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문제 정의
- 따라서 효율적인 당뇨병 관리를 위해서는 활성산소를 제거할 수 있는 항산화활성 물질의 섭취가 중요하다. 따라서 본 연구에서는 SWE의 항산화활성(peroxyl radical 소거능)을 측정하였다. 그 결과, Fig.
- 이상의 결과로 SWE는 탄수화물의 분해에 관여하는 소장내 각종 α-glucosidases를 적절히 저해하여 혈당 상승을 억제할 수 있으며, 동시에 라디칼 소거활성이 우수하여 장기복용 시 산화적 스트레스로 인해 발생되는 활성산소에 의한 당뇨합병증의 조절에 도움이 될 것으로 기대된다. 이러한 in vitro에서의 당질분해효소저해 활성 및 항산화 활성을 검증하기 위하여 다음과 같이 동물실험을 수행하였다.
제안 방법
- 50 ul의 5 mM pNPG solution을 가한 다음 37℃에서 30분간 반응시키고, 405 nm에서 ELISA reader를 사용하여 흡광도를 측정하여 rat α-glcucosidase 저해활성을 분석하였다.
- 사육실의 점등 및 소등 시간은 12시간을 기준으로 실시하였다. 5주령의 SD rat을 5마리씩 1군으로 정하고, 총 40마리 8군으로 나누어 각 군에 sucrose 2 g/㎏-body weight과 각 군별로 control (증류수), acarbose(5 mg/kg-body weight), SWE(0.1, 0.5 g/kg-body weight), 액상 상태로 경구투여를 하였다. 경구 투여양은 10 ml/㎏-body weight로 하였다.
- ORACROO․ assay에는 40 nM fluorescein과 5 mM 2,2'-azobis[2-amidinopropane] dihydrochloride(AAPH)을 사용하여 fluorescence plate reader(Tecan, Salzburg, Austria)로 excitation wavelength 485 ㎚, emission wavelength 535 nm에서 형광을 측정하였다.
- 동물 실험조건은 온도 22℃, 습도 50%를 유지하였고, 사육공간(SPF zone)의 모든 공기는 헤파필터를 통한 공기를 사용하였다. Rat의 식이(오리엔트바이오 Pico 5053)는 하루에 20～25 g으로 체중 증가에 따라 늘려서 제공하였고, 깔짚(오리엔트바이오 Corncob 1/4)은 이틀에 한 번씩 교체하여 주었다. 사육실의 점등 및 소등 시간은 12시간을 기준으로 실시하였다.
- 각각의 시험관에 50 ul의 100 mM maltose, 50 ul의 200 mM sucrose, 1% starch solution을 가한 다음 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 각각의 반응액 50 ul를 glucose oxidase/peroxidase reagent와 o-dianisidine reagent를 섞은 용액 1 ml를 함유한 시험관에 넣어 37℃에서 10분 동안 2차 반응시킨 후, 각각의 시험관에 12 N 황산을 1 ml 첨가하여 반응을 정지시키고, 540 nm에서 ELISA reader를 사용하여 흡광도를 측정하여 저해활성 분석하였다.
- 따라서 in vitro 활성 평가를 통해 α-glucosidase 억제활성을 확인한 상황 추출물의 동물모델에서의 활성 여부를 평가하기 위해 Sprague-Dawley(SD) rat을 이용하여 SWE와 양성대조 약물인 Acarbose®의 식후 혈당 감소 효과를 측정하였고, 이러한 결과는 Fig. 7과 같았다.
- 따라서 본 연구에서는 먼저 상황버섯 추출물(Sangwhang mushroom water extract, SWE)의 혈당 상승에 관여하는 α-glucosidases인 maltase, sucrase, glucoamylase에 대한 저해활성을 조사하였다.
- 따라서, 본 연구에서는 상황버섯의 항산화, 항당뇨 효과를 규명하기 위해 상황버섯을 열수 추출하여 DPPH, ORAC 시험법을 통하여 항산화를 측정하였고, α-glucosidase inhibition, maltase, sucrase, glucoamylase inhibition 시험과 in vivo 실험을 통하여 당질분해효소활성 저해효과 및 식후 혈당 강하 효능을 조사하였다.
- 전자 공여능(electron donating ability, EDA) 측정은 Liangli 등(2002)의 방법에 준하여 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH)에 대한 수소공여 효과로 측정하였다. 일정농도의 시료와 양성대조군으로 ascorbic acid(Sigma, USA), butylated hydroxyanisole(BHA), butylated hydroxytoluene(BHT)를 사용하여 96-well plate에 각각 160 ul를 넣고 0.15 mM DPPH 40 ul를 첨가하여 균일하게 혼합한 다음 실온의 암실에서 30분간 방치한 후, Multi-detection microplate로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도를 측정할 때 Well에 분주되는 각 시료에 의한 흡광도의 차이는 ethanol만의 흡광도를 측정하여 보정해 주었고, 이때 전자 공여능은 시료 첨가구와 비첨가구의 흡광도 차이를 백분율(%)로 구하였다.
- 혈당 측정 0시간의 경우 경구투여 전 측정을 이행하였고, 30분, 1시간, 2시간으로 측정하였다. 측정 시 rat의 꼬리 끝을 멸균된 메스를 이용하여 절개 후 약 0.5 ul의 혈액을 혈당 스트립에 흡수시켜 혈당측정기(Caresens Ⅱ㈜아이센스)를 사용하여 측정하였다.
- 한국식품의약품안전청에서 제시한 건강기능식품의 기능성 시험가이드에 제시된 방법을 변형하여 α-glcucosidase(EC 3.2.1.20) 저해활성을 측정하였다.
- 한국식품의약품안전청에서 제시한 건강기능식품의 기능성 시험가이드에 제시된 방법을 변형하여 maltase, sucrase, glucoamylase의 저해 활성을 분석하였다. 효소는 rat 유래의 intestinal acetone powder를 사용하였고, 기질은 maltose, sucrose, starch를 사용하였다.
- 24시간 절식 시 수분의 공급은 자유롭게 하였다. 혈당 측정 0시간의 경우 경구투여 전 측정을 이행하였고, 30분, 1시간, 2시간으로 측정하였다. 측정 시 rat의 꼬리 끝을 멸균된 메스를 이용하여 절개 후 약 0.
- 경구 투여양은 10 ml/㎏-body weight로 하였다. 혈당 측정은 24시간 절식 후 측정하였다. 24시간 절식 시 수분의 공급은 자유롭게 하였다.
- 15 mM DPPH 40 ul를 첨가하여 균일하게 혼합한 다음 실온의 암실에서 30분간 방치한 후, Multi-detection microplate로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도를 측정할 때 Well에 분주되는 각 시료에 의한 흡광도의 차이는 ethanol만의 흡광도를 측정하여 보정해 주었고, 이때 전자 공여능은 시료 첨가구와 비첨가구의 흡광도 차이를 백분율(%)로 구하였다.
대상 데이터
- 기질은 p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(pNPG)를 사용하였다.
- 동물 실험조건은 온도 22℃, 습도 50%를 유지하였고, 사육공간(SPF zone)의 모든 공기는 헤파필터를 통한 공기를 사용하였다. Rat의 식이(오리엔트바이오 Pico 5053)는 하루에 20～25 g으로 체중 증가에 따라 늘려서 제공하였고, 깔짚(오리엔트바이오 Corncob 1/4)은 이틀에 한 번씩 교체하여 주었다.
- 9% NaCl 용액에 첨가한 후 30초간 12회 ice water bath에서 sonication하고, 10,000×g, 4℃에서 30분간 원심 분리하였다. 분리된 상층액을 실험에 사용하였다. 100 ul의 rat α-glucosidase solution에 50 ul의 시료를 넣은 다음 37℃에서 10분간 pre-incubation시켰다.
- 상황버섯 시료는 국내산 상황버섯(Phellinus linteusau)으로 ㈜한국생약(대전광역시)에서 구입하였다. 시료를 분쇄한 gram 당 10 ㎖의 정제수를 넣고 혼합한 후, 121℃에서 15분간 열을 가하였다.
- 20) 저해활성을 측정하였다. 효소는 rat 유래의 intestinal acetone powder(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo., USA)를 사용하였고. 기질은 p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(pNPG)를 사용하였다.
- 한국식품의약품안전청에서 제시한 건강기능식품의 기능성 시험가이드에 제시된 방법을 변형하여 maltase, sucrase, glucoamylase의 저해 활성을 분석하였다. 효소는 rat 유래의 intestinal acetone powder를 사용하였고, 기질은 maltose, sucrose, starch를 사용하였다. Rat intestinal acetone powder 100 mg을 3 ml의 0.
데이터처리
- *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001 compared to different samples at the same concentration by unpaired Student’s t-test.
- SAS(Statistical Analysis system)에 의한 Duncan의 다범위 검정(Duncan's multiple range test)을 통하여 p<0.05에서 각 시료간의 유의적인 차이를 검증하였다.
이론/모형
- ORAC assay는 식품이나 음료의 Total antioxidant capacity를 양적으로 측정하여 항산화 활성을 평가하기 위한 도구로 널리 활용되는 방법으로 free radical에 의해 유도되는 손상으로부터 시료에 의한 보호 능력을 측정한다. ORAC법을 이용한 항산화 활성 측정은 peroxyl radical scavenging capacity(ORACROO․) assay를 사용하였다. ORACROO․ assay에는 40 nM fluorescein과 5 mM 2,2'-azobis[2-amidinopropane] dihydrochloride(AAPH)을 사용하여 fluorescence plate reader(Tecan, Salzburg, Austria)로 excitation wavelength 485 ㎚, emission wavelength 535 nm에서 형광을 측정하였다.
- 전자 공여능(electron donating ability, EDA) 측정은 Liangli 등(2002)의 방법에 준하여 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH)에 대한 수소공여 효과로 측정하였다. 일정농도의 시료와 양성대조군으로 ascorbic acid(Sigma, USA), butylated hydroxyanisole(BHA), butylated hydroxytoluene(BHT)를 사용하여 96-well plate에 각각 160 ul를 넣고 0.
성능/효과
- Fig. 1～4 결과에서 보듯이 SWE는 농도의존적으로 α-glucosidase, maltase, sucrase, glucoamylase를 저해하는 것을 알 수 있었다.
- SWE을 sucrose와 혼합하여 경구 투여 후 0.5～2 hrs 동안 혈당을 측정한 결과, 식후 30 분에 대조군(170.0±5.3) 대비 0.1 g/kg-body weight(159.8±12.2), 0.5 g/kg-body weight(150.5±5.1 mg/dl)에서 농도의존적으로 식후 혈당 상승을 억제하는 것으로 나타났다.
- 그 결과, Fig. 6에서와 같이 SWE의 1, 5 그리고 10 μg/ml 농도에서 농도 의존적으로 peroxyl radical 소거 활성이 증가되는 것을 알 수 있었다.
- 또한 상황버섯에 대한 항산화 효능을 알아보기 위해 DPPH 라디칼 소거능, peroxyl radical 소거능을 측정한 결과, 농도의존적으로 라디칼이 소거됨을 알 수 있었다. 이상의 결과로 SWE는 당뇨병의 고혈당으로 인한 산화적 스트레스에 의해 유발되는 당뇨합병증에 대한 경감효과를 줄 수 있을 것으로 사료된다.
- 또한 상황버섯에 대한 항산화 효능을 알아보기 위해 DPPH 라디칼 소거능, peroxyl radical 소거능을 측정한 결과, 농도의존적으로 라디칼이 소거됨을 알 수 있었다. 이상의 결과로 SWE는 당뇨병의 고혈당으로 인한 산화적 스트레스에 의해 유발되는 당뇨합병증에 대한 경감효과를 줄 수 있을 것으로 사료된다. 따라서 향후 상황버섯 추출물에 대한 분리정제를 통한 고순도 활성물질의 확보, 약동력학적 연구 및 임상시험을 통하여 당뇨병의 치료 및 당뇨합병증 완화에 도움이 될 소재의 개발가능성이 높을 것으로 사료된다.
- 이탄당 외에 polysaccharide에 대한 혈당 상승 억제효능을 알아보기 위하여 glucoamylase 저해활성을 측정 결과, 5 mg/ml 의 농도에서 96±0.8%의 높은 저해활성을 나타내어 polysaccharide에 대한 혈당 상승 억제 효과도 있을 것으로 기대된다.
- 전자 공여능(electron donating ability, EDA)을 측정하는 DPPH 실험 결과, Fig. 5에서와 같이 SWE의 농도 의존적으로 DPPH radical 소거활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었고, 5 μg/ml의 농도에서 Trolox 대비 20.2±1.5배의 높은 라디칼 소거 활성을 나타냈다.
- 탄수화물을 주식으로 하는 우리나라 식생활의 패턴으로 보았을 때 SWE의 경우 맥아당을 분해하는 maltase, 자당을 분해하는 sucrase에 대한 저해활성이 농도 의존적으로 저해하여 식후에 분해된 이탄당에 의한 혈당 상승을 억제할 것으로 보여진다. 특히 이탄당 중 sucrose에 대한 in vivo 실험을 수행한 결과, 0.5 g/kg-body weight 농도에서 식후 30분에 효과적으로 혈당 상승을 억제하였다. 이탄당 외에 polysaccharide에 대한 혈당 상승 억제효능을 알아보기 위하여 glucoamylase 저해활성을 측정 결과, 5 mg/ml 의 농도에서 96±0.
후속연구
- 이상의 결과로 SWE는 당뇨병의 고혈당으로 인한 산화적 스트레스에 의해 유발되는 당뇨합병증에 대한 경감효과를 줄 수 있을 것으로 사료된다. 따라서 향후 상황버섯 추출물에 대한 분리정제를 통한 고순도 활성물질의 확보, 약동력학적 연구 및 임상시험을 통하여 당뇨병의 치료 및 당뇨합병증 완화에 도움이 될 소재의 개발가능성이 높을 것으로 사료된다.
- 8%의 높은 저해활성을 나타내어 polysaccharide에 대한 혈당 상승 억제 효과도 있을 것으로 기대된다. 이러한 혈당 상승 억제 활성은 양성대조군인 약물과 비교하였을 때는 다소 낮은 활성을 지닌 것으로 보이나, 상황버섯은 다양한 당류를 자실체 및 균사체에 함유하고 있어서 상황버섯을 열수추출하는 과정에서 버섯 내의 각종 당류가 함께 추출되어 당질분해효소활성을 억제하는 활성물질과 함께 함유되어 혈당 상승 억제를 다소 경감시킨 것을 감안한다면 향후 활성물질의 분리정제를 통한 순도를 개선함으로써 활성을 증강시킬 수 있을 것으로 사료된다.
- 이상의 결과로 SWE는 탄수화물의 분해에 관여하는 소장내 각종 α-glucosidases를 적절히 저해하여 혈당 상승을 억제할 수 있으며, 동시에 라디칼 소거활성이 우수하여 장기복용 시 산화적 스트레스로 인해 발생되는 활성산소에 의한 당뇨합병증의 조절에 도움이 될 것으로 기대된다.
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