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문제 정의
- 따라서 본 연구는 장미육종 시 향기특성을 선발에 활용하고 꽃 향기의 이용도를 높이고자 향기정도가 다른 품종의 주요 향기성분 차이와 꽃잎 세포 미세구조 관찰의 비교를 통하여 향기 생성과 발산에 관련된 세포 소기관을 구명하고자 실시하였다.
제안 방법
- 05M cacodylate buffer로 10분씩 3회 수세하였다. 1% osmic acid에 1시간 고정하여 증류수로 3회 세척한 후 ethyl alcohol 50, 70, 85, 95, 100%로 농도를 높여가는 에탄올시리즈 방법으로 1시간씩 탈수하였다. 탈수가 끝난 시료는 isoamyl acetate 용액으로 치환한 다음 임계점 건조(HCP-2, Hitach Co)를 실시하고 ion sputter coater(E-1010, Hitachi, Co.
- 잘라낸 절편을 광학현미경으로 관찰하면서 85nm 연속된 초박절편(ultrathin section)을 제작하였다. 150mesh Cu grid 위에 얹어 2% methanolic uranyl acetate - lead citrate 이중염색을 실시하였다. 염색이 끝난 grid를 24시간 동안 실온에서 건조시킨 다음 가속 전압 80kV, high resolution mode에서 검경하였다.
- 꽃은 개화 Ⅳ단계(꽃잎 전체의 전개가 진행된 만개 상태)에서 수확하여 20°C에서 12시간 동안 물올림을 한 후 향기 성분분석과 세포 미세구조 관찰에 사용하였다.
- ) 관찰은 주사전자현미경(SEM) 관찰에서와 같은 방법으로 고정과 탈수과정을 거친 시료내부에 100% propylene oxide 용액을 침투시킨 후 포매제로 100% epon 용액과 경화제를 사용하여 블록을 제작하였다. 시료의 가장자리 1mm 정도 남기고 사각형으로 삭정(trimming) 하여 ultramicrotome을 이용하여 300nm로 박절(thick section)하였다. 잘라낸 절편을 광학현미경으로 관찰하면서 85nm 연속된 초박절편(ultrathin section)을 제작하였다.
- 150mesh Cu grid 위에 얹어 2% methanolic uranyl acetate - lead citrate 이중염색을 실시하였다. 염색이 끝난 grid를 24시간 동안 실온에서 건조시킨 다음 가속 전압 80kV, high resolution mode에서 검경하였다.
- 시료의 가장자리 1mm 정도 남기고 사각형으로 삭정(trimming) 하여 ultramicrotome을 이용하여 300nm로 박절(thick section)하였다. 잘라낸 절편을 광학현미경으로 관찰하면서 85nm 연속된 초박절편(ultrathin section)을 제작하였다. 150mesh Cu grid 위에 얹어 2% methanolic uranyl acetate - lead citrate 이중염색을 실시하였다.
- 주사전자현미경(scanning electron microscope; S-3000N, Hitach Co.) 관찰은 장미 꽃잎 조각을 0.5 × 0.5cm 크기로 자른 후 Karnovsky’s 고정액으로 4°C에서 2시간 1차 고정한 후 0.05M cacodylate buffer로 10분씩 3회 수세하였다.
- 투과전자현미경(transmission electron microscope; H-7500, Hitachi Co.) 관찰은 주사전자현미경(SEM) 관찰에서와 같은 방법으로 고정과 탈수과정을 거친 시료내부에 100% propylene oxide 용액을 침투시킨 후 포매제로 100% epon 용액과 경화제를 사용하여 블록을 제작하였다. 시료의 가장자리 1mm 정도 남기고 사각형으로 삭정(trimming) 하여 ultramicrotome을 이용하여 300nm로 박절(thick section)하였다.
- , 2000). 향기 성분과 함량 분석을 위한 전자코(Fox3000, Alphamos)와 가스크로마토그램(GC/MS) 분석 조건은 Table 2와 같으며 retention time 15.53부터 37.43까지 peak area 1% 이상인 반응을 분석하였다.
- Headspace-SPME은 cycle composer software 프로그램으로 운용하였으며 GC/MS 분석은 Xcalibur software system으로 운용하였다. 향기성분 MS data는 NIST(national institute of standards and technology)와 Wiley library를 적용하여 search하였고 향기성분 함량은 GC peak area 값과 peak area %로 표기하였다.
대상 데이터
- 식물재료는 관능조사 결과 향기가 약한 ‘필립’과 ‘비너스 베리’, 중간 정도인 ‘GR07-135’(선발계통)와 강한 ‘허니블루’ 3품종과 1선발계통(Table 1)을 사용하였다.
이론/모형
- Headspace-SPME은 cycle composer software 프로그램으로 운용하였으며 GC/MS 분석은 Xcalibur software system으로 운용하였다. 향기성분 MS data는 NIST(national institute of standards and technology)와 Wiley library를 적용하여 search하였고 향기성분 함량은 GC peak area 값과 peak area %로 표기하였다.
성능/효과
- GC/MS를 이용하여 품종과 선발계통별 향기 성분 분석 결과 주요성분은 ‘필립’의 경우 3,5-dimethoxytoluene(DMT)과 benzene,1,3,5-trimethoxy 성분이었으며, ‘비너스베리’는 megastigma-4,6(Z),8(E)-triene 성분이었고, ‘GR07-135’는 DMT, benzene,1-ethenyl-4-methoxy 및 phenylethylalcohol 성분이었으며, ‘허니블루’는 germacrene-D와 DMT 성분이었다(Table 3).
- GC/MS를 이용한 품종별 총 향기함량(relative abundance)은 ‘필립’과 ‘비너스베리’는 각각 2.52 × 107, 3.66 × 107 peak area이었으며, ‘GR07-135’는 30.54 × 107 peak area이었고, ‘허니블루’는 64.13 × 107 peak area로 나타났다(Fig. 1 and Table 3).
- 그러나 향축면 표피 세포의 높이는 향기가 약한 ‘필립’과 ‘비너스베리’는 각각 31.37µm, 30.72µm이었고, 향기가 중간인 ‘GR07-135’는 36.15µm이었으며, 향기가 강한 ‘허니블루’는 40.81µm로서 향기가 강한 품종일수록 높게 나타났다(Fig. 4 and Table 4).
- 이상의 결과를 종합해 보면 향기가 강하게 발산되는 장미 품종은 꽃잎의 향축면 표피세포 내의 색소체에서 DMT 성분과 germacrene-D, nerol, β-citronellol, geraniol 등의 terpene 그룹의 성분이 생성되고 액포에서 분리 저장하여 향을 발산한다는 것을 알 수 있었다. 따라서 방향성 장미육종과 장미 꽃잎을 산업화에 이용할 때에는 꽃잎의 세포학적 특성에 따라 향기 생성에 관련된 색소체가 많으며, 향기를 분리 저장하는 큰 액포가 많고, 강한 향을 발산하는 향기성분을 많이 발현될 수 있도록 이들 소기관들과 성분생성과 관련된 향기유전자의 발현 효소가 존재하는 품종들을 이용하는 것이 유리할 것으로 보인다.
- 본 실험에서는 향기가 강한 ‘허니블루’는 큐티클층에 왁스층이 얇거나 매우 적어 투기성이 높고 표피 세포 내에서 합성이 이루어져서 생성된 향기의 발산을 저해하는 정도가 적어 향기가 강하게 발산될 가능성이 있다고 보인다.
- 이상의 결과를 종합해 보면 향기가 강하게 발산되는 장미 품종은 꽃잎의 향축면 표피세포 내의 색소체에서 DMT 성분과 germacrene-D, nerol, β-citronellol, geraniol 등의 terpene 그룹의 성분이 생성되고 액포에서 분리 저장하여 향을 발산한다는 것을 알 수 있었다.
- Caissard(2004)의 연구결과에서는 향기가 최대로 발산되는 단계에서 단단한 소용돌이 모양 구조(tightly whorled structure)와 색소체낭(plastoglobule)이 관찰되었으며, 스트로마(stroma)에 있는 오일 droplets 혹은 색소체낭(plastoglobules)이 관찰되는 것으로 보아 정유(essential oils)의 합성은 색소체(plastids)에 기인하고, 색소체에서 합성된 향기 등의 2차 대사산물은 액포에서 분리 저장하고 있다고 하였다. 이에 따라 본 실험의 결과에서와 같이 장미 꽃잎의 향축면 표피 세포 내에 색소체, 색소체낭 및 액포가 많음이 향기가 강하게 발산되는 것과 매우 관련이 높다는 것을 확인할 수 있었다.
- 장미 꽃잎 향축면 표피 세포를 투과전자현미경(TEM)을 통하여 세부 미세구조를 관찰한 결과 3품종과 1선발계통 모두 세포벽이 있었다(Figs. 6A to 6D). ‘허니블루’를 제외한 2품종과 1선발계통은 왁스층으로 덮힌 파도모양의 큐티클 층이 있었고 향기가 강한 ‘허니블루’는 큐티클층이 매우 얇거나 적었다.
- 전자코를 이용한 품종과 선발계통 별 향기패턴의 주 성분분석에서 ‘필립’과 ‘GR07-135’의 좌표는 서로 가까이 위치하여 주요 향기 성분이 비슷하였으며, 향기가 가장 강한 ‘허니블루’는 향기가 약한 ‘비너스베리’와 좌표가 멀게 위치하여 향기 주요성분과 향기 정도의 차이가 있었다(Fig. 2).
- 품종과 선발계통 별 장미 꽃잎의 주사전자현미경(SEM) 관찰 결과 향기가 발산되는 위치로 알려진 향축면 표피 세포가 있었다. 꽃잎 단면은 향기정도와 관계없이 3품종과 1선발계통 모두 향축면 표피 세포(adxial epidermal cells), 해면 유조직(spongy parenchyma) 배축면 표피 세포(abaxial epidermal cells)가 관찰되었는데(Fig.
- 품종과 선발계통별 향기정도는 관능조사 결과와 같이 ‘필립’과 ‘비너스베리’는 약하였으며, ‘GR07-135’는 중간 정도이었고, ‘허니블루’는 강하였다.
- 품종별 10% 이상인 향기의 주요 성분은 ‘필립’은 DMT 성분이 0.86 × 107 peak area, benzene,1,3,5-trimethoxy 성분이 0.62 × 107 peak area로 2가지 성분이 각각 17.8%, 12.9%를 차지하였으며, 나머지 2,6,10,10-tetramethyl-1-oxa-spiro[4.5] dec-6-ene, Megastigma-4,6(Z),8(E)-triene, trans-caryophyllene 및 3,5,7-tetramethyladamantane 성분 등 7가지 성분으로 조성되어 있었다.
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