[논문]Trichoderma reesei 유래 산업효소를 이용한 인삼추출물로부터 Compound K 생산 최적화

한강; 이남근; 이유리; 정은정; 정용섭

doi:10.9799/ksfan.2012.25.3.570

Trichoderma reesei 유래 산업효소를 이용한 인삼추출물로부터 Compound K 생산 최적화
Optimization of Compound K Production from Ginseng Extract by Enzymatic Bioconversion of Trichoderma reesei 원문보기

한국식품영양학회지 = The Korean journal of food and nutrition, v.25 no.3, 2012년, pp.570 - 578

한강 (전북대학교 식품공학과) , 이남근 (전북대학교 바이오식품소재개발 및 산업화연구센터) , 이유리 (전북대학교 바이오식품소재개발 및 산업화연구센터) , 정은정 (전북대학교 바이오식품소재개발 및 산업화연구센터) , 정용섭 (전북대학교 식품공학과)

초록
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인삼 조사포닌 추출물 내의 ginsenoside를 CK로 전환을 하기 위하여 T. reesei 유래 cellulolytic 복합 효소를 사용하였다. 온도, pH, 인삼 조사포닌 추출물 농도, 효소 농도와 반응시간별 T. reesei 효소의 인삼 조사포닌 추출물로부터 CK 전환에 대한 적정조건을 살펴본 결과, 온도는 $50^{\circ}C$에서 691.51 mg/100 g으로, pH는 조건별 큰 차이는 보이지 않았지만 pH 5.0일때 701.88 mg/100 g으로 가장 높은 함량을 나타내었다. 인삼 조사포닌 추출물과 효소 농도에 있어서는 각각 2%(w/v) 농도(678.82 mg/100 g)와 9%(v/v) 농도(691.51 mg/100 g)일 때 가장 높은 CK 농도를 보였다. 온도 $50^{\circ}C$, pH 5.0, 인삼 조사포닌 추출물 농도 2%(w/v)와 효소농도 9%(v/v)에서 반응시간에 따른 CK 생산을 분석한 결과, 반응 48시간까지 급격히 증가하다가 그 이후에는 반응속도가 현저하게 느려지는 경향을 보였지만, 반응 96시간에 784.97 mg/100 g으로 가장 높은 CK 농도를 나타내었다. 이러한 결과를 토대로 인삼 조사포닌 추출물의 농도 2%(w/v), 효소 농도 7%(v/v)와 반응 시간 48 hr를 CK 생산에 중요 요인변수로 선정하여 pH 5.0와 온도 $50^{\circ}C$에서 반응표면분석법 실험을 진행하였다. 그 결과, 인삼 조사포닌 추출물 농도 2.38%, 효소농도 6.07%와 효소반응 시간 64.04 hr를 최적조건으로 설정하였으며, CK 생산 예측 값은 840.77 mg/100 g이었다. 반응표면분석법으로 선정한 최적조건에서 플라스크와 생물반응기를 이용하여 효소반응을 수행한 결과 플라스크에서는 CK 생산 예측 값 보다 약 1.2배 높은 1,017.93 mg/100 g이 생성되었고, 생물반응기에서는 예측 값과 비슷한 862.31 mg/100 g의 CK가 생성되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Compound K(ginsenoside M1) is one of saponin metabolites and has many benefits for human health. This study was to investigate Compound K produced from ginseng crude saponin extract with commercial cellulolytic complex enzyme(cellulase, ${\beta}$-glucanase, and hemicellulase) obtained from Trichoderma reesei. The effect factors(temperature, pH, ginseng crude saponin extract and enzyme concentration, and reaction time) on production of Compound K from ginseng crude saponin extract were determined by one factor at a time method. The selected major factor variables were ginseng crude saponin extract of 2%(w/v), enzyme of 7%(v/v), reaction time of 48 hr. Based on the effect factors, response surface method was proceeded to optimize the enzymatic bioconversion conditions for the desirable Compound K production under the fixed condition of pH 5.0 and $50^{\circ}C$. The optimal reaction condition from RSM was ginseng crude saponin extract of 2.38%, enzyme of 6.06%, and reaction time of 64.04 hr. The expected concentration of Compound K produced from that reaction was 840.77 mg/100 g. Production of Compound K was 1,017.93 mg/100 g and 862.31 mg/100 g, by flask and bench-scale bioreactor($2.5{\ell}$) system, respectively.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서 산업에 적용되고 있는 당 전환 모델 시스템 균주인 T. reesei의 효소를 이용하여 인삼 조사포닌 추출물로부터 CK를 생산하고자 하였으며, 이에 따라 온도, pH, 인삼 조사포닌 추출물 농도, 효소 농도와 반응시간에 따른 CK의 전환 조건을 선정하고, 최종적으로 반응표면분석법을 적용하여 생산 최적화를 하기 위한 조건들을 결정하였다.

제안 방법

RSM을 통해 얻은 최적조건에서 플라스크와 생물반응기에서 효소반응을 실행하여 12 hr 간격으로 시료를 취하여 분석 하였다. RSM 최적조건인 64.
T. reesei 효소의 온도 변화에 따른 인삼 조사포닌 추출물로부터 CK의 생성량을 알아보기 위하여 2%(w/v) 인삼 조사포닌 추출물 수용액과 9%(v/v) 효소액을 50 ㎖가 되도록 한후 온도 조건을 40℃에서 60℃까지 5℃ 간격으로 설정하고 각각 120 rpm에서 24 hr 동안 반응시켰다. 그리고 다양한 pH 영향은 1 N HCl과 1 N NaOH를 이용하여 인삼 조사포닌 추출물의 pH를 3.
0로 조절하였으며, 12 hr마다 시료를 취하여 효소반응을 정지시킨 후 HPLC 분석을 통해 ginsenoside의 변화를 관찰하였다. 그리고 동시에 플라스크에서도 반응을 수행하여 결과를 비교하였다.
그리고 인삼 조사포닌 추출물의 농도, 효소의 농도와 반응시간 세 가지 요인을 최적화 하고자 －α, －1, 0, 1과 α 다섯 단계로 부호화 하였다.
682이었다(Table 1). 또한 CCD 설계법을 적용한 총 17가지의 제시된 실험조합(Table 2)에 대해 3반복을 통하여 51개 실험구가 수행되었다. 독립변수에 영향을 받는 종속변수(Y)는 CK로 회귀분석에 사용되었으며, 회귀분석에 의한 모델식의 예측을 위해 Design Expert pro S/W ver.
5ℓ로 유지하며 반응을 수행하였다. 반응기간 동안 교반속도와 pH는 각각 120 rpm과 pH 5.0로 조절하였으며, 12 hr마다 시료를 취하여 효소반응을 정지시킨 후 HPLC 분석을 통해 ginsenoside의 변화를 관찰하였다. 그리고 동시에 플라스크에서도 반응을 수행하여 결과를 비교하였다.
7. 생물반응기에서의 효소반응

반응표면분석 방법에 의하여 측정된 최적 조건을 바탕으로 2.5ℓ의 생물반응기(Kobio Tech Co. Ltd. Seoul, Korea)에서 반응액을 1.5ℓ로 유지하며 반응을 수행하였다. 반응기간 동안 교반속도와 pH는 각각 120 rpm과 pH 5.
선행 실험 결과에 따라 온도 50℃, pH 5.0, 인삼 조사포닌 추출물 2%와 효소농도 9%에서 효소 반응시간에 따른 CK로의 전환을 측정하여 나타내었다(Fig. 4). 그 결과, 24시간(680.
온도, pH, 인삼 조사포닌 추출물 농도와 효소 농도 조건에 따른 실험 결과(50℃, pH 5.0, 2%(w/v)인삼 조사포닌 추출물, 9%(v/v) 효소)를 기준으로 시간별 효소반응에 따른 CK로의 전환 정도를 측정하였으며, 반응은 120 rpm에서 12 hr 간격으로 96 hr 동안 진행하였다. 효소반응 정지 및 분석용 시료 준비는 온도 및 pH 조건별 효소반응에서 수행된 방법과 동일하게 진행하였다.
97 ㎎/100 g으로 가장 높은 CK 농도를 나타내었다. 이러한 결과를 토대로 인삼 조사포닌 추출물의 농도 2%(w/v), 효소 농도 7%(v/v)와 반응 시간 48 hr를 CK 생산에 중요 요인변수로 선정하여 pH 5.0와 온도 50℃에서 반응표면분석법 실험을 진행하였다. 그 결과, 인삼 조사포닌 추출물 농도 2.
Minneapolis, MN, USA)을 이용하여 반응표면 분석(RSM)을 수행하였다. 인삼 조사포닌 추출물 농도, 효소 농도와 반응 시간을 요인변수로 각각의 center point를 2%, 7%와 48 hr으로 설정하고, pH 5와 50℃로 고정한 다음 120 rpm에서 선정된 조건으로 실험을 수행하였다.
인삼 조사포닌 추출물부터 CK로의 전환 효소반응의 조건을 최적화하기 위하여 RSM을 수행하였다. 실험계획법으로는 중심합성계획법(Central composite design, CCD)을 이용하였으며, 선행된 각 요인별 실험 결과를 토대로 인삼 조사포닌 추출물의 농도, 효소의 농도와 반응시간을 중요 요인으로 선택하였다.
인삼 조사포닌 추출물의 농도별 CK의 생성량을 알아보기 위하여 인삼 조사포닌 추출물 수용액을 1%에서 5%(w/v)까지 1% 농도 차이로 만든 후, 각각의 인삼 조사포닌 추출물 수용액과 9%(v/v) 효소액을 50 ㎖가 되도록 한 후, 50℃ 인큐베이터에서 120 rpm으로 24 hr 반응시켰다. 그리고 효소처리 농도에 따른 영향은 2%(w/v) 인삼 조사포닌 추출물 수용액과 1%에서 9%(v/v)까지 2% 간격으로 준비된 각각의 효소액을 50㎖가 되도록 한 후 50℃ 인큐베이터에서 120 rpm으로 24 hr 반응시켰다.
효소 반응 후의 시료를 0.2 ㎕ membrane filter(Chrom Tech, Inc., MN, USA)로 여과한 후, HPLC(Waters HPLC system, USA)를 이용하여 ginsenoside들을 분석하였다. 컬럼은 YMC-triart C18 S column(5 ㎛, 4.

대상 데이터

0%)와 Compound K (Ambo Institute, 98%) 표준품을 구입하여 사용하였다. T. reesei의 cellulolytic 복합 효소는 AB Enzymes(Rohament CL, GmbH, Darmstadt, Germany)의 제품을 사용하였다.
본 연구에 사용된 인삼 조사포닌은 전라북도 진안군에서 생산된 인삼(2010년 6년근)으로부터 얻어진 조사포닌 분말을㈜글로엔엠(Wanju, Korea)에서 제공받아 사용하였다. 성분분석을 위하여 ginsenoside는 PPD(Protopanaxadiol)계 ginsenoside인 Rb1(Wako, 98.
본 연구에 사용된 인삼 조사포닌은 전라북도 진안군에서 생산된 인삼(2010년 6년근)으로부터 얻어진 조사포닌 분말을㈜글로엔엠(Wanju, Korea)에서 제공받아 사용하였다. 성분분석을 위하여 ginsenoside는 PPD(Protopanaxadiol)계 ginsenoside인 Rb1(Wako, 98.0%), Rc(Wako, 98.0%), Rb2(LKT Laboratories, Inc., 99.0%), Rd(Wako, 99.0%), Rg3(LKT Laboratories, Inc., 99.0%), Rh2(LKT Laboratories, Inc., 99.0%)와 Compound K (Ambo Institute, 98%) 표준품을 구입하여 사용하였다. T.
인삼 조사포닌 추출물 내의 ginsenoside를 CK로 전환을 하기 위하여 T. reesei 유래 cellulolytic 복합 효소를 사용하였다. 온도, pH, 인삼 조사포닌 추출물 농도, 효소 농도와 반응시간별 T.
컬럼은 YMC-triart C18 S column(5 ㎛, 4.6×250 ㎜, 12 nm)이었으며, PDA detector (waters 2998, Waters, USA)를 이용하여 265 nm에서 검출하였다.

데이터처리

또한 CCD 설계법을 적용한 총 17가지의 제시된 실험조합(Table 2)에 대해 3반복을 통하여 51개 실험구가 수행되었다. 독립변수에 영향을 받는 종속변수(Y)는 CK로 회귀분석에 사용되었으며, 회귀분석에 의한 모델식의 예측을 위해 Design Expert pro S/W ver. 1.0을 사용 하였다. 이상의 실험결과를 통계처리 하였으며, 분산분석표 (Analysis of variance, ANOVA)를 통한(Table 3) 전체적인 실험 모델의 p-value는 0.
선행 실험의 결과를 근거로 Design Expert pro S/W ver. 1.0 (Stat-Ease, Inc. Minneapolis, MN, USA)을 이용하여 반응표면 분석(RSM)을 수행하였다. 인삼 조사포닌 추출물 농도, 효소 농도와 반응 시간을 요인변수로 각각의 center point를 2%, 7%와 48 hr으로 설정하고, pH 5와 50℃로 고정한 다음 120 rpm에서 선정된 조건으로 실험을 수행하였다.
0을 사용 하였다. 이상의 실험결과를 통계처리 하였으며, 분산분석표 (Analysis of variance, ANOVA)를 통한(Table 3) 전체적인 실험 모델의 p-value는 0.0001로 0.05보다 작으므로 매우 유의성이 있는 것으로 확인되었다. 특히 인삼 조사포닌 추출물 농도와 효소반응 시간이 T.
주어진 테이터에 대한 정확한 최적점을 찾기 위하여 모수 추정에 의한 2차 회귀식을 바탕으로 능선분석을 하였으며, 최종적으로 반응표면분석을 통하여 CK 전환에 가장 영향을 주는 세 가지 인자의 최적 조건을 찾을 수 있었다(Fig. 5). 완벽한 최적점을 찾기 위하여 point prediction을 이용하여 840.

이론/모형

인삼 조사포닌 추출물부터 CK로의 전환 효소반응의 조건을 최적화하기 위하여 RSM을 수행하였다. 실험계획법으로는 중심합성계획법(Central composite design, CCD)을 이용하였으며, 선행된 각 요인별 실험 결과를 토대로 인삼 조사포닌 추출물의 농도, 효소의 농도와 반응시간을 중요 요인으로 선택하였다. 그리고 인삼 조사포닌 추출물의 농도, 효소의 농도와 반응시간 세 가지 요인을 최적화 하고자 －α, －1, 0, 1과 α 다섯 단계로 부호화 하였다.

성능/효과

RSM을 통해 얻은 최적조건에서 플라스크와 생물반응기에서 효소반응을 실행하여 12 hr 간격으로 시료를 취하여 분석 하였다. RSM 최적조건인 64.04 hr일 때의 CK 함량을 살펴보 았을 때 플라스크 반응에서 1,017.93 ㎎/100 g의 Compound K 가 생성되어 예측값인 840.77 ㎎/100 g보다 1.2배 가량 높은 값을 나타내었고, 생물반응기에서는 862.31 ㎎/100 g의 CK가 생성되어 예측값과 유사한 양이 생성되었음을 알 수 있었다 (Fig. 6).
T. reesei의 cellulolytic 복합 효소(27,000 CU/g) 농도에 따른 CK 함량은 효소농도가 1%일 때의 CK 함량이 194.87 ㎎/100 g, 3%일 때 503.58 ㎎/100 g, 5%일 때 658.73 ㎎/100 g, 7%일때 683.05 ㎎/100 g, 그리고 9%일 때 691.51 ㎎/100 g으로 나타났으며(Fig. 3b), 효소농도 9%일 때 인삼 조사포닌 추출물로부터 가장 높은 CK 생산량을 보였다.
T. reesei의 cellulolytic 복합 효소를 이용한 인삼 조사포닌 추출물 내 ginsenoside들로부터 반응온도에 따른 CK 전환에 있어서, 반응온도가 40℃일 때 CK 함량은 416.99 ㎎/100 g, 45℃일 때 CK 함량은 573.52 ㎎/100 g, 50℃일 때 CK 함량은 691.51 ㎎/100 g, 55℃일 때 595.41 ㎎/100 g, 그리고 60℃일때 528.03 ㎎/100 g이었다(Fig. 2 a).
2 a). pH 조건에 따른 CK의 함량은 pH 조건이 pH 3일 때 676.44 ㎎/100 g, pH 4일 때 700.42㎎/100 g, pH 5.0일 때 701.88 ㎎/100 g, pH 6.0일 때 697.90㎎/100 g, pH 7.0일 때 671.67 ㎎/100 g으로 각 pH 간의 큰 차이는 보이지 않았다(Fig. 2 b).
4). 그 결과, 24시간(680.94㎎/100 g)까지 급격히 증가하다가 48시간(763.39 ㎎/100 g) 이후부터는 CK로의 전환하는 속도가 상대적으로 매우 늦어지는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고 반응실험 최대 시간인 96 hr(784.
0와 온도 50℃에서 반응표면분석법 실험을 진행하였다. 그 결과, 인삼 조사포닌 추출물 농도 2.38%, 효소농도 6.07%와 효소반응 시간 64.04 hr를 최적조건으로 설정하였으며, CK 생산 예측 값은 840.77 ㎎/100 g이었다. 반응표면분석법으로 선정한 최적조건에서 플라스크와 생물반응기를 이용하여 효소반응을 수행한 결과 플라스크에서는 CK 생산 예측 값 보다 약 1.
39 ㎎/100 g) 이후부터는 CK로의 전환하는 속도가 상대적으로 매우 늦어지는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고 반응실험 최대 시간인 96 hr(784.97 ㎎/100 g)에서 CK의 함량이 가장 높게 나타났다. Ginsenoside들로부터 CK로의 전환을 연구한 보고들에 의하면 Lactobacillus, Aspergillus, Fusobacterium, Penicillium, Paecilomyces, Sulfolobus 등의 최적 CK 전환 반응시간은 12～72시간이었다(Park 등 2010; Quan 등 2008).
77 ㎎/100 g이었다. 반응표면분석법으로 선정한 최적조건에서 플라스크와 생물반응기를 이용하여 효소반응을 수행한 결과 플라스크에서는 CK 생산 예측 값 보다 약 1.2배 높은 1,017.93 ㎎/100 g이 생성되었고, 생물반응기에서는 예측 값과 비슷한 862.31 ㎎/100 g의 CK가 생성되었다.
본 실험에서는 3개의 요인에 대하여 선행실험의 결과로부터 적절한 중점을 선택하였으며, α값은 1.682이었다(Table 1).
2 b). 본 연구에서 인삼 조사포닌 추출물 내 ginsenoside들의 CK 전환에 대한 최적 온도와 pH 조건는 각각 50℃와 pH 5.0로 나타났으며, 이는 A. niger의 산업용 pectinase를 이용한 CK 전환 조건과 동일하였다(Kim 등 2006).
51 ㎎/100 g)일 때 가장 높은 CK 농도를 보였다. 온도 50℃, pH 5.0, 인삼 조사포닌 추출물 농도 2%(w/v)와 효소농도 9%(v/v)에서 반응시간에 따른 CK 생산을 분석한 결과, 반응 48시간까지 급격히 증가하다가 그 이후에는 반응속도가 현저하게 느려지는 경향을 보였지만, 반응 96시간에 784.97 ㎎/100 g으로 가장 높은 CK 농도를 나타내었다. 이러한 결과를 토대로 인삼 조사포닌 추출물의 농도 2%(w/v), 효소 농도 7%(v/v)와 반응 시간 48 hr를 CK 생산에 중요 요인변수로 선정하여 pH 5.
reesei 유래 cellulolytic 복합 효소를 사용하였다. 온도, pH, 인삼 조사포닌 추출물 농도, 효소 농도와 반응시간별 T. reesei 효소의 인삼 조사포닌 추출물로부터 CK 전환에 대한 적정조건을 살펴본 결과, 온도는 50℃에서 691.51 ㎎/100 g으로, pH는 조건별 큰 차이는 보이지 않았지만 pH 5.0일때 701.88 ㎎/100 g으로 가장 높은 함량을 나타내었다. 인삼 조사포닌 추출물과 효소 농도에 있어서는 각각 2%(w/v) 농도 (678.
인삼 조사포닌 추출물과 T. reesei의 cellulolytic 복합 효소 반응에서 인삼 조사포닌 추출물의 농도가 1%(w/v)일 때 CK 함량이 475.98 ㎎/100 g, 2%일 때 678.82 ㎎/100 g, 3%일 때 669.76 ㎎/100 g, 4%일 때 569.05 ㎎/100 g, 5%일 때 483.812㎎/100 g으로 측정되었으며, 인삼 조사포닌 추출물 2%(w/v) 일 때 CK로의 전환이 가장 높게 나타났음을 확인할 수 있었다(Fig. 3a).
88 ㎎/100 g으로 가장 높은 함량을 나타내었다. 인삼 조사포닌 추출물과 효소 농도에 있어서는 각각 2%(w/v) 농도 (678.82 ㎎/100 g)와 9%(v/v) 농도(691.51 ㎎/100 g)일 때 가장 높은 CK 농도를 보였다. 온도 50℃, pH 5.
32 ㎎/100 g으로 이는 보고된 ginsenoside의 함량보다는 높게 나타났다(Chio 등 2010). 인삼 조사포닌 추출물의 ginsenoside 중 PPT 계열인 Re의 함량이 12,862.39 ㎎/100 g으로 가장 높았으며, CK의 전구체들인 PPD계열 ginsenoside Rd, Rb2, Rc도 각각 9,373.25 ㎎/100 g, 5,557.31 ㎎/100 g, 2,309.17㎎/100 g으로 총 ginsenoside 함량의 45% 이상을 포함하고 있었으며, CK는 검출되지 않았다(Fig. 1).
05보다 작으므로 매우 유의성이 있는 것으로 확인되었다. 특히 인삼 조사포닌 추출물 농도와 효소반응 시간이 T. reesei의 cellulolytic 복합 효소를 이용한 인삼 조사포닌 추출물로부터 CK 생산에 매우 크게 기여하고 있음을 확인할 수 있었다. 그리고 R-square(결정계수)가 0.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	반응표면분석 방법은 교반속도와 pH는 얼마로 조절했는가?	5ℓ로 유지하며 반응을 수행하였다. 반응기간 동안 교반속도와 pH는 각각 120 rpm과 pH 5.0로 조절하였으며, 12 hr마다 시료를 취하여 효소반응을 정지시킨 후 HPLC 분석을 통해 ginsenoside의 변화를 관찰하였다. 그리고 동시에 플라스크에서도 반응을 수행하여 결과를 비교하였다.
	천연물에는 어떤것들이 함유되어 있는가?	천연물에는 유익한 생리활성 성분들이 다양하게 함유되어 있으며, 많은 종류들이 생리활성물질과 당이 결합된 배당체로 존재한다. 배당체를 구성하는 당으로는 glucose, arabinose, galactose, rhamnose, xylose 등이 있다(Quan 등 2010). 대부분 활성물질들은 β-glucoside 결합으로 존재하므로 당 결합을 끊을 수 있는 β-glucosidase, pectinase, hemicellulase, lactase와 cellulase 등의 효소나 그 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 천연물 내의 배당체 화합물을 활성 형태의 배당체 또는 무배당체로 전환할 수 있으며, 유효물질의 양을 증가시키는 것이 가능하다(Vensisetty & Ciddi 2003).
	활성물질은 어떤 결합으로 존재하고 있는가?	배당체를 구성하는 당으로는 glucose, arabinose, galactose, rhamnose, xylose 등이 있다(Quan 등 2010). 대부분 활성물질들은 β-glucoside 결합으로 존재하므로 당 결합을 끊을 수 있는 β-glucosidase, pectinase, hemicellulase, lactase와 cellulase 등의 효소나 그 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 천연물 내의 배당체 화합물을 활성 형태의 배당체 또는 무배당체로 전환할 수 있으며, 유효물질의 양을 증가시키는 것이 가능하다(Vensisetty & Ciddi 2003).

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Zhu YL, Huang W, Ni JR, Liu W, Li H. 2010. Production of diosgenin from Dioscorea zingiberensis tubers through enzymatic saccharification and microbial transformation. Appl Microbiol Biotechnol 85:1409-1416

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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