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문제 정의
- 본 연구는 식물 pathogen에 대하여 broad spectrum을 갖고 plant growth promoting 기능을 가지며 abiotic stress에 대하여 내성 및 항진균 활성을 갖는 Bacillus subtilis를 분리하고, 항진균 활성의 증진을 위하여 최적배양조건을 설정하였다.
제안 방법
- 16s rDNA 유전자 분석은 BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 PCR을 행하였다. 반응조건은 94℃에서 1분간 denaturation, 60℃에서 1분 30초간 annealing 시킨 후 72℃에서 1분간 extention 하였으며, 이 조작을 총 30 cycle을 반복하였다.
- coli DH5a를 사용하여 일반적인 molecular cloning방법에 의하여 transformation 시킨 후, Wiard Plus SV miniprep DNA purification system을 이용하여 plasmid의 Mini-preparation시키고, automated DNA sequencer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 sequencing하였다. Alignment는 Clustal X (ver. 1.8) software를 사용하여 sequence를 rDNA 이차구조를 참고하여 alignment한 후 similarity 값(%)을 구하였다. 또한 advanced blast search를 통하여 염기서열을 비교하였다.
- 사용한 primer는 27F (5'AGAGTTTGACMTGGCTCAG)와 1492r (5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT)이었다. Amplified fragment (16s rDNA region)를 pGEM T easy vector에 삽입하고, host cell로 E. coli DH5a를 사용하여 일반적인 molecular cloning방법에 의하여 transformation 시킨 후, Wiard Plus SV miniprep DNA purification system을 이용하여 plasmid의 Mini-preparation시키고, automated DNA sequencer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 sequencing하였다. Alignment는 Clustal X (ver.
- B. subtilis KYS-10을 최적배양조건(Table 5)에서 배양 후, 식물병원균에 대한 항진균 활성을 측정하였다. 식물병원균에 대한 생육 저해환의 크기는 G.
- B. subtilis KYS-10의 분자생물학적 특성조사에서 Bacillus subtilis를 비롯한 다른 표준균주와 비교 시 낮은 유사도를 나타내어, 보다 정확한 동정을 하기 위하여 분리균주의 G＋C mole 함량분석, 유전자 배열분석을 행하였다. G＋C mole 함량을 Table 5를 근거로 하여 분석한 결과 G의 함량은 약 31.
- 8) software를 사용하여 sequence를 rDNA 이차구조를 참고하여 alignment한 후 similarity 값(%)을 구하였다. 또한 advanced blast search를 통하여 염기서열을 비교하였다.
- (1994) 의 방법에 따라 그람 염색하여 광학현미경(Nikon, FK-IIA, Japan)으로 관찰하였다. 또한 분리균주의 정밀한 외형을 관찰하기 위하여 2.0% phosphotungstin acid로 negative 염색하여 전자현미경(Hitachi S-4800, Japan)을 이용하여 관찰하였으며, glucose nutrient agar 배지, skim milk 배지, Luria-Bertani 배지에서 생육한 집락의 형태, 크기, 색깔 등을 관찰하였고, 반유동고체배지(tryptose 1.0%, sodium chloride 0.5%, agar 0.5%)에 배양하여 운동성을 조사하였다.
- 또한, 분리 균주를 배양하여 원심분리기(E. I. Dupont, RC-5C, U.S.A)로 5000 rpm, 40분간 원심분리하여 균체를 제거한 여액을 미리 준비한 식물병원균 도말 PDA배지에 cup cylinder (8×8 mm)를 중앙에 올려놓고 첨가하여 30℃, 7일간 배양 후 형성된 억제환의 직경을 측정하여 항진균 활성을 평가하였다.
- 분리 균주의 항균 활성은 대치배양을 통한 저해 정도 및 확산법에 의하여 측정하였다, 대치배양은 PDA배지 plate에 식물 병원균을 치상 후 약 5 cm 떨어진 곳에 항진균 활성 균주를 획을 그어 접종하여 30℃에서 7일간 대치 배양(pairing culure)하여 분리균주와 식물 병원균 간의 억제 정도(inhibition zone)를 조사하였다. 또한, 분리 균주를 배양하여 원심분리기(E.
- 분리균주는 탄소원, 질소원, 무기질의 함량 및 pH를 변화시키면서 최적의 배지 조건을 설정하였으며, 접종비, 교반속도, 온도를 변화 시키면서 최적의 생육조건을 설정하였다.
- 분리한 균주의 G＋C mole 함량을 조사하기 위하여 균체를 배양 후 crude DNA를 추출하여 HPLC (HITACHI, L-300, Japan)로 분석하였다. 사용한 column은 comosil 5C18이며 0.
- 항진균 활성을 나타내는 균주를 선발하기 위하여 petridish 고체배지(potato dextrose agar)에 오디균핵병을 유발하는 S. shiraiana을 도말한 후 덮개를 개방하여 원광대학교 식품･ 환경학과 농약학 연구실에 두고 부유 균주가 접촉하도록 하였다. 부유 균주 중 항진균 활성을 나타내는 3종의 균주를 선발하고, 오디균핵병균 이외의 다른 식물 진균 병균에 활성을 나타내는 미생물을 선발하여 본 연구에 사용하였다.
대상 데이터
- shiraiana을 도말한 후 덮개를 개방하여 원광대학교 식품･ 환경학과 농약학 연구실에 두고 부유 균주가 접촉하도록 하였다. 부유 균주 중 항진균 활성을 나타내는 3종의 균주를 선발하고, 오디균핵병균 이외의 다른 식물 진균 병균에 활성을 나타내는 미생물을 선발하여 본 연구에 사용하였다.
- 사용한 primer는 27F (5'AGAGTTTGACMTGGCTCAG)와 1492r (5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT)이었다.
- 항진균활성 측정을 위해 농촌진흥청 농업생명공학연구원 농용미생물보존센터로 부터 7종의 병원균을 분양받았으며, 오디 균핵병균은 전라북도 농업기술원에서, 맥류 붉은곰팡이 병균은 국립식량과학원에서 분양받아 계대배양 후 피검균으로 사용하였다(Table 1). 피검균은 22℃에서 7일간 배양하여 균의 증식정도를 확인한 후 4℃에 냉장보관하면서 사면배지와 동일한 배지를 사용하여 3주 간격으로 계대배양하여 실험에 사용하였다.
이론/모형
- 분리 균주의 생리학적 특성은 casein 분해능, 전분 분해능, gelatin 액화력, 당발효성, indole 생성능, nitrate 환원력, catalase와 oxidase 생산능을 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Leadbetter et al., 1974)에 따라 수행하였다.
- 분리 균주의 크기와 형태는 Gerhatdt et al. (1994) 의 방법에 따라 그람 염색하여 광학현미경(Nikon, FK-IIA, Japan)으로 관찰하였다. 또한 분리균주의 정밀한 외형을 관찰하기 위하여 2.
성능/효과
- , 2009) 등의 결과에 비해 높은 저해 활성을 갖는 것을 확인하였다. B. subtilis종 이 외의 길항미생물 B. coagulans (Katarzyna et al., 2002), B. amyloliguetaciens (Kim et al., 2001), S. humidus (Hwang et al., 2001), P. fluorescens (Hassan et al., 2010), T. harzianum, S. nouresi (Zivkobic et al., 2010) 등의 결과에 비해 강한 저해 활성을 갖는 것으로 확인하였다. 따라서, 본 실험 결과는 B.
- subtilis KYS-10의 분자생물학적 특성조사에서 Bacillus subtilis를 비롯한 다른 표준균주와 비교 시 낮은 유사도를 나타내어, 보다 정확한 동정을 하기 위하여 분리균주의 G＋C mole 함량분석, 유전자 배열분석을 행하였다. G＋C mole 함량을 Table 5를 근거로 하여 분석한 결과 G의 함량은 약 31.4%였으며, C의 함량은 약 22.7%로 G＋C mole 함량은 약 54.1%로 나타났다. 이는 일반적으로 Bacillus sp.
- 고체배지에서의 특성은 potato-dextrose agar (PDA), glucose nutrient agar medium, skim milk medium, Luria-Bertani medium 등 중성의 배지에서는 원활한 생육을 보였으며, PDA 평판배지(pH 7.0)에서의 colony 형태는 무정이었고(Fig. 1), 색깔은 점질성이 풍부한 흰색이었으며 표면은 볼록하고 주름이 풍부한 상태였다. 액체배지에서 생육은 좋았고 호기성이었으며, 쉽게 박리되는 균체의 침전현상을 나타내었다(Tabe 2).
- subtilis의 표준균주와 98% 유사도를 나타내어 가장 가까운 균이라 할 수 있으나 분자생물학적 유사도 시험 결과 같은 종의 균이라고 볼 수는 없다. 그러므로 본 실험에서 분리한 항진균 활성 균주는 Bacillus 속의 새로운 종이라 판단하여 Bacillus subtilis KYS-10이라 명명하였고, 또한 Neighbor-joining method에 의하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성였다(Fig. 3).
- 0이었고, 생육온도 범위는 15~45℃이었다. 또한 염농도 10%까지 생육이 가능하였으며, catalase 양성, oxidase 양성 및 starch, casein을 가수분해하였으며, cellulose 가수 분해능은 음성이었다. 또한 indole 생산능을 갖고 있었고, arginine과 peptone으로부터 NH3를 생산하였다.
- shiraiana (오디균핵병균)은 35~39 mm의 생육저해환을 나타내어었다. 반면, F. Oxysporum KACC 44452(인삼뿌리썩음병균)은 28 mm 생육저해환을 보여 다른 식물병원균보다 낮은 생육 저해환을 보였다(Table 6). 이는 B.
- 생리적 특성을 검토한 결과는 생육 pH 범위는 5.0~9.0이었고, 생육온도 범위는 15~45℃이었다. 또한 염농도 10%까지 생육이 가능하였으며, catalase 양성, oxidase 양성 및 starch, casein을 가수분해하였으며, cellulose 가수 분해능은 음성이었다.
- subtilis KYS-10을 최적배양조건(Table 5)에서 배양 후, 식물병원균에 대한 항진균 활성을 측정하였다. 식물병원균에 대한 생육 저해환의 크기는 G. zeae(맥류붉은곰팡이병)은 70 mm의 생육 저해환을 나타내어 가장 높은 항진균 활성을 보였고, P. grisea KACC 40439(벼도열병), P. capsici KACC 40177(고추역병균), C. destructans KACC 41077 (인삼뿌리썩음병)은 40~43 mm의 생육 저해환을 나타냈으며, C. gloeosporioides KACC 43520(포도탄저병균), C. gloesporioides KACC 40003(고추탄저병균), S. shiraiana (오디균핵병균)은 35~39 mm의 생육저해환을 나타내어었다. 반면, F.
- 1), 색깔은 점질성이 풍부한 흰색이었으며 표면은 볼록하고 주름이 풍부한 상태였다. 액체배지에서 생육은 좋았고 호기성이었으며, 쉽게 박리되는 균체의 침전현상을 나타내었다(Tabe 2). 이 균주의 형태학적 특성은 단간균으로서 그 크기는 0.
- 16s rDNA 유전자 alignment를 행한 결과, 1480bps의 염기서열을 결정하고 그 결과를 Table 5에 나타내었다. 이 결과로부터 이 균주는 Bacillus속에 속하는 세균으로 판명되었으며, 실험균주는 B. subtilis의 표준균주와 98% 유사도를 나타내어 가장 가까운 균이라 할 수 있으나 분자생물학적 유사도 시험 결과 같은 종의 균이라고 볼 수는 없다. 그러므로 본 실험에서 분리한 항진균 활성 균주는 Bacillus 속의 새로운 종이라 판단하여 Bacillus subtilis KYS-10이라 명명하였고, 또한 Neighbor-joining method에 의하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성였다(Fig.
- 이 균주의 형태학적 특성은 단간균으로서 그 크기는 0.2 × 1.0 ㎛으로 비교적 size가 작은 편이였으며, 편모는 확인되지 않았고(Fig. 2), 운동성도 관찰되지 않았으며, gram 양성이었다(Table 3).
- 의 특성과 유사한 결과를 나타내었다. 이는 B. subtiis 및 B. lamtus의 mole % G＋C의 함량과 유사하였으나, B. subtilis를 비롯한 subtilis group의 32~42%와는 상당한 차이를 보여 Bacillus 속의 새로운 균으로 판단하였다.
- 형태학적 및 배양학적 특성을 살펴본 결과, Bacillus종일 가능성이 높은 것으로 판단되었다. 그러나 편모에 의한 운동 성을 갖는 특성을 나타내지 않아 새로운 종 또는 변이주일 가능성도 높은 것으로 판단된다.
후속연구
- , 2010) 등의 결과에 비해 강한 저해 활성을 갖는 것으로 확인하였다. 따라서, 본 실험 결과는 B. subtilis KYS-10의 배양여액에 길항 미생물이 생산하는 2차 대사물질이 존재한다는 것을 시사하는 결과로서 추후 물질의 분리와 확인에 관한 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
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