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문제 정의
- 멜라닌 활성 저해능이 우수한 균으로 선정된 L. plantarumM23의 배양조건을 최적화하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다. Yeast extract의 농도(yeast extract con.
- 본 연구는 tyrosinase 활성 저해효과가 있는 젖산균인 L plantarum M23 균주를 이용하여 멜라닌 형성을 억제하기 위한 최적 발효유 제조조건을 설정하는데 그 목적이 있다. 3수준 4인자 중심합성 계획법을 통해 실험설계하여 반응표면분석법을 사용하였다.
- 본 연구는 tyrosinase 활성 저해효과가 있는 젖산균인 Lactobacillus plantarum M23 균주를 이용하여 멜라닌 형성을 억제하기 위한 최적 발효유 제조조건을 설정하는데 그 목적이 있다.
제안 방법
- plantarumM23의 배양조건을 최적화하기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다. Yeast extract의 농도(yeast extract con.), 포도 첨가량(grape con.), 배양온도(incubation temp.), 배양시간(incubation time)의 4가지 독립변수와 수준을 설정하였으며, 종속변수로는 tyrosinase inhibitory activity(TIA)와 pH 그리고 종합적 기호도를 설정하였다. 통계처리는 MINITAB statistical software(Version 13, Minitab Inc.
- 배양조건을 최적화하기 위하여 4가지 독립변수들의 조합에 대한 종속변수의 반응값을 Table 3에 나타내었다. 독립변수가 4개로써 변수들의 조합이 많기 때문에 2개의 수준에서만 통계분석을 하여 유의성을 알아보았다. 그 결과 pH의 경우 일차항(X1, X2, X3, X4)에서 X3과 X4가 유의수준(P value) 0.
- 실험계획은 중심합성계획(Central composite design, Box and Wilson, 1951)을 적용하였다. 독립변수로는 예비실험과 마찬가지로 yeast extract 농도(%, X1), 포도첨가량 (%,X2), 배양온도(℃, X3), 배양시간(h, X4)을 설정하였다. 독립변수의 중심값과 범위는 예비실험을 바탕으로 설정되었으며, -2, -1, 0, 1, 2의 5가지 수준으로 부호화하였다(Table1).
- 4로 감소할 때까지 배양하였다. 발효가 완료된 발효액 84%에 올리고당 5%, 과당 4%, 포도 농축액 1-3% 및 정제수 4-6%를 첨가하여 호상발효유를 제조한 다음 관능검사를 실시하였다.
- 실온에서 10분간 반응시킨 후 생성된 dopachrome의 양을 microplate reader(Emax, Molecular Devices, USA)를 사용하여 흡광도(S2)를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않고 시료대신 10% 환원탈지유에 lactic acid를 첨가하여 pH 4.4로 맞춘 후 원심분리하여 얻어낸 상층액을 첨가하고 측정한 흡광도(C2, C1)로 다음과 같은 식에 의하여 각각의 tyrosinase 활성 저해율(%)을 다음과 같이 구하였다.
- 0 mM L-Dopa 120 µL와 시료 40 µL를96-well microplate에 넣고 490 nm에서 흡광도(S1)를 측정한 후 tyrosinase mushroom(125 unit/mL)용액을 40 µL 첨가하였다. 실온에서 10분간 반응시킨 후 생성된 dopachrome의 양을 microplate reader(Emax, Molecular Devices, USA)를 사용하여 흡광도(S2)를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않고 시료대신 10% 환원탈지유에 lactic acid를 첨가하여 pH 4.
- 얻어진 상등액을 0.45 µm PVDF syringe filter(whatman Co.)로 여과한 후 tyrosinase 활성 저해율을 측정하였다.
- 원유 95.56-96.04%, 탈지분유 3.85%와 yeast extract를 0.12-0.60% 첨가하고 65℃에서 배합하여 완전히 녹인 후 90℃에서 30분간 살균하였으며, 40℃로 냉각시킨 다음 L.plantarum M23 균주를 1%(v/v)로 접종하고, 배양온도 및 시간 별로 최종 pH가 4.4로 감소할 때까지 배양하였다. 발효가 완료된 발효액 84%에 올리고당 5%, 과당 4%, 포도 농축액 1-3% 및 정제수 4-6%를 첨가하여 호상발효유를 제조한 다음 관능검사를 실시하였다.
- 독립변수의 중심값과 범위는 예비실험을 바탕으로 설정되었으며, -2, -1, 0, 1, 2의 5가지 수준으로 부호화하였다(Table1). 종속변수로는 pH(pH, Y1), 종합적 기호도(score, Y2)와 tyrosinase inhibitory activity(%, Y3)를 설정하였으며, tyrosinase inhibitory activity가 가장 높고 pH는 4.4를 동시에 만족하는 최적화를 실시하였다. 통계 분석 결과를 바탕으로 반응표면 모델식을 구하고 반응표면 그래프(Response surface plots)는 Maple software(Version 7, Waterloo Maple Inc.
대상 데이터
- 원유는 서울우유에서 지원 받았고, 탈지분유는 서울우유,액상과당은 삼양제넥스, 올리고당은 대상(주), yeast extract는 아이씨푸드(주), 포도농축액(65 brix)은 건우 에프피 (주)에서 각각 구입하여 사용하였다. 발효유 제조에 사용한 L.
데이터처리
- 상기에서 얻어진 결과를 바탕으로 구한 반응식은 Table 5와 같다. 실험 결과 얻어진 data를 Minitab software를 이용하여 반응표면분석 한 결과를 바탕으로 적합한 2차 다항식의 모델식을 구하였다. 각각의 독립변수에 대한 각각의 식은 위 모델식과 같으며, 독립변수인 Y3의 결정계수(R2)는 0.
- 제품의 관능검사는 한국식품연구원내의 연구원들로 실시하였으며, 제품의 색, 맛, 조직감, 종합적 기호도를 9점 기호척도법으로 실시하여 그 결과를 통계처리에 의한 유의성 검정을 하였다.
- 4를 동시에 만족하는 최적화를 실시하였다. 통계 분석 결과를 바탕으로 반응표면 모델식을 구하고 반응표면 그래프(Response surface plots)는 Maple software(Version 7, Waterloo Maple Inc., Canada)를 이용하여 3차원으로 나타내었다.
이론/모형
- 본 연구는 tyrosinase 활성 저해효과가 있는 젖산균인 L plantarum M23 균주를 이용하여 멜라닌 형성을 억제하기 위한 최적 발효유 제조조건을 설정하는데 그 목적이 있다. 3수준 4인자 중심합성 계획법을 통해 실험설계하여 반응표면분석법을 사용하였다. 독립변수로는 yeast extract 농도(%, X1), 포도첨가량(%, X2), 배양온도(℃, X3), 배양시간(h, X4)을 설정하였고, 종속변수로는 pH(pH, Y1), 종합적 기호도(score, Y2)와 tyrosinase inhibitory activity(%, Y3)를 설정하였으며, tyrosinase inhibitory activity가 가장 높고 pH는 4.
- Masuda 등(1996)의 방법에 준하여 67 mM phosphate buffer(pH 6.8)에 녹인 8.0 mM L-Dopa 120 µL와 시료 40 µL를96-well microplate에 넣고 490 nm에서 흡광도(S1)를 측정한 후 tyrosinase mushroom(125 unit/mL)용액을 40 µL 첨가하였다.
- 실험계획은 중심합성계획(Central composite design, Box and Wilson, 1951)을 적용하였다. 독립변수로는 예비실험과 마찬가지로 yeast extract 농도(%, X1), 포도첨가량 (%,X2), 배양온도(℃, X3), 배양시간(h, X4)을 설정하였다.
성능/효과
- 교차항은 X4X4, X3X4 이외에는 통계적으로 유의성이 없는 것으로 나타났다. tyrosinase inhibitory activity의 경우는 X3을 제외한 대부분이 일차항에서 유의성을 나타내었으며 종속변수에 대한 영향이 큰 것으로 나타난 반면 교차항은 X3X3를 제외하고 통계적으로 유의성이 없는 것으로 나타났다.
- 독립변수가 4개로써 변수들의 조합이 많기 때문에 2개의 수준에서만 통계분석을 하여 유의성을 알아보았다. 그 결과 pH의 경우 일차항(X1, X2, X3, X4)에서 X3과 X4가 유의수준(P value) 0.05보다 낮게 나와 통계적으로 유의성을 나타내었으며 종속 변수에 대한 영향이 큰 것으로 나타났다. Regression(교차항)은 X3X3 이외에는 통계적으로 유의성이 없는 것으로 나타났다.
- 3수준 4인자 중심합성 계획법을 통해 실험설계하여 반응표면분석법을 사용하였다. 독립변수로는 yeast extract 농도(%, X1), 포도첨가량(%, X2), 배양온도(℃, X3), 배양시간(h, X4)을 설정하였고, 종속변수로는 pH(pH, Y1), 종합적 기호도(score, Y2)와 tyrosinase inhibitory activity(%, Y3)를 설정하였으며, tyrosinase inhibitory activity가 가장 높고 pH는 4.4를 동시에 만족하는 최적화를 실시한 결과 yeast extract 농도는 0.13%, 포도 첨가량은 2.95%, 배양 온도는 37.1℃, 배양 시간은 14.8 h일 때 예상되는 pH는 4.42,기호도는 7.06, tyrosinase inhibitory activity은 86.65%이었으며, 실제 실험 결과 pH는 4.35, 기호도는 6.86, tyrosinase inhibitory activity은 84.05%로서 큰 차이를 나타내지 않았다. 이러한 결과를 토대로 melanin 생합성과정의 key enzyme인 tyrosinase을 활성억제하는 L.
- 8029 h일 때 최적 pH와 종합적 기호도 그리고 tyrosinase inhibitory activity를 보이는 것으로 나타났으며 각각의 그 결과 값은 Table 7과 같다. 예상되는 pH는 4.42, 기호도는 7.06, tyrosinase inhibitory activity은 86.65%이었으며, 실제 실험 결과 pH는 4.35, 기호도는 6.86, tyrosinase inhibitory activity은 84.05%로서 큰 차이를 나타내지 않았다. 반면 Heo 등(2007)은 10% 환원탈지유에 L.
- 05%로서 큰 차이를 나타내지 않았다. 이러한 결과를 토대로 melanin 생합성과정의 key enzyme인 tyrosinase을 활성억제하는 L. plantarum M23을 이용한 발효유는 피부의 미백 작용과 노화 억제 작용에 기여할 것으로 사료되었다.
- 05% 수준에서 유의성이 없는 것으로 나타났다. 종합적 기호도의 경우 역시 Main effects 유의수준이 0.006으로써 유의성이 높게 나타난 반면에 Square와 2-Way interactions(교차항)는 각각 0.065와 0.378을 나타내 유의성이 없는 것으로 나타났다. Tyrosinase inhibitory activity는 pH의 경우와 마찬가지로 Main effects 유의수준이 0.
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