[논문]아가로오스 분해세균인 Pseudoalteromonas sp. GNUM08122 분리 및 동정

김유나; 정연규; 김무찬; 김성배; 장용근; 지원재; 홍순광; 김창준

doi:10.4014/kjmb.1112.12002

[국내논문] 아가로오스 분해세균인 Pseudoalteromonas sp. GNUM08122 분리 및 동정
Isolation and Identification of Agarose-degrading Bacterium, Pseudoalteromonas sp. GNUM08122 원문보기

한국미생물·생명공학회지 = Korean journal of microbiology and biotechnology, v.40 no.1, 2012년, pp.1 - 9

김유나 (경상대학교 생명화학공학과 및 그린에너지융합연구소) , 정연규 (경상대학교 해양환경공학과 및 해양산업 연구소) , 김무찬 (경상대학교 해양환경공학과 및 해양산업 연구소) , 김성배 (경상대학교 생명화학공학과 및 그린에너지융합연구소) , 장용근 (한국과학기술원 생명화학공학과) , 지원재 (명지대학교 생명과학정보학부) , 홍순광 (명지대학교 생명과학정보학부) , 김창준 (경상대학교 생명화학공학과 및 그린에너지융합연구소)

초록
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본 연구는 홍조류를 기질로 사용한 바이오에탄올 생산 공정에서 전처리(홍조류 가수분해) 공정의 효율을 높이기 위하여 성능이 우수한 신규 아가레이즈를 발굴하는 데 있다. 남해안에 서식하는 해조류를 채집하여 이로부터 아가레이즈 활성을 갖는 3종의 균주들을 순수 분리 하였다. 이들 균주들을 4일간 배양한 후, 황산암모늄 침전과 투석에 의하여 배양액으로부터 조효소를 회수하였다. 세포외 분비 효소를 포함하는 배양 상등액으로부터 얻은 조효소와 세포 내 효소를 포함하는 세포 추출물에서 얻은 조효소 모두에서 아가레이즈 활성이 측정되었고, 동일 균주에서 세포외 분비 단백질이 세포내 축적 단백질보다 높은 활성을 나타내었다. 3종의균주 중 GNUM08122 조효소가 단위 단백질 당 아가레이즈 활성은 낮았으나, p-nitrophenyl-${\alpha}$-D-galactopyranoside의 ${\alpha}$-결합을 끊는 것으로 관찰되어 ${\alpha}$-agarase 활성이 있을 것으로 추측되어 균주 동정을 실시하였다. GNUM08122 균주의 16S rRNA 염기서열을 결정하고 계통수 분석을 수행한 결과 Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549 및Pseudoalteromonas tetraodonis IMA 14160 균주와 99.7%이상 상동성을 보였는데, 이는 GNUM08122가 Pseudoalteromonas속 균주임을 나타낸다. 균주의 생화학적 생리적 특성을 조사하였다. GNUM08122는 $40^{\circ}C$, 산성 조건(pH 4)는 물론 약 알칼리(pH 8)에서도 활발히 성장하였다. 높은NaCl(10%, w/w)에서도 세포생장이 저해를 받지 않았고 다양한 탄수화물을 사용하는 것으로 확인되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study's aim was to isolate microorganisms producing agarase with a high activity, with possible applications in improving the performance of the pretreatment processes for bioethanol production. Marine algaes were collected from the south coast of Korea, from which three kinds of microorganisms were isolated. After a 4-day culture of these strains at $25^{\circ}C$, crude enzymes were obtained from culture supernatant or cell-free extract by ammonium sulfate precipitation and membrane dialysis. Agarase activity was observed in these crude enzymes. Notably higher specific activity was observed in the crude enzyme obtained from the culture supernatant rather than that from the cell-free extract. This indicates that a secreted enzyme has a much greater activity than a cellular enzyme. Crude enzymes from the GNUM08122 strain were inferred to have ${\alpha}$-agarase activity because release of p-nitrophenol was observed, possibly due to the cleavage of p-nitrophenyl-${\alpha}$-D-galactopyranoside. The 16S rRNA sequence of GNUM08122 showed a close relationship to Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549 (99.8%) and Pseudoalteromonas tetraodonis IMA 14160 (99.7%), which led us to assign it to the genus Pseudoalteromonas. Biochemical and physiological study revealed that this strain can grow well at $40^{\circ}C$ under a wide range of pH (pH 4~8) in high-salt conditions (10% NaCl).

Keyword

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구의 목적은 성능이 우수한 신규 아가레이즈를 발굴하는 데 있다. 본 연구팀은 남해안에서 해조류를 채취하여 이로부터 아가레이즈 활성이 높은 미생물들을 순수 분리하였고, 이들이 생산하는 단백질을 회수하여 아가레이즈 활성을 비교하였다.
본 연구에서는 상업적으로 구입 가능한 p-nitrophenyl- D-galactopyranoside를 기질로 사용하여 효소 반응을 수행함으로써 선별균주가 생산하는 아가레이즈가 α-형 또는β-형인지를 대략적으로 알아보고자 하였다.
본 연구는 홍조류를 기질로 사용한 바이오에탄올 생산 공정에서 전처리(홍조류 가수분해) 공정의 효율을 높이기 위하여 성능이 우수한 신규 아가레이즈를 발굴하는 데 있다. 남해안에 서식하는 해조류를 채집하여 이로부터 아가레이즈 활성을 갖는 3종의 균주들을 순수 분리 하였다.

제안 방법

최종적으로 선별된 균주를 동정하고 균주의 생화학적·생리학적 특징을 조사하였다.
9,800×g 에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 이에 존재하는 환원당 농도를 측정하였다.
함몰된 부위를 백금이로 살짝 긁어 멸균해수 10 mL가 함유된 30 mL 멸균 시험관에 희석시키고 잘 혼합한 후, 이 희석액의 10 μL를 ASW 한천 평판배지에 도말한 후 28oC에서 2주간 배양하면서 순수분리를 하였다.
본 연구의 목적은 성능이 우수한 신규 아가레이즈를 발굴하는 데 있다. 본 연구팀은 남해안에서 해조류를 채취하여 이로부터 아가레이즈 활성이 높은 미생물들을 순수 분리하였고, 이들이 생산하는 단백질을 회수하여 아가레이즈 활성을 비교하였다. 최종적으로 선별된 균주를 동정하고 균주의 생화학적·생리학적 특징을 조사하였다.
2) 약 10 mL를 첨가하여 단백질 펠릿을 용해시키고 이를 투석하여 세포 내 단백질 조효소 액을 얻었다. 조효소를 회수하기 위한 일련의 실험을 4^oC에서 수행하였다.
9,800×g 에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 이에 존재하는 환원당 농도를 측정하였다. 또한 동일한 조건에서 가열 처리하여 비활성화시킨 조효소를 첨가하여 반응시킨 용액(blank) 중의 환원당 농도를 측정하였다. 두 값의 차이는 조효소에 의해 한천이 분해되어 생성된 환원당의 양이고 이를 이용하여 조효소의 활성을 계산하였다.
또한 동일한 조건에서 가열 처리하여 비활성화시킨 조효소를 첨가하여 반응시킨 용액(blank) 중의 환원당 농도를 측정하였다. 두 값의 차이는 조효소에 의해 한천이 분해되어 생성된 환원당의 양이고 이를 이용하여 조효소의 활성을 계산하였다. 효소활성(Unit/mL)은 효소 반응조건에서 조효소 부피(mL) 당 한천이 분해하여 분당 1 μmole의 환원당(갈락토오즈)를 생성하는 것을 나타낸다.
균주를 ASW-YP 한천 평판배지에 골고루 도말한 후, thiostreptone(50 μg), kanamycin(50 μg), neomycin(30 μg), ampicillin(50 μg), aparamycin(50 μg), chloramphenicol(25 μg) 및 nalidixic acid(25 μg)를 각각 주입한 paper disc를 올려놓고 28oC에서 24시간 배양하여 disc 주변에 형성되는 환의 크기를 측정하였다.
역상칼럼인 Spherisorb 5μm ODS2 (250 mm × 4.6 mm, Waters Co., Ltd., USA)를 장착한 HPLC 시스템(Younglin SP930D, Korea)에 1.0 mL/min으로 이동상(메탄올:아이소프로필 에테르 = 4:1)을 흘려주며 분리되어 나온 퀴논을 UV 검출기(Younglin UV730D, Korea)의 254 nm에서 검출하였다.
여과액을 감압증류기하여 얻은 cake 형태의 농축액에 100 μL 용매(클로로포름:메탄올 = 8.5:1.5)를 첨가하여 녹여낸 후, 14,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 얻은 상등액의 HPLC 분석을 수행하였다.
이를 주형(template)으로 하고 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (forward)와 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' (backward)를 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하여 16S rRNA 단편을 증폭하였다.
여기에 7 mL의 증류수를 첨가하여 반응액을 희석시키고 9,800×g에서 10분 간 원심분리 후 상등액을 채취하고 UV-Visible spectrophotometer(Hwelett-Packard, Palo Alto, CA, USA)를 이용 하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. D-갈락토오즈를 이용하여 표준적정곡선을 작성하였다.
16S rRNA 염기서열의 계통수 분석

분리세균의 계통수(phylogenetic tree)를 작성하기 위하여(주)제노텍(대전, 한국)에서 16S rRNA 염기 서열을 분석하였다. ASW-YP 액체 배지에서 2일간 배양하여 회수된 GNUM08122 균체로부터 genomic DNA를 추출하였다.
분리세균의 계통수(phylogenetic tree)를 작성하기 위하여(주)제노텍(대전, 한국)에서 16S rRNA 염기 서열을 분석하였다. ASW-YP 액체 배지에서 2일간 배양하여 회수된 GNUM08122 균체로부터 genomic DNA를 추출하였다. 이를 주형(template)으로 하고 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (forward)와 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' (backward)를 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하여 16S rRNA 단편을 증폭하였다.
분리 균주의 계통수는 PHYLIP 프로그램[4]을 사용한 neighborjoining법[29]과 Kimura’s 2-parameter 모델[15]을 사용하여 작성되었다. 계통수의 안정성 검사를 위해 1,000번의 bootstrap resampling을 시행하였다.
Gram 반응 여부를 알아보기 위하여 Gram 염색과 KOH 시험을 실시하였다. ASW-YP 한천 평판배지에 균주를 접종하고 28^oC에서 2일간 배양한 후, 투과전자 현미경(transmission electron microscope)를 이용하여 균주의 형태적 특징(morphology)를 관찰하였다.
Gram 반응 여부를 알아보기 위하여 Gram 염색과 KOH 시험을 실시하였다. ASW-YP 한천 평판배지에 균주를 접종하고 28^oC에서 2일간 배양한 후, 투과전자 현미경(transmission electron microscope)를 이용하여 균주의 형태적 특징(morphology)를 관찰하였다. ASW-YP 한천 평판배지에 pH(pH 4~9)와 NaCl 농도(0~15%)를 달리하고, 28^oC에서 3일 간 배양한 후 균주 생장에 미치는 이들의 영향을 관찰하였다.
ASW-YP 한천 평판배지에 균주를 접종하고 28^oC에서 2일간 배양한 후, 투과전자 현미경(transmission electron microscope)를 이용하여 균주의 형태적 특징(morphology)를 관찰하였다. ASW-YP 한천 평판배지에 pH(pH 4~9)와 NaCl 농도(0~15%)를 달리하고, 28^oC에서 3일 간 배양한 후 균주 생장에 미치는 이들의 영향을 관찰하였다. 또한 배양온도(4^oC~40^oC)의 영향도 조사하였다.
ASW-YP 한천 평판배지에 pH(pH 4~9)와 NaCl 농도(0~15%)를 달리하고, 28^oC에서 3일 간 배양한 후 균주 생장에 미치는 이들의 영향을 관찰하였다. 또한 배양온도(4^oC~40^oC)의 영향도 조사하였다. API kit(API Staph, bioMerieux, France)을 이용하여 GNUM08122 균주가 사용하는 탄수화물, 생산하는 효소 및 활성 등을 조사하였다.
또한 배양온도(4^oC~40^oC)의 영향도 조사하였다. API kit(API Staph, bioMerieux, France)을 이용하여 GNUM08122 균주가 사용하는 탄수화물, 생산하는 효소 및 활성 등을 조사하였다. 분리균주의 세포 내 퀴논 분석을 수행하였다.
API kit(API Staph, bioMerieux, France)을 이용하여 GNUM08122 균주가 사용하는 탄수화물, 생산하는 효소 및 활성 등을 조사하였다. 분리균주의 세포 내 퀴논 분석을 수행하였다. 10개의 고체배지에서 48시간 배양한 균주를 회수하여 동결건조 하고 이를 추출용매(클로로포름:메탄올 = 2:1)에 넣어 약 4시간 교반 후 여과(Whatman No.
칼럼의 온도는 40^oC로 유지하였다[17]. 48시간 고체배양에 의해 얻은 40 mg의 균주에서 지방산을 추출하여 지방산 분석을 수행하였다. 균체의 지방산은 Miller와 Berger[23]의 방법에 준하여 methyl ester화 시켰으며, 전 처리된 fatty acid methyl esters(FAME) mixture의 분석은 Microbial Identification System(MIDI)의 지침에 따라 gas cheromatography(Agilent Technology 6890 GC)로 수행되었다[30].
GNUM08122 균주에 대한 항생제 감수성 검사(antibiotic susceptibility)를 실시하였다. 균주를 ASW-YP 한천 평판배지에 골고루 도말한 후, thiostreptone(50 μg), kanamycin(50 μg), neomycin(30 μg), ampicillin(50 μg), aparamycin(50 μg), chloramphenicol(25 μg) 및 nalidixic acid(25 μg)를 각각 주입한 paper disc를 올려놓고 28^oC에서 24시간 배양하여 disc 주변에 형성되는 환의 크기를 측정하였다.
GNUM08121과 GNUM08122는 갈조류인 톱니 모자반(Sargassum serratifolium)에서 분리하였고 GNUM08123은 홍조류인 주름 붉은 잎(Callophyllis crispata)에서 분리하였다. 이들 세균들이 생산하는 아가레이즈를 생산하기 위하여 액체배양을 수행하였다.
3 g/L의 한천이 첨가된 ASW-YP 액체배지에서 순수 분리된 3종의 균주들을 배양하며 매 24시간마다 배양 상등액 중의 단백질 농도를 측정하였고 이를 Fig. 1에 나타내었다. 선별 균주들이 생산하는 단백질 양은 배양 시간에 따라 증가하였고 3일째 최대 값에 도달한 후 일정하게 유지되었다.
즉, 배양 3일째에 균주들이 생산하는 단백질 량은 GNUM08122가 57 mg/L였고, GNUM08121과 GNUM08123은 약 19 mg/L 였다. 본 결과를 바탕으로 배양 4일 후, 배양액을 부분 정제하여 조효소를 회수하였다.
선별 균주 배양액을 부분 정제하여 얻은 단백질(조효소)의 아가레이즈 활성을 비교하였다. 아가레이즈 활성을 갖는 단백질이 세포 밖으로 분비 혹은 세포 내부에 축적되는지의 여부를 조사하기 위하여 세포 외로 분비된 단백질을 포함하는 배양 상등액과 세포 내 단백질을 포함하는 세포 추출물을 부분 정제하여 회수한 조효소의 아가레이즈 활성을 측정하였다.
선별 균주 배양액을 부분 정제하여 얻은 단백질(조효소)의 아가레이즈 활성을 비교하였다. 아가레이즈 활성을 갖는 단백질이 세포 밖으로 분비 혹은 세포 내부에 축적되는지의 여부를 조사하기 위하여 세포 외로 분비된 단백질을 포함하는 배양 상등액과 세포 내 단백질을 포함하는 세포 추출물을 부분 정제하여 회수한 조효소의 아가레이즈 활성을 측정하였다. Table 1은 배양 상등액에서 얻은 조효소의 아가레이즈 활성을 나타낸다.
조효소의 단백질 함량과 아가레이즈 활성은 GNUM08122와 GNUM08123이 각각 제일 높게 관찰되었는데, 이는 단백질 단위 질량 당 아가레이즈 활성(비활성, specific activity)는 GMUM08123이 제일 높고 GNUM08122가 제일 낮음을 나타낸다. 세포 추출물에서 얻은 조효소 활성을 비교하였다(Table 2). 조효소의 비활성은 GNUM08121가 가장 높고 GNUM08123이 가장 낮았다.
상기에서 선정된 GNUM08122 균주의 16S rRNA 서열을 결정하고 이를 바탕으로 계통수 분석을 실시하였다(Fig. 2). 분석된 염기서열은 총 1436 bp였고, NCBI 탐색 결과 Pseudoalteromonas 속 균주들과 높은 상동성을 보였다.
GNUM08122의 생화학적·생리학적 특성을 분석하고 그 결과를 GNUM08122와 계통적으로 매우 유사한 P. issachenkonii KMM 3549[12]와 P. tetraodonis IAM 14160[11]의 보고된 값과 비교하였다.
또한 β-glucosidase, gelatinase, β- galactosidase 활성을 나타내었고 포도당, 마니톨, 엿당을 탄소원으로 이용하는 것을 관찰하였다.
균주의 생화학적·생리적 특성을 조사하였다.
3종의 균주 중 GNUM08122 조효소가 단위 단백질 당 아가레이즈 활성은 낮았으나, p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside의 α-결합을 끊는 것으로 관찰되어 α-agarase 활성이 있을 것으로 추측되어 균주 동정을 실시하였다.
GNUM08122의 세포 외부 형태를 주사전자현미경으로 관찰하였다. Fig.
본 연구는 홍조류를 기질로 사용한 바이오에탄올 생산 공정에서 전처리(홍조류 가수분해) 공정의 효율을 높이기 위하여 성능이 우수한 신규 아가레이즈를 발굴하는 데 있다. 남해안에 서식하는 해조류를 채집하여 이로부터 아가레이즈 활성을 갖는 3종의 균주들을 순수 분리 하였다. 이들 균주들을 4일간 배양한 후, 황산암모늄 침전과 투석에 의하여 배양액으로부터 조효소를 회수하였다.
남해안에 서식하는 해조류를 채집하여 이로부터 아가레이즈 활성을 갖는 3종의 균주들을 순수 분리 하였다. 이들 균주들을 4일간 배양한 후, 황산암모늄 침전과 투석에 의하여 배양액으로부터 조효소를 회수하였다. 세포외 분비 효소를 포함하는 배양 상등액으로부터 얻은 조효소와 세포 내 효소를 포함하는 세포 추출물에서 얻은 조효소 모두에서 아가레이즈 활성이 측정되었고, 동일 균주에서 세포외 분비 단백질이 세포내 축적 단백질보다 높은 활성을 나타내었다.

대상 데이터

경남 마산 진동만에서 다양한 해조류를 채집하여 멸균 해수로 부드럽게 세척한 후 500 mL 멸균채수병에 넣고 실험실로 운반하였다. 이 채수병에 멸균 해수 250 mL를 첨가하여 상하로 강하게 흔들고, 이 해수의 10 μL를 ASW 한천 평판배지(MgSO₄ 12.
순수 분리된 3종의 균주를 액체 배양하였다. 3 g/L의 한천이 첨가된 ASW-YP 액체 배지(25 mL)를 포함하는 250 mL의 배플(baffle) 플라스크에 분리균을 접종한 후 진탕배양기(Jeiotech.
그런데 이들 후보군 들은 혼합 균주 형태가 많아서 몇 단계의 반복적인 분리 과정을 통하여 이들 혼합 균주 군으로부터 아가레이즈 활성이 높은 순수 균주들을 얻었다. 순수 분리된 많은 균주들 중에서 한천 평판배지의 표면이 많이 함몰되어 활성이 높은 아가레이즈를 분비할 것으로 기대되는 3종을 선정하였다. Table 1에 아가레이즈 활성이 높은 3종의 순수 분리 균주들과 이 균주들을 얻은 해조류를 나타내었다.

데이터처리

org/)에서 수행되었다[2]. Clustal W 프로그램을 사용하여 확보된 염기서열들 간의 다중서열 정렬(multiple sequence alignment) 검색을 수행하였다. 분리 균주의 계통수는 PHYLIP 프로그램[4]을 사용한 neighborjoining법[29]과 Kimura’s 2-parameter 모델[15]을 사용하여 작성되었다.

이론/모형

Somogy-Nelson법[32]을 사용하여 반응액 중의 환원당을 정량하였다. 조효소 반응 상등액 1 mL에 1 mL의 alkalinecopper tartrate 시약(anhydrous Na₂SO₄ 180 g, KNaC₄H₄O₆⋅₄H₂O 12 g, Na₂CO₃ 24 g, NaHCO₃ 16 g, CuSO₄ 4 g per 1 L)을 첨가하여 끊은 물에서 10분간 반응시키면 환원당이 구리를 환원시킨다.
분리 균주의 계통수는 PHYLIP 프로그램[4]을 사용한 neighborjoining법[29]과 Kimura’s 2-parameter 모델[15]을 사용하여 작성되었다.
이를 주형(template)으로 하고 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (forward)와 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' (backward)를 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하여 16S rRNA 단편을 증폭하였다. 결정된 염기서열의 상동성 검사는 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에서 제공하는 BlastN program을 사용하여 수행되었고, 표준균주(type strain)들과의 유사성(similarity) 조사 및 관련된 분류군의 16S rRNA 유전자 염기서열의 확보는 ExTaxon server(http://www.eztaxon.org/)에서 수행되었다[2]. Clustal W 프로그램을 사용하여 확보된 염기서열들 간의 다중서열 정렬(multiple sequence alignment) 검색을 수행하였다.
48시간 고체배양에 의해 얻은 40 mg의 균주에서 지방산을 추출하여 지방산 분석을 수행하였다. 균체의 지방산은 Miller와 Berger[23]의 방법에 준하여 methyl ester화 시켰으며, 전 처리된 fatty acid methyl esters(FAME) mixture의 분석은 Microbial Identification System(MIDI)의 지침에 따라 gas cheromatography(Agilent Technology 6890 GC)로 수행되었다[30]. DNA의 GC 함량은 역상 HPLC를 이용한 Mesbah 등[21]의 방법에 따라서 분석하였다.
균체의 지방산은 Miller와 Berger[23]의 방법에 준하여 methyl ester화 시켰으며, 전 처리된 fatty acid methyl esters(FAME) mixture의 분석은 Microbial Identification System(MIDI)의 지침에 따라 gas cheromatography(Agilent Technology 6890 GC)로 수행되었다[30]. DNA의 GC 함량은 역상 HPLC를 이용한 Mesbah 등[21]의 방법에 따라서 분석하였다.
2. A phylogenetic tree of strain GNUM08122 constructed from the nucleotide sequence of 16S rRNA gene using the neighbourjoining method. The scale bar indicates a genetic distance of 0.

성능/효과

1에 나타내었다. 선별 균주들이 생산하는 단백질 양은 배양 시간에 따라 증가하였고 3일째 최대 값에 도달한 후 일정하게 유지되었다. GNUM08122가 다른 두 균주들에 비하여 월등히 많은 양의 단백질을 생산하는 것이 관찰되었다.
선별 균주들이 생산하는 단백질 양은 배양 시간에 따라 증가하였고 3일째 최대 값에 도달한 후 일정하게 유지되었다. GNUM08122가 다른 두 균주들에 비하여 월등히 많은 양의 단백질을 생산하는 것이 관찰되었다. 즉, 배양 3일째에 균주들이 생산하는 단백질 량은 GNUM08122가 57 mg/L였고, GNUM08121과 GNUM08123은 약 19 mg/L 였다.
GNUM08122가 다른 두 균주들에 비하여 월등히 많은 양의 단백질을 생산하는 것이 관찰되었다. 즉, 배양 3일째에 균주들이 생산하는 단백질 량은 GNUM08122가 57 mg/L였고, GNUM08121과 GNUM08123은 약 19 mg/L 였다. 본 결과를 바탕으로 배양 4일 후, 배양액을 부분 정제하여 조효소를 회수하였다.
언급하였듯이, 단백질 농도는 조효소 부피 당 존재하는 단백질의 함량을 나타내고, 활성은 조효소 부피 당 아가레이즈 활성을 나타낸다. 조효소의 단백질 함량과 아가레이즈 활성은 GNUM08122와 GNUM08123이 각각 제일 높게 관찰되었는데, 이는 단백질 단위 질량 당 아가레이즈 활성(비활성, specific activity)는 GMUM08123이 제일 높고 GNUM08122가 제일 낮음을 나타낸다. 세포 추출물에서 얻은 조효소 활성을 비교하였다(Table 2).
세포 추출물에서 얻은 조효소 활성을 비교하였다(Table 2). 조효소의 비활성은 GNUM08121가 가장 높고 GNUM08123이 가장 낮았다. 한편, 동일 균주에서 배양 상등액에서 얻은 조효소의 비활성값이 세포 추출물(cell-free extract)에서 얻은 조효소의 비활성 값보다 높았는데, 이는 세포 외 분비 단백질이 세포 내 단백질보다 비활성 값이 높음을 의미한다.
한편, 동일 균주에서 배양 상등액에서 얻은 조효소의 비활성값이 세포 추출물(cell-free extract)에서 얻은 조효소의 비활성 값보다 높았는데, 이는 세포 외 분비 단백질이 세포 내 단백질보다 비활성 값이 높음을 의미한다. 즉, 세포 외 분비 단백질의 비활성 값은 세포 내 단백질에 비하여 GNUM08121과 GNUM08122에서는 약 1.8배 높았고, GNUM08123에서는 12배 높았다. 이와 같은 결과는 생산되는 아가레이즈가 세포 내에 축적되기보다 세포 외로 더 많이 분비되는 것을 의미한다.
주목할만한 사실로 GNUM08122 조효소와 p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside의 반응에서 반응액이 노란색으로 변하는 것이 관찰되었는데, 이는 α-결합이 절단되는 것으로 판단되었다.
따라서 선별 균주 조효소가 p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside의 α-결합을 절단할 수 있다면 α-형의 아가레이즈를 함유할 것이고 p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside의 β-결합을 절단할 수 있다면 β-형의 아가레이즈를 함유할 것으로 여겨진다.
2). 분석된 염기서열은 총 1436 bp였고, NCBI 탐색 결과 Pseudoalteromonas 속 균주들과 높은 상동성을 보였다. 특히, Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549와 Pseudoalteromonas tetraodonis IAM 14160가 가장 높은 상동성(99.
분석된 염기서열은 총 1436 bp였고, NCBI 탐색 결과 Pseudoalteromonas 속 균주들과 높은 상동성을 보였다. 특히, Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549와 Pseudoalteromonas tetraodonis IAM 14160가 가장 높은 상동성(99.7% 이상)을 나타내었다. 이는 GNUM08122가 Pseudoalteromonas 속 균주라는 것을 명확히 보여주는 결과이다.
또한 β-glucosidase, gelatinase, β- galactosidase 활성을 나타내었고 포도당, 마니톨, 엿당을 탄소원으로 이용하는 것을 관찰하였다. 또한 4^oC에서는 생장하지 못한 반면, 40^oC에서 활발히 생장하였고 산성조건(pH 4)에서도 활발히 생장하는 것이 관찰되었다. 배지 중의 NaCl 농도를 10%(w/v)까지 증가시킴에도 생장저해를 받지 않아고 농도의 염에 저항성이 있음을 보였다.
유전자 분석 및 생화학·생리학 특성분석을 통하여 분리 균주인 GNUM08122가 Pseudoalteromonas 속으로 판명되었다.
또한 4^oC에서는 생장하지 못한 반면, 40^oC에서 활발히 생장하였고 산성조건(pH 4)에서도 활발히 생장하는 것이 관찰되었다. 배지 중의 NaCl 농도를 10%(w/v)까지 증가시킴에도 생장저해를 받지 않아고 농도의 염에 저항성이 있음을 보였다. 그러나 NaCl 농도를 15%로 증가 시 균주의 생장이 관찰되지 않았다.
또한 저온(4^oC)에서는 활발히 생장하지만 40^oC에서는 생장하지 않는 것으로 알려졌다. 항생제 감수성 테스트에서, GNUM-08122는 ampicillin에 높은 감수성을 나타낸 반면, 테스트된 다른 항생제에는 비교적 높은 약제 내성을 나타내었다.
음이온 교환 크로마토 그래피를 이용하여 선별된 GNUM08122 균주 배양액으로부터 아가레이즈를 분리하였다 [14]. 비록 데이터로 제시하지 않았지만, 분리된 효소의 SDS-PAGE 및 zymography를 실시한 결과, 본 연구팀이 발굴한 아가레이즈는 43kDa 정도일 것으로 추측되었다.
이들 균주들을 4일간 배양한 후, 황산암모늄 침전과 투석에 의하여 배양액으로부터 조효소를 회수하였다. 세포외 분비 효소를 포함하는 배양 상등액으로부터 얻은 조효소와 세포 내 효소를 포함하는 세포 추출물에서 얻은 조효소 모두에서 아가레이즈 활성이 측정되었고, 동일 균주에서 세포외 분비 단백질이 세포내 축적 단백질보다 높은 활성을 나타내었다. 3종의 균주 중 GNUM08122 조효소가 단위 단백질 당 아가레이즈 활성은 낮았으나, p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside의 α-결합을 끊는 것으로 관찰되어 α-agarase 활성이 있을 것으로 추측되어 균주 동정을 실시하였다.
3종의 균주 중 GNUM08122 조효소가 단위 단백질 당 아가레이즈 활성은 낮았으나, p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside의 α-결합을 끊는 것으로 관찰되어 α-agarase 활성이 있을 것으로 추측되어 균주 동정을 실시하였다. GNUM08122 균주의 16S rRNA 염기서열을 결정하고 계통수 분석을 수행한 결과 Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549 및 Pseudoalteromonas tetraodonis IMA 14160 균주와 99.7%이상 상동성을 보였는데, 이는 GNUM08122가 Pseudoalteromonas 속 균주임을 나타낸다. 균주의 생화학적·생리적 특성을 조사하였다.
GNUM08122는 40^oC, 산성 조건(pH 4)는 물론 약 알칼리(pH 8)에서도 활발히 성장하였다. 높은 NaCl(10%, w/w)에서도 세포생장이 저해를 받지 않았고 다양한 탄수화물을 사용하는 것으로 확인되었다.

후속연구

비록 선별된 세 가지 균주 들 중에서 GNUM08122 조효소의 단위 단백질 질량 당 한천 분해 활성이 제일 낮았지만 α-형 아가레이즈일 가능성이 높았기 때문에 이 균주를 선정하여 후속 연구를 수행하였다.
즉, 일반적인 아가레이즈는 아가로오스를 갈락토오스 올리고머로 분해하지만, 세포 내에 축적되는 아가레이즈는 갈락토오스 올리고머를 단당류로 분해하는 것으로 알려져 있다[27, 33]. 향후 본 연구팀은 신규 분리된 미생물들이 생산하는 아가레이즈의 일부가 세포 내에 잔류하는 이유와 이들이 기존에 보고된 아가레이즈와 다른 특성이 있는지에 대한 것을 구체적으로 조사할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	아가로오스가수분해를 위해 산 가수분해 법을 이용하면 어떤 문제점이 발생되는가?	아가로오스는α-(1,3)과 β-(1,4) 당 결합(glycosidic bond)에 의해 β-Dgalactose와 3,6-anhydro-α-L-galactose가 교대로 연결된 중합체이다[22]. 산 가수 분해(acid hydrolysis) 법을 이용하여 아가로오스의 당 결합을 끊는 반응에서는 5-(hydroxymethyl) furfural(5-HMF)와 같은 미생물 발효 저해 물질이 생성되어 후속공정인 에탄올 발효공정의 기질로 사용하는 데 문제가 발생될 수 있다. 무차별적으로 당결합을 절단함은 물론 당 구조까지도 파괴하는 화학적 방법과는 달리, 효소적 가수 분해에서는 효소가 당 결합을 인식하여 일정패턴으로 절단하고 당 구조를 파괴하지 않아 독성물질이 생성되지 않는다[13].
	아가레이즈의 두 그룹은 무엇이며 각각의 특징은?	아가로오스를 가수분해하는 효소인 아가레이즈는 당결합을 절단하는 특성에 따라 두 그룹으로 나뉜다[7, 22]. α-아가레이즈는 α-1,3 당 결합을 절단하여 agarooligosaccharide 를 생성하는 반면[5], β-아가레이즈는 β-1,4 당 결합을 절단하여 neooligosaccharide를 생성한다[19]. 아가로오스를 가수 분해하는 많은 효소들이 발굴되었으며, 현재까지 알려진 대표적인 아가레이즈 생산 미생물로는 Alteromonas sp.
	당 분해 시 효소적 가수 분해가 가진 장점은 무엇인가?	산 가수 분해(acid hydrolysis) 법을 이용하여 아가로오스의 당 결합을 끊는 반응에서는 5-(hydroxymethyl) furfural(5-HMF)와 같은 미생물 발효 저해 물질이 생성되어 후속공정인 에탄올 발효공정의 기질로 사용하는 데 문제가 발생될 수 있다. 무차별적으로 당결합을 절단함은 물론 당 구조까지도 파괴하는 화학적 방법과는 달리, 효소적 가수 분해에서는 효소가 당 결합을 인식하여 일정패턴으로 절단하고 당 구조를 파괴하지 않아 독성물질이 생성되지 않는다[13]. 이와 같은 장점 때문에 최근 들어 고성능의 신규 아가레이즈를 발굴하기 위한 연구가 전세계적으로 활발히 진행되고 있다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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