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문제 정의
- 본 연구는 RAW 264.7 murine macrophage 세포주를 사용 하여 NF-κB 및 MAPKs 신호전달을 통한 RG의 항염 조절 기전을 밝히기 위해 수행되었다(Fig. 9).
- 본 연구에서는 홍삼이 LPS로 자극된 RAW 264.7 대식세포의 NO와 PGE2의 생성량, iNOS, COX-2의 발현 및 TNF-α에 미치는 영향을 살펴보고, 이러한 염증매개물질의 발현에 핵심적인 역할을 담당하는 NF-κB와 MAPKs의 변화를 확인하여 홍삼의 염증 억제효과를 조사하였다.
- 홍삼추출물의 항염증효과는 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포의 염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향으로 조사하였다. 본실험은 LPS로 유도된 RAW 264.
제안 방법
- 96 well plate에 상기 배양액 100 μL와 Griess reagent (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% α-naphthyl amide in H20) 150 μL를 혼합하여 실온에서 5 분간 반응시킨 후 540 ㎚에서 ELISA microplate reader로흡광도를 측정하였다.
- Immunoblot analysis를 이용하여 RG가 세포질 내 iNOS와 COX-2 단백질발현에 미치는 영향을 살펴보았다. RG 전처리가 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현을 억제하였으며 그 결과로 발생 하는 NO 및 PGE2의 생성 또한 감소시켰다는 것을 확인하였다.
- RAW 264.7 세포에 LPS 를 처리하였을 때 유리된 PGE2 생성량과 홍삼 추출물 처리구의 PGE 2 생성량을 비교하였다. RG 농도별 (0.
- RAW 264.7 세포에 LPS를 처리하여 유리된 NO 생성량과 홍삼추출물을 농도별로 처리한 실험구의 NO 생성량을 비교 하였다(Fig. 2). 홍삼 농도별 (10, 1 및 0.
- RAW 264.7 세포에 LPS를 처리한 다음, MTT assay 로 세포생존율을 측정하여 홍삼 농도별(0.1, 1, 10 및 100 μg/mL) 세포독성을 비교 하였다(Fig. 1).
- RAW 264.7 세포에 각각의 시료를 처리한 다음 세포의 증식률과 NO, PGE2 및TNF-α의 생성량, COX-2, iNOS, NF-κB, IκBα, phospho-IκBα protein 및 MAPKs (ERK, JNK, p38)의 발현에 미치는 영향을 조사하였다.
- RG를 농도별 (1, 5, 10, 50μg/mL)로 1시간 동안 처리하고 LPS (1 μg/mL)를 첨가 하여 6시간 배양하였다.
- 96 well plate에 상기 배양액 100 μL와 Griess reagent (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% α-naphthyl amide in H20) 150 μL를 혼합하여 실온에서 5 분간 반응시킨 후 540 ㎚에서 ELISA microplate reader로흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite (NaNO2)를 이용한 표준곡 선으로 NO의 농도를 산출하였다.
- 항 COX-2, iNOS, NF-κB, IκBα, p-IκBα, p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-p38, p38, 그리고 actin 항체는 1:1000으로 희석하여 4℃ 에서 12 시간 반응 후 TBS-T로 세척하고 horseradish peroxidase가 conjugation된 2차 항체로 1 시간 반응시켰다. TBS-T로 30 분간 세척 한 후, ECL kit (Amersham, GE healthcare, UK)를 사용하여 FluorChemImaging System (Cell Biosciences, USA)으로detection 하였다.
- 7의 생존율과 증식을 저해하지 않는 RG 농도를 조사한 결과, 10 μg/mL 이하에서는 정상세포와 유의한 차이를 보이지 않았다. 따라서 상기 농도 범위 내의 RG를 사용하여 항염증효과를 조사하였다. RAW 264.
- 배양액을 수집하여 원심분리 (10,000x g, 3 분)하여 확보한 상등액을 TNF-α 및 PGE2 ELISA Kits (Pierce Endogen, IL, USA)를 이용하여 정량하였다.
- 7 세포의 염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향으로 조사하였다. 본실험은 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에 홍삼 추출물을 농도별로 처리한 다음 사이토카인의 농도를 측정하였다(Fig. 5). 실험 결과는 LPS에 의해 유도된 TNF-α의 생성량은 홍삼 추출물에의해 농도 의존적으로 감소함을 나타낸다.
- 상등액을 제거하고 DMSO 150 μL 를 첨가하여 생성된 formazan crystals을 용해시킨 후 ELISA microplate reader (TECAN, Switzerland)를 이용하여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 구하였다.
- 상등액을 제거한 침전물에 20 mM HEPES (pH 7.9), 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 1 mM PMSF를 함유한 high-salt buffer 50 μL를 넣어 10 분마다 vortex하며 40 분간 얼음위에 방치한 다음, 16,000x g로 10 분간 원심분리하여 핵 분획이 포함된 상등액을 실험에 이용하였다.
- 7 세포는ATCC (Rockville, MD, USA)로부터 구입했으며, DMEM에 10% FBS, 100 U/mL penicillin 및 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 2일마다 계대 배양하였다
- 세포질 내 NF-κB의 활성 억제효과가 I-κBα의 인산화 억제와 관련이 있는가를 인산화상태를 인식하는 특이항체를 이용하여 조사하였다(Fig. 7).
- 추출물 여과는 5 μm 의 막공 크기를 갖는 filter paper (ADVANTEC, 110 mm)를 이용하여 감압 여과하였다.
- 항 COX-2, iNOS, NF-κB, IκBα, p-IκBα, p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-p38, p38, 그리고 actin 항체는 1:1000으로 희석하여 4℃ 에서 12 시간 반응 후 TBS-T로 세척하고 horseradish peroxidase가 conjugation된 2차 항체로 1 시간 반응시켰다.
- 홍삼은 홍삼근과 홍삼미를 (주)동경종합상사로부터 구입하였으며, 각 1:1 비율로 혼합한 홍삼 200 g (홍삼근 100 g, 홍삼미 100 g)을 분쇄한 다음 70% 에탄올 500 mL를 가하고 70∼80℃에서 한 시간씩 3회 환류추출을 실시하였다.
- 홍삼의 NO와 PGE 2 생성 억제효과가 iNOS와 COX-2의 발현조절과 관련이 있는지를 조사하기 위하여 western blot 분석을수행하였다. Fig.
대상 데이터
- Anti-NF-κB p65, anti-COX-2, anti-IκBα, 그리고 anti-phospho-IκBα monoclonal antibody와 p-ERK mouse monoclonal antibody, ERK rabbit polyclonal antibody, Lamin A/C goat polyclonal antibody, 그리고 peroxidase-conjugated secondary antibody는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)부터 구입하였다.
- Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)은 Hyclone (Bremen, Germany)에서 구입하였고, fetal bovine serum (FBS)은 Sigma Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)로부터, penicillin 및 streptomycin은 Gibco/BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입 하였다.
- (Santa Cruz, CA, USA)부터 구입하였다. p-P38 Rabbit antibody, p-SAPK/JNK rabbit antibody는 cell signaling Technology (Beverly, MA, USA)사에서 구입하였으며, JNK/SAPK mouse antibody는 BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA)로부터 구입하였다. 3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), sulfanilamide, lipopolysaccharide (LPS) 시약들은 Sigma Aldrich Co.
- 실험에 사용한 마우스 대식세포주 RAW 264.7 세포는ATCC (Rockville, MD, USA)로부터 구입했으며, DMEM에 10% FBS, 100 U/mL penicillin 및 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다.
데이터처리
- 각 실험결과를 mean±S.D.으로 표기하였고, 통계학적 분석은 SPSS program (SPSS version 14.0)의 ANOVA 분석과 independent t-test를 수행하여 p값이 0.05이하인 경우를 통계학적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
성능/효과
- LPS로 NF-κB의 억제인자인 I-κBα의 phosphorylation을 유도한 다음 홍삼을 시간별로 처리한 결과는 IκBα의 인산화가 유의성 있게 억제됨을 보여준다(p<0.01 (15 분), p<0.001 (30 분, 60 분)).
- LPS로 자극한 RAW 264.7 cell에서 홍삼 추출물이 ERK1/2, JNK, p38의 인산화에 미치는 영향을 살펴본 결과, LPS 처리 군에서는 대조군에 비해 30 분까지는 증가하다가 60 분에서는 감소 하는 경향이 보였다(Fig. 8). 다른 신호 매개분자인 p-ERK/ERK와 p-p38/p38의 분석(15, 30 분)에서는 LPS+홍삼 추출물 처리군이 LPS 처리군에 비해 p38 인산화가 유의성 있게 감소하는 결과를 나타내었으며 (p<0.
- LPS처리 군에서 IκBα 발현이 15 분에서는 감소하다가 30 분이 지나면서 회복하는 경향이 나타났으며, 홍삼 추출물 전처리 군에서도 유사한 경향을 보였다.
- Immunoblot analysis를 이용하여 RG가 세포질 내 iNOS와 COX-2 단백질발현에 미치는 영향을 살펴보았다. RG 전처리가 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현을 억제하였으며 그 결과로 발생 하는 NO 및 PGE2의 생성 또한 감소시켰다는 것을 확인하였다. 이 결과는 대식세포에 LPS를 사용하여 iNOS 및 COX-2 발현을 유도한 후, RG를 50 μg/mL으로 처리하여 iNOS 및 COX-2 발현에 대한 억제 정도를 조사한 Hyun23) 등의 보고와 일치하였다.
- RG 추출물이 NF-κB 경로를 통하여 염증반응을 조절하는 지를 조사한 결과, RG는 IκBα의인산화를 저해하여 NF-κB 활성을 차단함으로써 iNOS와 COX-2 발현을 억제함을 알 수 있었다.
- 결론적으로, RG가 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 NF-κB 및 MAPKs (ERK1/2, JNK, p38)의 신호전달경로를 억제 하며, 염증반응을 촉발하는 염증매개인자들 (NO, PGE 2, TNF-α) 의 생성을 효과적으로 제어한다는 것을 알 수 있었다.
- 다른 신호 매개분자인 p-ERK/ERK와 p-p38/p38의 분석(15, 30 분)에서는 LPS+홍삼 추출물 처리군이 LPS 처리군에 비해 p38 인산화가 유의성 있게 감소하는 결과를 나타내었으며 (p<0.001), p-JNK/JNK의 분석도 동일한 결과를 나타내었다(p<0.05).
- 본 연구 결과는 RG가 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포에서 TNF-α의 생성을 감소시킴을 보여준다.
- 본 연구에서 대식세포인 RAW 264.7의 생존율과 증식을 저해하지 않는 RG 농도를 조사한 결과, 10 μg/mL 이하에서는 정상세포와 유의한 차이를 보이지 않았다.
- JNK 신호전달 경로는 LPS와 TNF-α와 같은 면역염증자극에 반응하는 세포에서 활성화 되고, 세포의 형태적 증대와 사이토카인 전사에 관여한다31) . 본연구에서 RG가 MAPKs 신호전달경로에 미치는 영향을 조사한 결과, RAW 264.7 세포에서 RG가 LPS로 유도된 ERK, JNK와 p38의 인산화를 억제하는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 현상은 RG가 LPS로 유도된 상기 인자들의 활성화와 관련된 MAPKs 신호전달경로의 억제를 통해 항염증 작용을 발휘하는 것으로 보인다(Fig.
- 세포질 내 IκBα의 phosphorylation을유도한 후, RG를 시간별로 처리하여 인산화 저해 정도를 조사한 결과, 10 μg/mL의 RG 농도에서 시간 의존적으로 phospho-I κBα의 발현정도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 6).
- 실험 결과 홍삼 추출물 농도가 10 μ g/mL 까지는 생존율 저하가 나타나지 않았으나, 100 μg/mL에서는 급격한 세포생존율 저하가 관찰되었다.
- 실험 결과는 LPS에 의해 유도된 TNF-α의 생성량은 홍삼 추출물에의해 농도 의존적으로 감소함을 나타낸다.
- 001).전반적으로 COX-2와 iNOS 발현이 RG 농도 의존적으로 감소하는 현상을 관찰할 수 있었으며, 이 결과는 NO와 PGE2 생성에 대한 홍삼 추출물의 억제효과와 일치하였다.
- 특히, 15 분 구간에서 LPS+ 홍삼 추출물 처리군에서 LPS 처리군과 비교하여 IκBα의 인산화가 유의성 있게 증가하는 결과가 나타났다(p<0.01).
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