생리활성을 나타내는 다당류들이 버섯(Chang and Miles, 1989), 한약재(Yamada et al., 1988), 고등식물 (Yamada et al., 1988), 곰팡이(Gao et al., 1989) 등의 다양한 기원으로부터 분리되고 있어 이에 대한 관심이 증가하고 있다. 그 예로서 표고버섯(Lentinus edodes), 자실체에서 분리한 β-1,3-glucan인 lentinan(Chihara et al.
보체계의 활성화는 일으키는 경로 2가지는 무엇인가요?
이 중에서 항보체 활성은 보체계를 활성화시키거나 억제시키는 작용에 기인하는 것으로 알려져있다(Egwang and Befus, 1984). 보체계의 활성화는 고전적 경로(classical pathway)와 선택적 경로(alternative pathway)의 연속적인 메카니즘에 의해 일어난다. 고전적 경로는 IgG와 IgM을 포함한 면역 복합체나 이들의 응집물에 의해 C1부터 활성화가 시작되어 C3b 활성형을 생성하는 경로이며 항체의 관여없이도 여러 종류의 polyanions, 일부 다당류 등이 고전적 경로를 활성화시킬 수 있는 인자로 알려져 있다.
여러 버섯의 균사 배양액에서 추출한 β-1,3 1,4 및 β-1,4 1,6-glucan을 함유 하는 단백다당인 krestin등의 효능은?
, 1980) 등이 항암 효과를 나타내어 면역증강제로 시판되거나 사용이 검토되고 있다. 이들은 항종양 활성(Ohno et al., 1985), 항바이러스 활성(Song et al., 1995), 항보체 활성(Yoshioka et al, 1972), 항응고 활성(Lee et al., 1997), 혈당 강하작용 (Shimizu et al., 1989) 등의 효과가 보고되었으며 이들은 주로 인체 면역기능의 활성화와 밀접한 관계가 있는 것으로 추정되고 있다. 이 중에서 항보체 활성은 보체계를 활성화시키거나 억제시키는 작용에 기인하는 것으로 알려져있다(Egwang and Befus, 1984).
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