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문제 정의
- 본 연구는 채소류 모잘록병균의 미생물학적 방제의 일환으로 먼저 모잘록병균 Pythium 과 Rhizoctonia solani AG4에 길항하는 미생물을 채소류 뿌리에 서식하는 근권미생물 중에서 분리. 선별하여 동정하고 그 균의 항진균 특성을 조사하였기에 보고하고자 한다.
제안 방법
- 모잘록병균에 길항하는 미생물의 선발은 분리균과 병원균을 대치배양(pairing plate culture)하여 생육억제환의 크기로 선발하였다. PDA 배지에서 키운 병원균체 덩어리를 PDA 배지 중앙에 올려놓고 가장자리 4곳에 순수분리한 미생물을 한 백금이씩 접종하여 30℃에서 7~10일간 배양 한후 병원균의 균사체의 생장억제 정도(inhibition zone)를 조사하여 생성된 clear zone의 길이(mm)나 대치배양거리 5 cm에 대한 생육억제정도(%)로 길항력을 나타내었다.
- 생화학적 특성을 조사하며, 두 번째는 미생물의 세포벽의 지방산의 조성으로 자동 동정하는 Microbial ID Inc.의 아lerlock system (미생물동정장치, GC : HP Co, 6890 series)을 이용하여 제조사가 추천하는 방법에 따라 분석하였고, 세번째는 16S rDNA sequence 법[17]은 길항균의 염색체 DNA를 추출한 후 PCR primer로 R14 (5'-ACg ggC ggT gTg TAC-3')와 R15 ( 5z-gCC AgC AgC CgC ggT A3)를 이용하여 PCR 산물을 얻고 이를 분석 의뢰하였으며, 그 sequencing data는 ribosomal database (http://rdp.cme.msu.edu/html/ analyses, html)에서 상동성을 검색하여 동정하였다,
- 채소류 모잘록병균에 길항력을 가지는 미생물을 선발하기 위하여 경상남북도 일원의 균원시료로부터 600여종의 근권미생물을 순수분리하였고, 이들 근권 미생물은 모잘록병균인 Pythium ultimum과 Rhizoctonia solani AG-4에 각각 서로 대치배양하여 생육저지대 측정법으로 조사한 후 모잘록병원균에 길항력이 우수한 5종의 세균을 선별하였다(데이타 미제시). 이들 5종의 근권 길항미생물을 다시 2차 선별한 결과 그들 중에서 가장 강한 균사 생장억제 효과를 나타내는 YJ-37 균주를 최종 선발하였다.
대상 데이터
- 균원시료는 경상남도 창녕, 경상북도 성주, 고령 일원에서 일반적으로 재배되고 있는 무, 배추, 수박, 참외, 마늘 등 채소류의 뿌리를 수집하여 균원시료로 이용하였다. 근권미생물은 균원시료인 뿌리를 잘 세척하고 그 크기가 1mm 가 되게 절단하여 그 lg에 0.
- 근권미생물의 보관은 NA 배지나 TSB 배지 (pH 6.0~7.0)에서 30~37℃에서 3-5일 동안 진탕 배양시킨 후 미생물 세포의 수가 1ml 당 콜로니 형성단위 (clony forming unit; cfu)로서 108~ 109개 포함되어 있는 배양액을 4℃에 보관하거나 동결건조기로 건조하여 분말상태로 보관하면서 사용하였다.
- Gloeosporium juglandis, Glomerella sp. G. cin- gulata, G. lagenaria, Penicillium italicum, P. digitatum, Phy- tophthora capsid, Stemprhylium solani, Didymella bryoniae, Sclerotinia sclerotiorum 등을 농촌진흥청 식물병리과, 한국과학기술원 유전자은행 (KCTC), 경북대학교 농생물학과 등에서 분양받아 이용하였다. 이들 병원성 곰팡이 균주는 PDA (Potato Dextrose Agar) 배지상에서 28 ℃ 조건으로 4~10일간 배양한 다음 4℃에서 보관하면서 사용하였다.
- YJ-37. The PCR primer was R14 (5z-ACg ggC ggT gTg TAC-3') and R15 (5z~gCC AgC AgC CgC ggT A-3‘), The sequencing data (604 bp) were analyzed from ribosomal database (http://rdp.cme.msu.edu/html/analyses.html).
- 채소류 모잘록병균인 Pythium ultimun에 길항하는 미생물을 분리하기 위해 채소류 뿌리를 균원시료로 하여 약 600여종의 근권미생물을 분리하였고, 그 중 5종의 근권미생물이 길항력을 나타내어 가장 높은 길항력 높은 YJ-37 균주를 최종 선별하였다. 분리한 길항균 YJ-37을 Berge/s Mannual of Systematic Bacteriology의 방법에 준하여 미생물의 형태학적, 배양학적, 생리 .
이론/모형
- 길항미생물의 동정은 3가지 방법으로 행하였다. 먼저 Bergey's mannual of systematic bacteriology5] 방법 [21] 에 준하여 미생물의 형태학적, 배양학적, 생리 . 생화학적 특성을 조사하며, 두 번째는 미생물의 세포벽의 지방산의 조성으로 자동 동정하는 Microbial ID Inc.
- 채소류 모잘록병균인 Pythium ultimun에 길항하는 미생물을 분리하기 위해 채소류 뿌리를 균원시료로 하여 약 600여종의 근권미생물을 분리하였고, 그 중 5종의 근권미생물이 길항력을 나타내어 가장 높은 길항력 높은 YJ-37 균주를 최종 선별하였다. 분리한 길항균 YJ-37을 Berge/s Mannual of Systematic Bacteriology의 방법에 준하여 미생물의 형태학적, 배양학적, 생리 . 생화학적 특성을 조사하였으며, 미생물의 세포벽의 지방산의 조성으로 자동 동정하는 Sherlock system을 이용하는 방법과 16S rDNA의 부분염기서열을 결정하여 동정하는 방법 등 3가지 방법으로 조사한 결과, 근권 길항미생물인 YJ-37 균주는 Bacillus ehinensis 로 동정되었다.
성능/효과
- 채소류 모잘록병균에 길항력을 가지는 미생물을 선발하기 위하여 경상남북도 일원의 균원시료로부터 600여종의 근권미생물을 순수분리하였고, 이들 근권 미생물은 모잘록병균인 Pythium ultimum과 Rhizoctonia solani AG-4에 각각 서로 대치배양하여 생육저지대 측정법으로 조사한 후 모잘록병원균에 길항력이 우수한 5종의 세균을 선별하였다(데이타 미제시). 이들 5종의 근권 길항미생물을 다시 2차 선별한 결과 그들 중에서 가장 강한 균사 생장억제 효과를 나타내는 YJ-37 균주를 최종 선발하였다. 선발한 YJ-37 균 주는 무, 마늘 등 채소류의 뿌리에서 많이 존재하였다.
- 상기 선발균주 YJ-37은 gram 염색에서 양성이었고, 운동성이 없으며, 전자현미경 관찰하에서는 여러 개의 편모를 가지고, 내생포자를 형성하는 간균CFig. 1)이며, Table 1과 같이 배양학적 특성을 조사한 결과, catalase는 음성, 혐기적 조건에서는 생육이 불가능하였으며, Voges-Prostaure test 양성, D-glucose, L-arabinose, D-xylose, D-mannitol에서는 산을 생성하였고, glucose에서 배양할 경우 가스를 생성하였으며, casein, gelatin, starch를 가수분해하며, tyrosine 을 분해하지 못하였고, 또한 nitrate reduction과 citrate 이용성 및 indole 생성능은 음성, 2% NaCl 이하 농도에서는 생육이 가능하며, 50℃까지 생육하는 특성을 가지고 있어 Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology에 의거하여 조사한 결과, Bacillus 속으로 확인하였다.
- Sherolock system에 의한 길항균 YJ-37의 세포벽 지방산 분석결과, Table 2에서와 같이 주로 04:0 iso, C14:0, C15:0 iso, C15:0 anteiso, C15:0, C16:l w7c alcohol, C16:0 iso, C16:l wile, C16:0, C17:l wlOc, C17:0 iso, C17:0 anteiso로 이루어져 있으며, 포화지방산인 C15:0 iso (7.80%), C15:0 anteiso (52.26%) 및 C17:0 iso (3.18%)가 많이 포함되어 있었다. 이러한 결과, Bacillus ehimensis는 표준균주와 0.
- 18%)가 많이 포함되어 있었다. 이러한 결과, Bacillus ehimensis는 표준균주와 0.869의 유의성 즉, 86.9%의 유사도을 가지는 것이며, Paenibacillus gordonae는 0.645, Paenibacillus polymyxa는 0.350의 유의성을 가지는 것으로 확인되었다.
- 상기 YJ-37 균주의 16S rDNA sequence는 일반적인 방법으로 염색체 DNA를 분리하고 PCR primer R14와 R15 를 이용하여 PCR 산물을 얻고 이를 분석 의뢰하여 부분 염기서열 604bp를 결정하였다. 604bp의 염기서열은 ribosomal database에서 상동성을 검색한 결과, Fig. 2에서와 같이 분리주 YJ-37은 Bacillus ehimensis의 표준균주와 97.84% 의 높은 유사도를 보였으며, Paenibacillus koreensis와 96.85%, Paenibacillus validus와 93.86%, Paenibacillus chibaensisS}-92.79%의 유사도를 나타내었다. 이상의 3가지 동정법에 의해 동정한 결과 근권 길항미생물인 YJ-37 균주는 Bacillus ehimensis로 동정되었기에 Bacillus ehimensis YJ-3이라 명명하였다.
- 79%의 유사도를 나타내었다. 이상의 3가지 동정법에 의해 동정한 결과 근권 길항미생물인 YJ-37 균주는 Bacillus ehimensis로 동정되었기에 Bacillus ehimensis YJ-3이라 명명하였다.
- 채소류 모잘록병균 Pythium ultimun 과 Rhizoctonia solani AG-4 이외에도 길항균 B. ehimensis YJ-37에 의한 다른 식물 병원성 진균의 길항력을 조사한 결과, Fig. 3에서와 같이 B. ehimensis YJ-37이 Altemaria altrata 에 대한 생육을 83%(inhibition percentage, %) 억제하였고, Collectotrichum gloeosporioides (45%), Didymella bryoniae (45%), Fusarium moniliforme (55%), F. oxysporum (90%), F. oxysporum cucu- merinum (90%), F. oxysporum niveum (80%), Gloeosporium sp. (72%), Glomerella sp.
- italicum (30%), Phytaphthora capsid (45%), Pythium ultimum (99%), Rhi- zoctonia solani AG-4 (80%), Sclerotinia sclerotiorum (90%), Stemprhylium solani (85%)등 대부분의 병원균에 대해서 항진균 활성을 나타내었다. 특히 Altemaria altrata, F. oxysporum cucumerinum, F. moniliforme, E oxysporum niveum, Penidllium digitatum, Sclerotinia sclerotiorum, Stemprhylium solani 등의 진균에서 채소류 모잘록병균 Pythium ultimum 에서의 길항력과 거의 비슷하게 높은 항진균 활성을 가지고 있었다.
- 분리한 길항균 YJ-37을 Berge/s Mannual of Systematic Bacteriology의 방법에 준하여 미생물의 형태학적, 배양학적, 생리 . 생화학적 특성을 조사하였으며, 미생물의 세포벽의 지방산의 조성으로 자동 동정하는 Sherlock system을 이용하는 방법과 16S rDNA의 부분염기서열을 결정하여 동정하는 방법 등 3가지 방법으로 조사한 결과, 근권 길항미생물인 YJ-37 균주는 Bacillus ehinensis 로 동정되었다. 채소류 모잘록병균 Pythium ultimun 과 Rhizoctonia solani AG-4 이외에도 B.
- 생화학적 특성을 조사하였으며, 미생물의 세포벽의 지방산의 조성으로 자동 동정하는 Sherlock system을 이용하는 방법과 16S rDNA의 부분염기서열을 결정하여 동정하는 방법 등 3가지 방법으로 조사한 결과, 근권 길항미생물인 YJ-37 균주는 Bacillus ehinensis 로 동정되었다. 채소류 모잘록병균 Pythium ultimun 과 Rhizoctonia solani AG-4 이외에도 B. ehimensis YJ-37에 의한 병원성 진균의 길항력을 조사한 결과, Alternaria al-trata Collectotrichum gloeosporioides, Didymella bryoniae, Fusarium moniliforme, F. oxysporum, F. oxysporum cucumerinum,F. oxysporum niveum, Gloeosporium sp.
- oxysporum cucumerinum,F. oxysporum niveum, Gloeosporium sp.z Glomerella sp.z G. cingulata, G. lagenaria, Penicillium digitatum, P. italicum, Phytophthora capsid, Sclerotinia sclerotiorum, Stemprhylium solani 등 대부분의 병원균에 대해서 항진균 활성을 나타내었다.
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