돼지에서 분리한 Actinobacillus pleuropneumoniae의 혈청형 분포 및 항생제 감수성 Serotype and antimicrobial susceptibility of Actinobacillus pleuropneumoniae isolates from pigs in Korea원문보기
Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae is the causative agent of pleuropneumonia which is one of the most important respiratory diseases in pigs worldwide. A total of 32 A. pleuropneumoniae isolates from diseased pigs during 2008 to 2010 were serotyped by polymerase chain reaction method. The suscepti...
Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae is the causative agent of pleuropneumonia which is one of the most important respiratory diseases in pigs worldwide. A total of 32 A. pleuropneumoniae isolates from diseased pigs during 2008 to 2010 were serotyped by polymerase chain reaction method. The susceptibility of the isolates to 13 antimicrobial agents were determined by disk diffusion test. In all the 32 isolates examined in this study, serotype 5 (16 isolates: 50%), 1 (7 isolates: 21.9%), 2 (5 isolates: 15.6%) and 12 (1 isolate: 3.1%) were found. Of all tested antimicrobial agents, resistance to oxytetracycline was found in 96.9% of isolates, followed by resistance to amikacin (81.2%), neomycin (68.7%), kanamycin (53.1%), penicillin (50.0%), gentamicin (43.7%), florfenicol (25.0%), ampicillin (18.7%), colistin (9.4%), trimethoprim/sulfamethoxazole, ceftiofur (8.3%), amoxicillin/clavulanic acid (3.1%) and enrofloxacin (0%). Oxytetracycline or florfenicol-resistant isolates were examined for the presence of resistance gene. Among the 31 oxytetracycline-resistant isolates, tetB, tetH and tetO genes were detected in 22 (71%), 8 (26%) and 1 (3%) isolates, respectively. The floR genes were detected in 8 (100%) of the 8 florfenicol-resistant A. pleuropneumoniae isolates.
Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae is the causative agent of pleuropneumonia which is one of the most important respiratory diseases in pigs worldwide. A total of 32 A. pleuropneumoniae isolates from diseased pigs during 2008 to 2010 were serotyped by polymerase chain reaction method. The susceptibility of the isolates to 13 antimicrobial agents were determined by disk diffusion test. In all the 32 isolates examined in this study, serotype 5 (16 isolates: 50%), 1 (7 isolates: 21.9%), 2 (5 isolates: 15.6%) and 12 (1 isolate: 3.1%) were found. Of all tested antimicrobial agents, resistance to oxytetracycline was found in 96.9% of isolates, followed by resistance to amikacin (81.2%), neomycin (68.7%), kanamycin (53.1%), penicillin (50.0%), gentamicin (43.7%), florfenicol (25.0%), ampicillin (18.7%), colistin (9.4%), trimethoprim/sulfamethoxazole, ceftiofur (8.3%), amoxicillin/clavulanic acid (3.1%) and enrofloxacin (0%). Oxytetracycline or florfenicol-resistant isolates were examined for the presence of resistance gene. Among the 31 oxytetracycline-resistant isolates, tetB, tetH and tetO genes were detected in 22 (71%), 8 (26%) and 1 (3%) isolates, respectively. The floR genes were detected in 8 (100%) of the 8 florfenicol-resistant A. pleuropneumoniae isolates.
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문제 정의
pleuropneumoniae 의 혈청형 분포를 확인하고, 항생제 감수성 검사를 통하여 효과적인 항생제 선발에 활용하고자 하였다. 또한 항생제 중에서 oxytetracycline과 florfenicol에 내성이 있는 균주에 대한 내성 유전자 분포를 확인하고자 하였다.
pleuropneumoniae 76주에 대한 항생제 감수성 검사결과 penicillin, ceftiofur 및 enrofloxacin 등에 감수성이 높다고 발표하였다. 본 실험에서는 국내 각 지역에서 분리된 총 32개의 균주를 대상으로 12종의 항생제에 대해 감수성 시험을 하였다. 그 결과 enrofloxacin이 내성균 없이 모두 감수성이 있는 것으로 나타났으며 amoxicillin/clavulanic acid, trimethoprim/ sulfamethoxazole, ceftiofur 가 내성률이 10% 미만으로 감수 성이 좋은 약제로 확인되어 기존과 비슷한 결과를 보였다.
본 연구는 2008년에서 2010년까지 코미팜 병성감정실에 의뢰된 육성, 비육돈의 폐에서 분리한 A. pleuropneumoniae 의 혈청형 분포를 확인하고, 항생제 감수성 검사를 통하여 효과적인 항생제 선발에 활용하고자 하였다. 또한 항생제 중에서 oxytetracycline과 florfenicol에 내성이 있는 균주에 대한 내성 유전자 분포를 확인하고자 하였다.
본 연구에서는 2008년에서부터 2010년까지 국내 양돈농장에서 분리된 A. pleuropneumoniae 32점에 대해 혈청형의 분포를 조사하고 항생제 감수성 검사를 통해 항생제에 따른 내성률을 확인하고자 하였다.
제안 방법
DNA 추출은 kit의 매뉴얼을 따라 실시하였고 PCR에 사용되기 전 –20oC에 보관하였다. A. pleuropneumoniae로 확인된 균주에서 혈청형을 구분하기 위해 15가지 혈청형 중 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 12형에 대해 PCR을 실시하였다. 각 혈청형에 대한 primer 정보는 기존에 보고된 문헌을 참고하였다[1, 11, 16, 21].
Oxytetracycline 또는 florfenicol에 내성을 나타낸 균주에 한하여 oxytetracycline 내성유전자인 tetA, tetB, tetH, tetL, tetO [3]와 florfenicol 내성 유전자인 floR [10]을 검출하기 위한 PCR을 실시하였다. 각각의 유전자를 검출하기 위한 primer 정보 및 PCR 조건은 기존의 문헌에 따라 실시하였다.
Oxytetracycline과 florfenicol에 내성을 나타낸 31점, 8점균주에 대한 내성 결정 유전자를 PCR법으로 조사하였다. Oxytetracycline 내성 결정 유전자 중 tetA, tetB, tetH, tetL, tetO에 한해 검사한 결과, tetB가 22점(68.
Premix는 Maxime PCR premix(i-Star Taq) (iNtron Biotech)을 사용하였고, 추출한 DNA 5 µL와 각각의 primer를 1 µL(10 pmol) 및 DNase RNase free water 13 µL를 첨가하여 최종 용량이 20 µL가 되도록 하였다. PCR 반응조건은 문헌에 나와있는 대로 혈청형별로 달리하였으며 PCR이 끝난 산물은 1.2% agarose gel을 사용하여 전기영동 후 혈청형별 특이밴드를 확인하였다.
Premix는 Maxime PCR premix(i-Star Taq) (iNtron Biotech)을 사용하였고, 추출한 DNA 5 µL와 각각의 primer를 1 µL(10 pmol) 및 DNase RNase free water 13 µL를 첨가하여 최종 용량이 20 µL가 되도록 하였다.
Oxytetracycline 또는 florfenicol에 내성을 나타낸 균주에 한하여 oxytetracycline 내성유전자인 tetA, tetB, tetH, tetL, tetO [3]와 florfenicol 내성 유전자인 floR [10]을 검출하기 위한 PCR을 실시하였다. 각각의 유전자를 검출하기 위한 primer 정보 및 PCR 조건은 기존의 문헌에 따라 실시하였다.
5로의 농도로 조절한 다음 NAD를 첨가한 Mueller-Hinton 배지에 도말하였다. 각각의 항생제 디스크를 접종한 후 37oC의 3~5% CO2 환경에서 18~24시간 배양한 다음 디스크 주위의 완전 억제존의 직경을 측정하여 내성여부를 판정하였다. 내성의 판정은 Becton-Dickinson 사 메뉴얼과 CLSI 의 기준에 따라 판정하였고, 항생제 감수성 검사의 표준균주로 A.
pleuropneumoniae ATCC 27090을 사용하였다. 또한 분리균 중에서 혈청형이 확인된 1, 2, 5, 12형에 한하여 혈청형에 따른 항생제 내성률을 비교하였다.
75 µg), oxytetracycline(30 µg)과 CLSI의 메뉴얼을 참고하여 제작한 enrofloxacin(10 µg), florfenicol(30 µg), ceftiofur(30 µg) 디스크를 사용하였다. 멸균면봉으로 배양된 콜로니를 채취하여 PBS에 부유시켜 MacFarland No. 0.5로의 농도로 조절한 다음 NAD를 첨가한 Mueller-Hinton 배지에 도말하였다. 각각의 항생제 디스크를 접종한 후 37oC의 3~5% CO2 환경에서 18~24시간 배양한 다음 디스크 주위의 완전 억제존의 직경을 측정하여 내성여부를 판정하였다.
배양된 액체배지를 200 µL 채취하여 G-spin Genomic DNA extraction kit(iNtron Biotech, Korea)를 사용하여 DNA를 추출하였다.
세균분리는 한일코메드(한국)에서 제조, 판매하는 5% 면양한천혈액배지와 초콜렛 한천배 지를 사용하였고, 혈액배지에는 Staphylococcus aureus 균을 획선도 말하였다. 배지는 촛불병배양법(Candle jar method)으로 3~5% CO2 환경을 만들어 37oC에서 18~24시간 배양하였다. 순수 배양된 집락은 위성집락현상, CAMP test 양성 및 유전자 검사법으로 Apx IV 유전자를 검사하여 확인하였다.
배지는 촛불병배양법(Candle jar method)으로 3~5% CO2 환경을 만들어 37oC에서 18~24시간 배양하였다. 순수 배양된 집락은 위성집락현상, CAMP test 양성 및 유전자 검사법으로 Apx IV 유전자를 검사하여 확인하였다. 분리된 균은 총 32점으로 2008년 5점, 2009년 10점, 2010년 17점을 실험에 사용하였다.
초콜렛 한천배지에서 순수 배양된 집락을 채취하여 5 µg/ mL의 NAD를 첨가한 Brain heart infusion(Difco, USA)배지에 접종 후 37oC에서 18시간 배양하였다.
대상 데이터
2008년부터 2010년까지 전국 32개 농장으로부터 호흡기 문제로 코미팜 병성감정실로 검사 의뢰된 육성 및 비육돈의 폐를 세균 분리 재료로 사용하였다. 육안적으로 폐는 섬유소성 흉막염 및 폐출혈 등의 돼지흉막폐렴의 전형적인 소견을 나타내었고, 육안검사 후 병원체를 검출하기 위해서 폐 병변 부위를 무균적으로 채취하였다.
순수 배양된 집락은 위성집락현상, CAMP test 양성 및 유전자 검사법으로 Apx IV 유전자를 검사하여 확인하였다. 분리된 균은 총 32점으로 2008년 5점, 2009년 10점, 2010년 17점을 실험에 사용하였다.
항생제 디스크는 Becton-Dickinson(USA)에서 판매하는 10종 인 penicillin(10 U), ampicillin(10 µg), amoxicillin/clavulanic acid(20/10 µg), neomycin(30 µg), amikacin(30 µg), gentamicin(10 µg), kanamycin(30 µg), trimethoprim/sulfamethoxazole (1.25/23.75 µg), oxytetracycline(30 µg)과 CLSI의 메뉴얼을 참고하여 제작한 enrofloxacin(10 µg), florfenicol(30 µg), ceftiofur(30 µg) 디스크를 사용하였다.
이론/모형
pleuropneumoniae로 확인된 균주에서 혈청형을 구분하기 위해 15가지 혈청형 중 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 12형에 대해 PCR을 실시하였다. 각 혈청형에 대한 primer 정보는 기존에 보고된 문헌을 참고하였다[1, 11, 16, 21]. Premix는 Maxime PCR premix(i-Star Taq) (iNtron Biotech)을 사용하였고, 추출한 DNA 5 µL와 각각의 primer를 1 µL(10 pmol) 및 DNase RNase free water 13 µL를 첨가하여 최종 용량이 20 µL가 되도록 하였다.
각각의 항생제 디스크를 접종한 후 37oC의 3~5% CO2 환경에서 18~24시간 배양한 다음 디스크 주위의 완전 억제존의 직경을 측정하여 내성여부를 판정하였다. 내성의 판정은 Becton-Dickinson 사 메뉴얼과 CLSI 의 기준에 따라 판정하였고, 항생제 감수성 검사의 표준균주로 A. pleuropneumoniae ATCC 27090을 사용하였다. 또한 분리균 중에서 혈청형이 확인된 1, 2, 5, 12형에 한하여 혈청형에 따른 항생제 내성률을 비교하였다.
본 실험에서는 국내 양돈농장에서 분리된 A. pleuropneumoniae 균주를 PCR 법을 이용하여 혈청형 조사를 하였다. 총 32점 중 5형이 16점으로 확인되어 50%로 가장 검출율이 높았고 다음으로 1, 2, 12형 순으로 확인되어 최근에 발표된 문헌과 [17] 비슷한 결과를 보였다.
총 32점의 A. pleuropneumoniae 분리균주에 대한 항생제 감수성 시험은 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)의 방법에 준하여 디스크 확산법으로 실시하였다 [4]. 항생제 디스크는 Becton-Dickinson(USA)에서 판매하는 10종 인 penicillin(10 U), ampicillin(10 µg), amoxicillin/clavulanic acid(20/10 µg), neomycin(30 µg), amikacin(30 µg), gentamicin(10 µg), kanamycin(30 µg), trimethoprim/sulfamethoxazole (1.
성능/효과
Oxytetracycline과 florfenicol에 내성을 나타낸 31점, 8점균주에 대한 내성 결정 유전자를 PCR법으로 조사하였다. Oxytetracycline 내성 결정 유전자 중 tetA, tetB, tetH, tetL, tetO에 한해 검사한 결과, tetB가 22점(68.75%)으로 확인되었고 tetH와 tetO는 각각 6점(19.35%)과 3점(9.67%)으로 확인되었다. tetA와 tetL은 검출되지 않았다.
pleuropneumoniae에 대한 항생제 감수성 검사결과는 Table 1에서 보는 바와 같다. 검사에 사용한 항생제 중 enrofloxacin이 내성을 보이는 균주 없이 가장 효과가 좋은 것으로 나타났다. 그 다음으로 amoxicillin/clavulanic acid, ceftiofur, trimethoprim/sulfamethoxazole 에서 내성률이 10% 미만으로 나타났다.
본 실험에서는 국내 각 지역에서 분리된 총 32개의 균주를 대상으로 12종의 항생제에 대해 감수성 시험을 하였다. 그 결과 enrofloxacin이 내성균 없이 모두 감수성이 있는 것으로 나타났으며 amoxicillin/clavulanic acid, trimethoprim/ sulfamethoxazole, ceftiofur 가 내성률이 10% 미만으로 감수 성이 좋은 약제로 확인되어 기존과 비슷한 결과를 보였다. 그러나 penicillin은 50%로 내성률이 비교적 높게 나타났다.
25%로 가장 많이 검출되었고 다음으로 tetH, tetO, tetA 가 검출되었다 [15]. 본 실험에서 oxytetracycline에 대한 내성을 보이는 31개의 분리주에서 tet 유전자를 검사한 결과, 70% 가까이 tetB 유전자가 검출되어 비슷한 결과를 보였으며 국내에서도 이와 관련하여 내성균이 상당히 많이 퍼져있을 것으로 생각된다.
이 항생제의 지속적인 사용으로 인해 1990년대부터 이 약제에 대한 내성이 높아지고 있다. 본 연구에서 oxytetracycline 에 대한 내성률을 보면 96.9%로 32점 중 31점에서 내성을 나타냈다. 다른 나라에서도 tetracycline 계에서 가장 높은 내성률을 보고하였지만 이 결과는 대만 [20]의 52.
8% 로 확인되었고 이들 균주에서 항생제 내성 유전자인 floR을 검출하였다 [10]. 본 연구에서는 이보다 훨씬 높은 25%의 내성률을 보여 항생제의 사용량과 연관되어 향후 내성을 획득하는 균주가 더 많아질 것으로 생각된다.
그 다음으로 amoxicillin/clavulanic acid, ceftiofur, trimethoprim/sulfamethoxazole 에서 내성률이 10% 미만으로 나타났다. 분리균의 50% 이상이 내성을 나타내는 항생제는 kanamycin, neomycin, amikacin, oxytetracycline이었으며 oxytetracycline은 총 32점의 균주 중 31점이 내성을 보여 96.9%로 가장 높은 내성률을 나타내었다.
pleuropneumoniae 균주를 PCR 법을 이용하여 혈청형 조사를 하였다. 총 32점 중 5형이 16점으로 확인되어 50%로 가장 검출율이 높았고 다음으로 1, 2, 12형 순으로 확인되어 최근에 발표된 문헌과 [17] 비슷한 결과를 보였다. 국내에서 혈청형 1형이 처음 보고된 이후, 본 실험에서도 32점 중 7점이 혈청형 1로 확인되어 5형 다음으로 높게 조사되었다.
총 32점의 A. pleuropneumoniae 분리균주를 대상으로 PCR을 통해 혈청형을 검사한 결과, 5형이 16주(50.0%)로 가장 많았고, 다음으로 1형, 2형 및 12형이 각각 7주 (21.9%), 5주(15.6%), 1주(3.1%)로 확인되었다. 나머지 3주는 혈청형이 확인되지 않았다.
혈청형이 확인된 1, 2, 5, 12형 균주에서 각 항생제별 내성률을 비교한 결과 혈청형에 따른 항생제 내성간의 유의성은 관찰되지 않았다(Table 2).
후속연구
국내에서 혈청형 1형이 처음 보고된 이후, 본 실험에서도 32점 중 7점이 혈청형 1로 확인되어 5형 다음으로 높게 조사되었다. 따라서, 새로운 혈청형의 국내 분포상황 등을 알기 위한 지속적인 연구가 이루어져야 할 것으로 생각된다.
효과적인 예방을 위해서는 나라별로 유행하는 혈청형을 바탕으로 하는 백신 개발이 필요하다. 또한, 시기별로 감수성이 좋은 항생제 종류가 달라지고 있는 만큼 이에 대한 조사 및 연구가 지속적으로 이루어져야 할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
돼지 흉막폐렴은 무엇에 의해 발생하는 질병인가?
돼지 흉막폐렴은 Actinobacillus(A.) pleuropneumoniae 에의해 발생하는 질병으로 섬유소성, 출혈성, 괴사성 폐렴을 일으킨다 [6, 8, 19]. 이 질병은 전 세계적으로 발생하고 있으며 농장에 막대한 경제적 손실을 끼치는 대표적인 호흡기 질병으로 알려져 있다.
돼지 흉막폐렴은 무엇을 일으키는가?
돼지 흉막폐렴은 Actinobacillus(A.) pleuropneumoniae 에의해 발생하는 질병으로 섬유소성, 출혈성, 괴사성 폐렴을 일으킨다 [6, 8, 19]. 이 질병은 전 세계적으로 발생하고 있으며 농장에 막대한 경제적 손실을 끼치는 대표적인 호흡기 질병으로 알려져 있다.
축산농가에서 광범위한 항생제의 사용으로 인한 문제점은?
반면, 축산농가에서 광범위한 항생제의 사용으로 인한 문제점도 나타나고 있다. 항생제 내성을 나타내는 균주가 증가 하고 있고 이는 곧 국민의 건강과 직결된다는 문제로 대두 되고 있다. 또한 세계 각국이 항생제의 오남용에 따른 문제를 지적하고, 이에 따른 항생제의 신중한 사용을 요구하고 있는 실정이다 [7].
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