닭우모 단백질 가수분해물을 처리한 토마토 근권토양 내 세균군집의 계통 해석 Phylogenetic Analysis of Bacterial Populations in a Tomato Rhizosphere Soil Treated with Chicken Feather Protein Hydrolysate원문보기
케라틴 단백질 분해 세균 Chryseobacterium sp. FBF-7(KACC 91463P)을 이용하여 대량생산한 닭우모 단백질 가수분해물(CPH)을 토마토에 처리한 결과, 토마토 줄기와 뿌리의 생장이 현저하게 증가되었다. 닭우모 가수분해물을 처리한 토마토 근권토양 내 세균군집 변동에 대한 계통학적 해석을 위하여 16S rRNA 유전자 서열을 기반으로 454 pyrosequencing을 수행하였다. 가수분해물을 처리하지 않은 토마토 근권토양(NCPH)의 16S rRNA 유전자 염기서열(3,281 reads)과 가수분해물을 처리한 토마토 근권토양(TCPH)의 16S rRNA 유전자 염기서열(2,167 reads)은 각각 6.33과 6.54의 다양성 지수를 나타내어 세균군집의 다양성에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 각 토마토 근권토양에는 총 19개의 문(phyla)의 세균이 존재하였고, 이중의 약 40%가 Proteobacteria이었다. Proteobacteria의 Bradyrhizobiaceae에 속하는 Bradyrhizobium, Agromonas, Nitrobacter 그리고 Afipia (BANA group)는 NCPH와 TCPH의 모든 근권토양에서 우점을 이루어 닭우모 가수분해믈 처리에 의해 토양 토착세균 군집에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.
케라틴 단백질 분해 세균 Chryseobacterium sp. FBF-7(KACC 91463P)을 이용하여 대량생산한 닭우모 단백질 가수분해물(CPH)을 토마토에 처리한 결과, 토마토 줄기와 뿌리의 생장이 현저하게 증가되었다. 닭우모 가수분해물을 처리한 토마토 근권토양 내 세균군집 변동에 대한 계통학적 해석을 위하여 16S rRNA 유전자 서열을 기반으로 454 pyrosequencing을 수행하였다. 가수분해물을 처리하지 않은 토마토 근권토양(NCPH)의 16S rRNA 유전자 염기서열(3,281 reads)과 가수분해물을 처리한 토마토 근권토양(TCPH)의 16S rRNA 유전자 염기서열(2,167 reads)은 각각 6.33과 6.54의 다양성 지수를 나타내어 세균군집의 다양성에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 각 토마토 근권토양에는 총 19개의 문(phyla)의 세균이 존재하였고, 이중의 약 40%가 Proteobacteria이었다. Proteobacteria의 Bradyrhizobiaceae에 속하는 Bradyrhizobium, Agromonas, Nitrobacter 그리고 Afipia (BANA group)는 NCPH와 TCPH의 모든 근권토양에서 우점을 이루어 닭우모 가수분해믈 처리에 의해 토양 토착세균 군집에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.
As a result of conducting a cultural experiment of tomato using chicken feather protein hydrolysate (CPH) which was mass produced by keratin protein degrading bacterium Chryseobacterium sp. FBF-7 (KACC 91463P), we found that the stem and the root of tomato showed significant improvement in growth. F...
As a result of conducting a cultural experiment of tomato using chicken feather protein hydrolysate (CPH) which was mass produced by keratin protein degrading bacterium Chryseobacterium sp. FBF-7 (KACC 91463P), we found that the stem and the root of tomato showed significant improvement in growth. For the purpose of phylogenic interpretation, a comparison was drawn between the effect of CPH, a treated CPH and untreated, on the changes of bacterial populations by 454 pyrosequencing based on 16S rRNA gene sequences. Tomato rhizosphere soil untreated with CPH (NCPH) showed 6.54 Shannon index from 3,281 sequence reads, and the rhizosphere soil treated with CPH (TCPH) showed 6.33 Shannon index from 2,167 sequence reads, displaying that it does not affect the diversity. Bacterial populations were composed of 19 phyla in the rhizosphere soil, and the phylum Proteobacteria occupied 40% of total bacterial populations. Bradyrhizobium, Agromonas, Nitrobacter, and Afipia (BANA group) which belong to Bradyrhizobiaceae were abundant and commonly detected in both the treated and untreated soils, suggesting the dominance of bacterial group in rhizosphere soil. The results obtained showed that CPH treatment does not affect the indigenous bacterial populations present in the rhizosphere soil.
As a result of conducting a cultural experiment of tomato using chicken feather protein hydrolysate (CPH) which was mass produced by keratin protein degrading bacterium Chryseobacterium sp. FBF-7 (KACC 91463P), we found that the stem and the root of tomato showed significant improvement in growth. For the purpose of phylogenic interpretation, a comparison was drawn between the effect of CPH, a treated CPH and untreated, on the changes of bacterial populations by 454 pyrosequencing based on 16S rRNA gene sequences. Tomato rhizosphere soil untreated with CPH (NCPH) showed 6.54 Shannon index from 3,281 sequence reads, and the rhizosphere soil treated with CPH (TCPH) showed 6.33 Shannon index from 2,167 sequence reads, displaying that it does not affect the diversity. Bacterial populations were composed of 19 phyla in the rhizosphere soil, and the phylum Proteobacteria occupied 40% of total bacterial populations. Bradyrhizobium, Agromonas, Nitrobacter, and Afipia (BANA group) which belong to Bradyrhizobiaceae were abundant and commonly detected in both the treated and untreated soils, suggesting the dominance of bacterial group in rhizosphere soil. The results obtained showed that CPH treatment does not affect the indigenous bacterial populations present in the rhizosphere soil.
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제안 방법
본 연구에서는 케라틴 단백질 분해세균 Chryseobacterium sp. FBF-7 균주에 의해 생산된 닭우모 단백질 가수분해물을 작물생육용 친환경유기농자재로의 활용 가능성을 검토하기 위해 토마토 재배시험을 통해 생육효과를 조사하고 닭우모 단백질 가수분해물을 처리한 토마토 근권토양 내 세균군집 변동을 pyrosequencing 기법을 이용하여 해석하였다.
PCR 반응은 1× EF-Taq buffer (Solgent, Korea), 2.5 unit의 EF-Taq polymerase (Solgent), 0.2 mM dNTP mix, 0.1 μM의 primer, 100 ng의 template DNA를 사용하였다.
1 μM의 primer, 100 ng의 template DNA를 사용하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 반응한 다음 94℃에서 denaturation 40 초, 55℃에서 annealing 40초, 72℃에서 extention 1분을 30회 반복하고, 72℃에서 7분간 final extention의 조건으로 PCR (GeneAMPR PCR System 9700, Applied Biosystems) 반응을 하였다. PCR 증폭산물은 0.
PCR 증폭산물은 0.8%의 agarose gel, 0.5× TAE buffer (0.045 M Tris-borate, 0.001 M EDTA)에서 100 V, 25 mA로 30 분간 전기영동한 후 ethidium bromide (EtBr)에 15분간 염색하여 UV (Mupid-21, Gel documentation system, Bio-Rad)하에서 추출 여부를 확인하고 PCR purification kit (Qiagen Inc.)를 이 용하여 정제하였다.
Pyrosequencing을 통해 토마토 근권토양으로부터 얻어진 염기서열 데이터는 우선 GS FLX 소프트웨어(Roche)를 이용하여 염기서열의 adaptor와 PCR primer 부위를 제거하였다. 부정확하게 결정된 염기서열과 PCR 과정에서 발생할 수 있는 염기서열 오류를 최소화하기 위해 길이가 짧은 염기서열(<300 bp)을 제거하였다.
닭우모 단백질 가수분해물 처리 시험구에는 가수분해물을 1/50로 희석하여 300 ml씩 15일 간격으로 4회 처리하고, 가수분해물을 처리하지 않은 대조구에는 동량의 물을 처리하였다. 가수분해물 처리 시험구와 대조구는 9반복으로 수행하였고, 60일 동안 토마토를 재배한 후 각 시험구별로 줄기 길이, 직경, 두께, 마디수, 뿌리의 건조중량을 측정하였다. 시험결과는 Duncan 다중검정(SAS Institute, 1988)으로 5% 수준에서 처리간 유의성을 검정하였다.
각 토양시료로부터 획득된 16S rRNA sequence library로 부터 세균군집의 계통해석을 수행하였다. 유묘정식 직후의 대조구 토양(control) 내 세균군집은 총 19개의 문(phylum)으로 분류되었다.
FBF-7 (KACC 91463P)을 이용하여 대량생산한 닭우모 단백질 가수분해물(CPH)을 토마토에 처리한 결과, 토마토 줄기와 뿌리의 생장이 현저하게 증가되었다. 닭우모 가수분해물을 처리한 토마토 근권토양 내 세균군집 변동에 대한 계통학적 해석을 위하여 16S rRNA 유전자 서열을 기반으로 454 pyrosequencing을 수행하였다. 가수분해물을 처리하지 않은 토마토 근권토양(NCPH)의 16S rRNA 유전자 염기서열(3,281 reads)과 가수분해물을 처리한 토마토 근권토양(TCPH)의 16S rRNA 유전자 염기서열 (2,167 reads)은 각각 6.
) 유묘를 정식하였다. 닭우모 단백질 가수분해물 처리 시험구에는 가수분해물을 1/50로 희석하여 300 ml씩 15일 간격으로 4회 처리하고, 가수분해물을 처리하지 않은 대조구에는 동량의 물을 처리하였다. 가수분해물 처리 시험구와 대조구는 9반복으로 수행하였고, 60일 동안 토마토를 재배한 후 각 시험구별로 줄기 길이, 직경, 두께, 마디수, 뿌리의 건조중량을 측정하였다.
2, 90 mm Ø)에 걸러 잔존 우모분을 제거한 후 4℃, 7,920×g (Supra 22K, Hanil, Korea)로 20분간 원심 분리하여 상층액을 추출하고 4℃에 냉장 보관하였다. 닭우모 단백질 가수분해물에 함유된 아미노산의 함량과 조성을 분석하기 위하여 추출한 가수 분해물에 6 N HCl을 1:1로 넣고 N2 gas로 2분간 치환시킨 후 110℃에서 12시간 동안 처리하고 감압하여 HCl을 제거하였다. 상기의 시료에 0.
부정확하게 결정된 염기서열과 PCR 과정에서 발생할 수 있는 염기서열 오류를 최소화하기 위해 길이가 짧은 염기서열(<300 bp)을 제거하였다. 또한, Mothur version 1.30.1 (Schloss et al., 2009) 를 이용하여 chimera로 의심되는 염기서열도 제거하였다. 이렇게 전처리를 마친 염기서열에 대해 RDP Classifier (Cole et al.
토양시료로부터 DNA 추출은 Takada와 Matsumoto (2004) 의 bead beating 방법을 개량한 ISOIL kit를 이용하였다. 매뉴얼에 따라 ISOIL kit (Nippon Kit Co., Japan)를 이용하여 대조구 토양, 닭우모 단백질 가수분해물을 처리한 토마토 근권토양, 가수분해물을 처리하지 않은 무처리구 토마토 근권토양 시료로부터 genomic DNA를 추출하였다. 세균의 16S rRNA 유전자의 PCR 증폭을 위해 universal primer인 27F (5′-AGAGTTTGATC MTGGCTCAG-3′)와 518R (5′-ATTACCGCGGCTGCTGG3′)을 이용하였다.
멸균한 토양을 포트(15 cm×15 cm Ø)에 1.5 kg씩 넣고 시험작물로 토마토(Lycopersicon esculentum Mill.) 유묘를 정식하였다.
부정확하게 결정된 염기서열과 PCR 과정에서 발생할 수 있는 염기서열 오류를 최소화하기 위해 길이가 짧은 염기서열(<300 bp)을 제거하였다.
세균의 16S rRNA 유전자의 PCR 증폭을 위해 universal primer인 27F (5′-AGAGTTTGATC MTGGCTCAG-3′)와 518R (5′-ATTACCGCGGCTGCTGG3′)을 이용하였다.
염기서열은 3% cutoff를 기준으로 Mothur를 이용해 rarefaction curve 분석을 실시하여 pyrosequencing으로부터 얻은 염기서열의 수가 세균군집의 다양성을 충분히 설명하고 있는지 비교하였다(Fig. 3). 대조구토양의 경우 곡선이 plateau에 도달하여 분석 에 이용된 2,440개의 염기서열수가 시료에 포함된 모든 종을 확인하기에 충분하였다.
)를 이 용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 이용하여 단일 가닥 DNA library 제작과 emulsion PCR을 진행한 후 pyrosequencing 반응을 진행하였다. 상기에 열거한 pyrosequencing에 요구되는 모든 반응은 염기서열 분석기 제조사(Roche)의 방법에 따라 Macrogen (Korea)에서 실시하였으며, GS FLX Titanium system (Roche, Germany)를 이용하여 염기서열을 결정하였다.
토마토 유묘 정식 후 15일, 30일, 45일째에 1/50로 희석한 CPH를 토양에 관주 처리하여 60일간 재배하였다. 온실에서 60 일간 포트 재배 후 각 시험구별로 토마토 식물체의 초장, 지상부 생체중, 줄기 직경, 뿌리 건중량을 측정한 결과를 Table 1에 나타내었다.
토마토 유묘를 정식한 직후의 토양을 대조구(control)로 설정하고, CPH를 처리하지 않은 토양에서 60일간 재배한 근권토양 (NCPH)과 CPH를 처리하고 60일간 재배한 근권토양(TCPH) 시료로부터 genomic DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 대상으로 16S rRNA 유전자를 증폭하여 pyrosequencing을 수행하였다.
토마토 재배시험은 충남 부여 토마토시험장의 온실에서 수행하였다. 토마토 포트 재배시험에 사용한 토양은 토양미생물에 의한 영향을 최소화하기 위해 121℃에서 1시간 동안 멸균하여 실험에 사용하였다.
, 2005)를 이용해 계통분류를 하였다(bootstrap cutoff=80%). 한편, 군집의 다양성을 분석하기 위해 RDP Aligner와 RDP Mothur: column distance matrix를 이용하여 distance matrix를 만들었으며, 이를 Mothur average clustering를 사용하여 observed operational taxonomic unit (OTU), Chao1 richness estimate, Shannon index 등의 다양성 지수들과 rarefaction curve 및 rank abundance curve 분석을 하였다.
대상 데이터
닭우모 단백질 가수분해물(chicken feather protein hydrolysate, CPH)을 생산하기 위하여 양계 축산물 가공 판매 및 사료 제조업 체인 ㈜하림에서 배출되는 닭 우모분을 사용하였다. 가수분해물의 생산을 위해서는 2톤 규모의 발효기에 우모분배지(2% rice bran, 2% glucose, 2% 닭 우모분, pH 7.
토마토 유묘 이식에 사용한 토양을 대조구 토양으로 채취하 였다. 토마토 재배 60일 후에 닭우모 단백질 가수분해물을 처리 하지 않은 무처리구와 닭우모 단백질 가수분해물을 처리한 시험구의 토마토뿌리로부터 약 5 cm 주변의 토양을 근권 토양시료로 채취하였다.
토마토 유묘 이식에 사용한 토양을 대조구 토양으로 채취하 였다. 토마토 재배 60일 후에 닭우모 단백질 가수분해물을 처리 하지 않은 무처리구와 닭우모 단백질 가수분해물을 처리한 시험구의 토마토뿌리로부터 약 5 cm 주변의 토양을 근권 토양시료로 채취하였다. 각 근권 토양시료는 약 50 g씩 총 9개 포트에서 채취하여 혼합한 후 4℃에 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다.
토마토 재배시험은 충남 부여 토마토시험장의 온실에서 수행하였다. 토마토 포트 재배시험에 사용한 토양은 토양미생물에 의한 영향을 최소화하기 위해 121℃에서 1시간 동안 멸균하여 실험에 사용하였다. 멸균한 토양을 포트(15 cm×15 cm Ø)에 1.
데이터처리
가수분해물 처리 시험구와 대조구는 9반복으로 수행하였고, 60일 동안 토마토를 재배한 후 각 시험구별로 줄기 길이, 직경, 두께, 마디수, 뿌리의 건조중량을 측정하였다. 시험결과는 Duncan 다중검정(SAS Institute, 1988)으로 5% 수준에서 처리간 유의성을 검정하였다.
이론/모형
정제된 PCR 산물을 이용하여 단일 가닥 DNA library 제작과 emulsion PCR을 진행한 후 pyrosequencing 반응을 진행하였다. 상기에 열거한 pyrosequencing에 요구되는 모든 반응은 염기서열 분석기 제조사(Roche)의 방법에 따라 Macrogen (Korea)에서 실시하였으며, GS FLX Titanium system (Roche, Germany)를 이용하여 염기서열을 결정하였다.
이렇게 전처리를 마친 염기서열에 대해 RDP Classifier (Cole et al., 2005)를 이용해 계통분류를 하였다(bootstrap cutoff=80%).
토양시료로부터 DNA 추출은 Takada와 Matsumoto (2004) 의 bead beating 방법을 개량한 ISOIL kit를 이용하였다. 매뉴얼에 따라 ISOIL kit (Nippon Kit Co.
성능/효과
CPH 무처리구(NCPH)는 초장 114 cm, 지상부 생체중 109 g, 줄기 직경 9.5 mm, 뿌리 건중량 4.4 g이었으며, CPH 처 리구(TCPH)는 초장 127 cm, 지상부 생체중 129 g, 줄기 직경 10.7 mm, 뿌리 건중량 7.6 g으로 Duncan의 다중 검정 결과, 5% 수준에서 유의성이 인정되었고, CPH 처리구는 무처리구에 비해 토마토 지상부의 생장은 6–16%, 뿌리의 생장은 70% 향상되는 효과가 있었다.
케라틴 단백질 분해 세균 Chryseobacterium sp. FBF-7 (KACC 91463P)을 이용하여 대량생산한 닭우모 단백질 가수분해물(CPH)을 토마토에 처리한 결과, 토마토 줄기와 뿌리의 생장이 현저하게 증가되었다. 닭우모 가수분해물을 처리한 토마토 근권토양 내 세균군집 변동에 대한 계통학적 해석을 위하여 16S rRNA 유전자 서열을 기반으로 454 pyrosequencing을 수행하였다.
FBF-7 균주의 최적배지를 검토한 결과, 2% 닭 우모분에 2% 쌀 겨와 2% glucose를 첨가한 배지에서 8.81×108 CFU/ml의 균체 밀도에 도달하였다.
NCPH 내에는 Proteobacteria에 속하는 계통군이 41.5%로 분포율이 가장 높았고, Acidobacteria (15%), Gemmatimonadetes(9.1%), Actinobacteria (8.3%), Bacteroidetes (5.6%), Firmicutes (4.8%), Chloroflexi (4.7%), Nitrospira (2.4%), Planctomycetes (1.5%), Verrucomicrobia (1.1%), Cyanobacteria (0.2 %), WS3 (0.1%), OD1 (0.1%), CS (0.1%), TM6 (0.1%), Deinococcus-Thermus (0.03%) 문이 분포하였다. TCPH 내 계통군은 Proteobacteria (39%) 문이 우점 분류군이었으며, Acidobacteria (18%), Firmicutes (6.
각 토마토 근권토양에는 총 19개의 문(phyla)의 세균이 존재하였고, 이중의 약 40%가 Proteobacteria이었다. Proteobacteria 의 Bradyrhizobiaceae에 속하는 Bradyrhizobium, Agromonas, Nitrobacter 그리고 Afipia (BANA group)는 NCPH와 TCPH의 모든 근권토양에서 우점을 이루어 닭우모 가수분해믈 처리에 의해 토양 토착세균 군집에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.
03%) 문이 분포하였다. TCPH 내 계통군은 Proteobacteria (39%) 문이 우점 분류군이었으며, Acidobacteria (18%), Firmicutes (6.8%), Gemmatimonadetes (6.9%), Actinobacteria (5.5%), Bacteroidetes (5.5%), Chloroflexi (5%), Nitrospira (2.7%), TM7 (2.3%), Verrucomicrobia (1.6%), Planctomycetes (1.8%), WS3 (0.5%), OD1 (0.2%), OP11 (0.13%), Cyanobacteria (0.1%) 문으로 확인되었다(Fig. 4). 이상, 토마토 재배 60일 후 NCPH와 TCPH에서 Proteobacteria, Acidobacteria, Gemmatimonadetes, Actinobacteria 문이 전체 세균군집의 5.
토마토 생육과 더불어 발달된 근권토양 내 우점균인 Proteobacteria 문(4 class, 26 order) 중 Rhodobacteriales, Caulobacterales, Rhizobiale, Sphingomonadales, Rhodospirillales, Methylophilales, Nitrosomonadales, Neisseriales, Rhodocyclales, Burkholderiales, Enterobacteriales, Aeromonadales, Pseudomonadales, Alteromonadales, Legionellales, Xathomonadales, Desulfusomonadales, Myxococales는 모든 시험구 토양에 분포하는 세균군집으로 확 인되었다. TCPH에서는 Chromatiales 목의 계통군이 특징적으로 나타났으며, Sphingomonadales, Rhodospirillales, Pseudomonadales 목의 계통군은 증가되는 세균군집으로 확인되었고, Lysobacter, Pseudofulvimonas, Arenimonas, Xanthmonas을 포함하는 Xathomonadales 목과 Desulfuromonads, Geobacter을 포함하는 Desulfuromonadales 목 그리고 Myxococcus를 포함하는 Myxococcales 목에 속하는 계통군은 감소되는 세균군집으로 확인되었다(Fig. 5).
닭우모 가수분해물을 처리한 토마토 근권토양 내 세균군집 변동에 대한 계통학적 해석을 위하여 16S rRNA 유전자 서열을 기반으로 454 pyrosequencing을 수행하였다. 가수분해물을 처리하지 않은 토마토 근권토양(NCPH)의 16S rRNA 유전자 염기서열(3,281 reads)과 가수분해물을 처리한 토마토 근권토양(TCPH)의 16S rRNA 유전자 염기서열 (2,167 reads)은 각각 6.33과 6.54의 다양성 지수를 나타내어 세균군집의 다양성에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 각 토마토 근권토양에는 총 19개의 문(phyla)의 세균이 존재하였고, 이중의 약 40%가 Proteobacteria이었다.
54의 다양성 지수를 나타내어 세균군집의 다양성에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 각 토마토 근권토양에는 총 19개의 문(phyla)의 세균이 존재하였고, 이중의 약 40%가 Proteobacteria이었다. Proteobacteria 의 Bradyrhizobiaceae에 속하는 Bradyrhizobium, Agromonas, Nitrobacter 그리고 Afipia (BANA group)는 NCPH와 TCPH의 모든 근권토양에서 우점을 이루어 닭우모 가수분해믈 처리에 의해 토양 토착세균 군집에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.
Rarefaction curve와 마찬가지로 토마토 재배 60일 후 발달된 근권토양 내 다양성 지표(index)는 크게 증가하였다. 단백질 가수분해물을 처리하지 않은 근권토양과 가수분해물을 처리한 근권토양의 다양성 지수 비교를 위하여 Mothur를 이용하여 1,776 reads로 표준화한 후 shannon diversity index를 확인한 결과, 각각 4.93과 4.84의 다양성 지수를 나타내었다. 또한, mothur의 Libshuff 프로그램을 이용하여 NCPH와 TCPH의 다양성에 대한 유의성을 확인한 결과, 두 시험구는 통계적으로 유사한 군집 구조를 나타내어(P<0.
04%) 문이 분포하였다. 대조구 토양 내 전체군집의 80% 이상이 Firmicutes 문으로 나타난 결과는 닭우모가수분해물 처리에 의한 식물생육촉진효과를 검정함에 있어 토양미생물에 의한 효과를 배제하기 위해 유묘정식전에 토양을 멸균하고 식히는 과정에 서 토양 및 공기 중에 열에 내성을 갖고 빠르게 생장하는 세균이 다수 존재한 것으로 판단되었다.
3). 대조구토양의 경우 곡선이 plateau에 도달하여 분석 에 이용된 2,440개의 염기서열수가 시료에 포함된 모든 종을 확인하기에 충분하였다. 반면, 가수분해물을 처리하지 않은 토양과 가수분해물을 처리한 근권 토양의 rarefaction curve는 plateau에 도달하지 못해 세균군집의 다양성을 충분히 예측하기 위해서는 더 많은 염기서열의 확보가 필요할 것으로 판단되었다.
반면, 가수분해물을 처리하지 않은 토양과 가수분해물을 처리한 근권 토양의 rarefaction curve는 plateau에 도달하지 못해 세균군집의 다양성을 충분히 예측하기 위해서는 더 많은 염기서열의 확보가 필요할 것으로 판단되었다. 또한, abundance-based coverage estimator (ACE) index, Chao1 richness index 및 Shannon diversity index를 계산한 결과, 대조구토양에서는 232 OTU, shannon diversity index 2.41로 나타났으며, NCPH에서는 1,242 OUT, shannon diversity index 6.54로 확인되었다(Table 3). TCPH의 경우, 931 OTU, shannon diversity index 6.
또한, mothur의 Libshuff 프로그램을 이용하여 NCPH와 TCPH의 다양성에 대한 유의성을 확인한 결과, 두 시험구는 통계적으로 유사한 군집 구조를 나타내어(P<0.01), 세균 군집의 다양성에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.
특히, Rhizobiales 목에 속하는 계통군은 TCPH와 NCPH 토양 모두에서 우점을 이루는 세균군집으로 확인되었다. 모든 근권토양 내 Rhizobiales 목에 속하는 세균군집은 10개의 family로 분류되었고, 이 중 Bradyrhizobiaceae가 약 45%로 가장 높은 분포를 나타내었다(Fig. 6). 우점군집으로 확인된 Bradyrhizobiaceae 에 대하여 계통분석한 결과, Bradyrhizobium (n=25), Agromonas (n=2), Nitrobacter (n=96), Afipia (n=15) 속으로 분류되었다.
, 2011). 본 균주의 닭우모 단백질 가수분해물 대량생산을 위한 최적배지와 배양조건을 최적화한 결과 균체밀도를 향상시킬 수 있었으며, 닭 우모분이 90% 이상 분해됨으로써 가수 분해물로 생성되는 아미노산의 함량이 증수된 것으로 판단된다.
상기의 최적배지를 이용해 2톤 규모의 발효 조에서 30℃, 60 rpm으로 4일간 배양한 결과, 91.2%의 우모 분 해능(자료 미제시)을 나타내었으며, 대량 생산한 CPH에 함유된 아미노산 총 함량을 측정한 결과, 2,495 μmol/ml로 실험실 규모 에 비해 50% 이상 증가되었다.
6). 우점군집으로 확인된 Bradyrhizobiaceae 에 대하여 계통분석한 결과, Bradyrhizobium (n=25), Agromonas (n=2), Nitrobacter (n=96), Afipia (n=15) 속으로 분류되었다. 이를 Bradyrhizobium, Agromonas, Nitrobacter, Afipia 속에 속하는 각 세균그룹은 NCPH과 TCPH 근권토양 모두에 분포하여 가수분해물(CPH) 처리에 의해 우점군집인 Bradyrhizobiaceae 세균군집에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다(Fig.
우점군집으로 확인된 Bradyrhizobiaceae 에 대하여 계통분석한 결과, Bradyrhizobium (n=25), Agromonas (n=2), Nitrobacter (n=96), Afipia (n=15) 속으로 분류되었다. 이를 Bradyrhizobium, Agromonas, Nitrobacter, Afipia 속에 속하는 각 세균그룹은 NCPH과 TCPH 근권토양 모두에 분포하여 가수분해물(CPH) 처리에 의해 우점군집인 Bradyrhizobiaceae 세균군집에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다(Fig. 7).
이상, 본 연구에서는 닭우모분으로부터 생산한 닭우모 단백질 가수분해물(CHP)을 토마토 작물에 처리한 결과, 토마토 작물의 지상부와 지하부의 생장을 크게 향상시켜 생장효과가 매우 우수한 것으로 확인되었다. 또한, CHP는 토양내 세균군집 다양성 및 주요 토착미생물 군집인 Bradyrhizobiaceae에 영향을 미치지 않은 것으로 판단되어 향후 CHP를 작물생육용 친환경 자재로 활용 가능할 것으로 평가되었다.
이상, 토마토 재배 60일 후 NCPH와 TCPH에서 Proteobacteria, Acidobacteria, Gemmatimonadetes, Actinobacteria 문이 전체 세균군집의 5.5–41.5%를 나타내는 주요 계통군으로 확인되었다.
유묘정식 직후의 대조구 토양(control) 내 세균군집은 총 19개의 문(phylum)으로 분류되었다. 전체 염기서열의 80.3%가 Firmicutes 문으로 가장 우점하였으며, Proteobacteria (7.8%), Actinobacteria (7.6%), Bacteroidetes (0.9%), Planctomycetes (0.7%), Fusobacteria (0.5%), Chloroflexi (0.4%), Acidobacteria (0.3%), Cyanobacteria (0.2%), Verrucomicrobia (0.3%), Deinococcus-Thermus (0.1%), OD1 (0.1%), Elusimicrobia (0.1%), BRC1 (0.1%), Chlorobi (0.1%), Armatimonadetes (0.1%), OP3 (0.04%), Nitrospirae (0.04%), Gemmatimonadetes (0.04%) 문이 분포하였다. 대조구 토양 내 전체군집의 80% 이상이 Firmicutes 문으로 나타난 결과는 닭우모가수분해물 처리에 의한 식물생육촉진효과를 검정함에 있어 토양미생물에 의한 효과를 배제하기 위해 유묘정식전에 토양을 멸균하고 식히는 과정에 서 토양 및 공기 중에 열에 내성을 갖고 빠르게 생장하는 세균이 다수 존재한 것으로 판단되었다.
추출된 아미노산 중 필수 아미노산(histidine, threonine, lysine, methionine, valine, isoleucine, leucine, phenylalanine) 함량은 774.8 μmol/ml로 총 아미노산 함량의 31%를 차지하였고, 실험실 규모에서의 함량(619.3 μmol/ml) 보다 25% 증가하였다(Fig. 1).
6 g으로 Duncan의 다중 검정 결과, 5% 수준에서 유의성이 인정되었고, CPH 처리구는 무처리구에 비해 토마토 지상부의 생장은 6–16%, 뿌리의 생장은 70% 향상되는 효과가 있었다. 토마토 뿌리를 채취하여 뿌리의 발달 양상을 관찰한 결과, CPH 처리구의 토마토 뿌리는 무처리구에 비해 뿌리의 발육과 생장이 매우 우수하였다(Fig. 2).
토마토 생육과 더불어 발달된 근권토양 내 우점균인 Proteobacteria 문(4 class, 26 order) 중 Rhodobacteriales, Caulobacterales, Rhizobiale, Sphingomonadales, Rhodospirillales, Methylophilales, Nitrosomonadales, Neisseriales, Rhodocyclales, Burkholderiales, Enterobacteriales, Aeromonadales, Pseudomonadales, Alteromonadales, Legionellales, Xathomonadales, Desulfusomonadales, Myxococales는 모든 시험구 토양에 분포하는 세균군집으로 확 인되었다. TCPH에서는 Chromatiales 목의 계통군이 특징적으로 나타났으며, Sphingomonadales, Rhodospirillales, Pseudomonadales 목의 계통군은 증가되는 세균군집으로 확인되었고, Lysobacter, Pseudofulvimonas, Arenimonas, Xanthmonas을 포함하는 Xathomonadales 목과 Desulfuromonads, Geobacter을 포함하는 Desulfuromonadales 목 그리고 Myxococcus를 포함하는 Myxococcales 목에 속하는 계통군은 감소되는 세균군집으로 확인되었다(Fig.
닭우모 단백질 가수분해물(CPH) 처리가 토마토 생장에 미치는 효과를 Table 1에 나타내었다. 토마토 종자를 CPH 1/50 희석 액에 2시간 침지 처리하여 128공 포트에 파종하고 28℃에서 15일 동안 배양한 후 발아율을 비교한 결과, CPH 무처리구 (NCPH)는 93% 발아율을 나타낸 반면 CPH 처리구(TCPH)는 100%가 발아하였다. 한편, CPH를 1/50 이상의 농도로 처리할 경우, 토마토 종자의 발아가 되는 기간이 길어지고 유묘 생장도 양호하지 못한 것으로 나타나 CPH 1/50 희석농도가 토마토 작물의 생장을 위한 최적농도로 판단되었다(자료 미제시).
6%)이 었다. 특히, Rhizobiales 목에 속하는 계통군은 TCPH와 NCPH 토양 모두에서 우점을 이루는 세균군집으로 확인되었다. 모든 근권토양 내 Rhizobiales 목에 속하는 세균군집은 10개의 family로 분류되었고, 이 중 Bradyrhizobiaceae가 약 45%로 가장 높은 분포를 나타내었다(Fig.
5%를 나타내는 주요 계통군으로 확인되었다. 특히, 가수분해물을 대조구 토양 내 Proteobacteria 문은 전체 세균군집의 7.7%에 불과했으나 토마토를 60일간 재배한 토마토 근권토양 내에는 세균군집의 약 40% 이상이 Proteobacteria 문으로 나타났다.
토마토 종자를 CPH 1/50 희석 액에 2시간 침지 처리하여 128공 포트에 파종하고 28℃에서 15일 동안 배양한 후 발아율을 비교한 결과, CPH 무처리구 (NCPH)는 93% 발아율을 나타낸 반면 CPH 처리구(TCPH)는 100%가 발아하였다. 한편, CPH를 1/50 이상의 농도로 처리할 경우, 토마토 종자의 발아가 되는 기간이 길어지고 유묘 생장도 양호하지 못한 것으로 나타나 CPH 1/50 희석농도가 토마토 작물의 생장을 위한 최적농도로 판단되었다(자료 미제시).
후속연구
이상, 본 연구에서는 닭우모분으로부터 생산한 닭우모 단백질 가수분해물(CHP)을 토마토 작물에 처리한 결과, 토마토 작물의 지상부와 지하부의 생장을 크게 향상시켜 생장효과가 매우 우수한 것으로 확인되었다. 또한, CHP는 토양내 세균군집 다양성 및 주요 토착미생물 군집인 Bradyrhizobiaceae에 영향을 미치지 않은 것으로 판단되어 향후 CHP를 작물생육용 친환경 자재로 활용 가능할 것으로 평가되었다.
대조구토양의 경우 곡선이 plateau에 도달하여 분석 에 이용된 2,440개의 염기서열수가 시료에 포함된 모든 종을 확인하기에 충분하였다. 반면, 가수분해물을 처리하지 않은 토양과 가수분해물을 처리한 근권 토양의 rarefaction curve는 plateau에 도달하지 못해 세균군집의 다양성을 충분히 예측하기 위해서는 더 많은 염기서열의 확보가 필요할 것으로 판단되었다. 또한, abundance-based coverage estimator (ACE) index, Chao1 richness index 및 Shannon diversity index를 계산한 결과, 대조구토양에서는 232 OTU, shannon diversity index 2.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
닭우모란?
가금류의 폐기물로 발생되는 닭우모는 연간 평균 5만 여톤 이상이 발생한다. 닭우모는 물에 녹지 않는 불용성 케라틴(keratin) 단백질로 구조 내 시스테인 잔기 사이의 이황화결합, 수소결합, 소수성 상호작용으로 인해 trypsin, pepsin, papain과 같은 단백 질분해효소로 분해되지 않는 물리·화학적으로 매우 안정한 구조체로 알려져 있다(Onifade et al., 1998; Vignardet et al.
토양개량 및 작물생육용 자재를 사용하기 위해 받는 검사는?
친환경유기농자재는 2013년 기준 1,105개의 제품이 등록되어 있다. 친환경유기농자재로 사용하기 위해서는 농촌진흥청이 주관하는 「친환경유기농자재의 공시 및 품질인증」을 받아야만 하는데 토양개량 및 작물생 육용 자재의 경우, 항생물질 검사, 작물 재배시험, 유해성분 검사를 받도록 되어 있다. 또한, 지속적 농업을 위해 친환경유기농자재를 사용할 경우 토양 내 서식하는 미생물군집에 미치는 영향 에 관한 조사가 이루어져야 할 필요성이 제기되고 있다.
닭 우모의 산⋅알칼리 처리에 의한 화학적 분해법의 문제점은?
, 2002). 이와 같은 처리공정은 많은 에너지가 필요할 뿐만 아니라 처리과정 중에 필수 아미노산의 손실이 있기 때문에(Hood and Healy, 1994), 산⋅알칼리 처리에 의한 화학적 분해법으로 아미노산을 추출하여 활용하고 있으나, 공정과정 중 폐수와 악취가 대량 발생하여 환경오염을 유발하고 처리 비용이 높아 경제성이 낮은 것으로 알려져 있다(Onifade et al., 1998).
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