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문제 정의
- Agarwal 등(2009)의 연구에 따르면 in vitro 실험에서 peppermint oil이 VFA의 생성에 영향 없이 20% 정도의 메탄 생성을 저감한다고 보고하였으며, Patra 등(2006)은 methanol 및 ethanol을 이용하여 추출한 fennel seed 및 clove bud 추출물이 in vitro 상에서 메탄생성을 저해한다고 보고 하였다. 따라서 본 연구는 한국 식물 추출물 은행의 분양목록에서 Terpenoid를 함유하는 식물 추출물을 선택하여 반추위 내 메탄 발생 저감 및 반추위 발효성상에 미치는 영향을 조사하여 반추동물의 메탄저감 사료 첨가제로서의 가능성을 조사하고 메탄 저감능력을 가진 국내 자생 식물을 선발하기 위하여 실시하였다.
- 본 연구는 Terpenoid 함유 식물 추출물을 이용하여 in vitro 반추위 발효성상 및 메탄생성에 미치는 영향을 알아보고자 수행하였다. 반추위액은 티머시(timothy)와 농후사료를 6:4의 비율로 급여한 반추위 cannula가 시술된 한우 암소에서 채취하였다.
제안 방법
- 3g 티머시와 식물 추출물(기질의 5%)이 담긴 50ml serum bottle에 혐기상태로 15ml를 분주하였다. Serum bottle은 39℃, 150rpm으로 3, 6, 9, 12, 24, 48 및 72시간 동안 배양하였다. 실험 결과 pH 값은 점점 감소하였으며, 전 배양시간에 걸쳐 대조구보다 유의적(p<0.
- 가스 발생량 측정 및 가스 포집 후 Weaton decapper(Weaton Co., USA)를 이용하여 serum bottle의 aluminum seal 및 butyl rubber를 제거 한 후 배양액을 pH를 pH meter(Mettler Toledo, MP230)를 이용하여 측정하였다.
- 3g 티머시와 식물 추출물(기질의 5%)이 담긴 50ml serum bottle에 혐기상태(O2-free N2)로 15ml를 분주하고, butyl rubber 및 aluminum cap으로 밀봉하였다. 각 처리구별 배양은 39℃의 shaking incubator(Jeio Tech, SI-900R; 120rpm)에서 시간대별(3, 6, 9, 12, 24, 48 및 72)로 3반복 수행하였다.
- 배양 상등액 채취 후 nylon bag을 수거하여 흐르는 물에 5분간 씻은 후 65℃의 dry oven에서 약 24시간 건조시켜 건물 잔량을 측정하였다. 건물 소화율은 투입한 기질의 양과 발효 후 nylon bag의 차이를 기질양의 백분율로 환산하여 구하였다.
- 배양 상등액 채취 후 nylon bag을 수거하여 흐르는 물에 5분간 씻은 후 65℃의 dry oven에서 약 24시간 건조시켜 건물 잔량을 측정하였다. 건물 소화율은 투입한 기질의 양과 발효 후 nylon bag의 차이를 기질양의 백분율로 환산하여 구하였다.
- 배양액을 1.5ml Eppendorf tube에 채취하여 3,000rpm에서 3분간 원심 분리하여 사료입자를 제거하고, 상등액을 0.20㎛ syringe filter로 여과 후 HPLC(High performance Liquid Chromatography, Agilent-1200, Germany)를 이용하여 분석하였다. 시료의 주입량은 20㎕였고, 이동상 용액은 0.
- 5ml eppendorf tube에 채취하여 사료입자를 제거하기 위해 3,000 rpm에서 3분간 원심분리 하였다. 상등액을 취하여 14,000 rpm에서 3분간 재원심 분리하여 미생물 pellet을 침전시킨 후, 상등액은 제거하고 pellet에 sodium phosphate buffer(pH 6.5)를 1ml 첨가하여 vortex로 교반시키는 세척 과정을 3회 반복 후 spectrophotometer(BIO-RAD, Model 680)를 이용하여 550nm에서 O.D.(optical density) 값을 구하여 미생물 성장량을 측정하였다(Lee eat al., 2007).
- 시험용 위액 준비는 오전 사료 급여 시간 전에 반추위에 장착된 cannula를 통하여 채취하였고, 4겹의 cheese cloth에 걸러서 O2-free N2가 충진된 보온용기에 담아 실험실로 운반하였다. 잔여 사료 입자를 제거하기 위해 2겹의 cheese cloth로 다시 걸러낸 반추위액과 McDougall buffer를 1:2의 비율로 혼합한 배양액을 0.3g 티머시와 식물 추출물(기질의 5%)이 담긴 50ml serum bottle에 혐기상태(O2-free N2)로 15ml를 분주하고, butyl rubber 및 aluminum cap으로 밀봉하였다. 각 처리구별 배양은 39℃의 shaking incubator(Jeio Tech, SI-900R; 120rpm)에서 시간대별(3, 6, 9, 12, 24, 48 및 72)로 3반복 수행하였다.
대상 데이터
- Column은 300mm × 7.8mm I.d. MetaCarb 87H(Varian, USA)를 사용하였으며, 온도는 35℃에서 사용하였다.
- 경상남도 진주 소재의 경상대학교 야생동물보호센터에서 반추위에 cannula가 장착된 한우(체중 450kg±30kg)로부터 in vitro 반추위 발효 시험을 위한 시험용 위액을 채취하였고, 사료는 농후사료와 티모시의 비율을 4:6로 하여 체중의 2%를 1일 2회(09:00 및 17:00) 분할 급여하였고, 물과 미네랄 블록은 자유섭취토록 하였다.
- 공시재료는 65℃ dry oven에서 24시간 건조시킨 timothy를 2mm screen으로 분쇄한 후 3cm × 3.5cm로 자체 제작한 nylon bag(Ankom Forage bag: R1020)에 넣어 heat sealing후 기질로 사용하였고, AOAC법(1995)으로 분석한 timothy의 화학적 조성 결과는 Table 1과 같다.
- 본 연구는 Terpenoid 함유 식물 추출물을 이용하여 in vitro 반추위 발효성상 및 메탄생성에 미치는 영향을 알아보고자 수행하였다. 반추위액은 티머시(timothy)와 농후사료를 6:4의 비율로 급여한 반추위 cannula가 시술된 한우 암소에서 채취하였다. 본 실험에 사용한 식물 추출물은 박하(Mint), 소나무(Pine), 삼나무(Japan cedar), 초피나무(Sichuan pepper), 편백(Hinoki cypress) 그리고 해송(Japanese black pine)을 사용하였으며, 반추위액과 McDougall buffer를 1:2의 비율로 혼합한 배양액을 0.
- 반추위액은 티머시(timothy)와 농후사료를 6:4의 비율로 급여한 반추위 cannula가 시술된 한우 암소에서 채취하였다. 본 실험에 사용한 식물 추출물은 박하(Mint), 소나무(Pine), 삼나무(Japan cedar), 초피나무(Sichuan pepper), 편백(Hinoki cypress) 그리고 해송(Japanese black pine)을 사용하였으며, 반추위액과 McDougall buffer를 1:2의 비율로 혼합한 배양액을 0.3g 티머시와 식물 추출물(기질의 5%)이 담긴 50ml serum bottle에 혐기상태로 15ml를 분주하였다. Serum bottle은 39℃, 150rpm으로 3, 6, 9, 12, 24, 48 및 72시간 동안 배양하였다.
- 20㎛ syringe filter로 여과 후 HPLC(High performance Liquid Chromatography, Agilent-1200, Germany)를 이용하여 분석하였다. 시료의 주입량은 20㎕였고, 이동상 용액은 0.0085N H2SO4을 사용하였으며, 유속은 0.6ml/min이었다. Column은 300mm × 7.
- 5cm로 자체 제작한 nylon bag(Ankom Forage bag: R1020)에 넣어 heat sealing후 기질로 사용하였고, AOAC법(1995)으로 분석한 timothy의 화학적 조성 결과는 Table 1과 같다. 식물 추출물(Table 2)은 한국식물추출물은행에서 Methyl alcohol 99.9%로 추출한 것을 분양받아 Dimethyl sulfoxide(Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, Mo, USA) 1ml에 희석 후 사용하였다. 시험용 위액 준비는 오전 사료 급여 시간 전에 반추위에 장착된 cannula를 통하여 채취하였고, 4겹의 cheese cloth에 걸러서 O2-free N2가 충진된 보온용기에 담아 실험실로 운반하였다.
데이터처리
- 통계처리는 SAS package program(1996)의 General Linear Model(GLM) procedure에 따라 처리하였으며, 각 처리구간의 유의성 검증을 위해 분산분석을 실시 후, Duncan's multiple range test(Duncan, 1955)로 5% 수준에서 유의성을 검정하였다(P<0.05).
이론/모형
- Chaney와 Marbach(1962)의 방법에 의해 phenol color reagent와 alkali-hypochlorite reagent로 위액중의 암모니아를 발색한 후 spectrophotometer(BIO-RAD Model 680)를 이용하여 630nm에서 O.D.(optical density)값을 구하여 측정하였다.
- Serum bottle을 shaking incubator에서 꺼낸 후, Theodorou 등(1994)의 방법으로 serum bottle의 head space에 있는 가스 발생량을 detachable pressure transducer 및 digital read-out voltmeter(Laurel Electronics, Inc., CA, USA)를 사용하여 측정하였고, 9ml 진공시험관(vacutainer)에 가스를 포집하여 GC(HP 5890 Gas Chromatography, USA)를 사용하여 가스 내 메탄 함량 및 이산화탄소 함량을 측정하였다.
성능/효과
- 05), 9시간대의 Pine 처리구에서 가장 낮았다. 24시간대부터 48시간대까지는 대조구와 모든 처리구에서 증가하지만 다시 72시간대에는 감소하였는데, Hinoki cypress 처리구에서만 증가하는 경향을 나타내었다.
- 초기 배양시간대 acetate 및 propionate 생성량은 대조구에 비해 떨어진 양상을 보이며, 대조구와 처리구 모두 배양 6시간대 더욱 감소되는데 이는 Table 9에서 보인 반추 미생물의 성장량 저하에 따른 결과로 생각되며, 이후 배양시간의 경과에 따라 미생물 성장량과 동일한 양상으로 acetate 및 propionate 생성량이 다시 증가하였다. Acetate의 증가량은 배양 12시간에서 24시간까지 가장 높았고, 특히 Mint와 Pine 처리구에서 증가량이 가장 높았다. 이후 미생물의 lysis 과정에 들어서면서 acetate의 증가량은 서서히 감소하였다.
- acetic acid 및 propionic acid도 대조구보다 유의적(p<0.05)으로 높은 것을 확인할 수 있었다.
- Terpenoid 함유 식물 추출물의 첨가가 in vitro 상의 pH의 변화에 미치는 영향은 Table 7과 같다. pH 값은 초기 7.55 에서 6.52 정도의 범위로 배양시간의 경과에 따라 낮아지는 경향을 보였으며, 배양 초기 모든 대조구 및 처리구가 높은 pH를 형성한 것은 McDougall Buffer의 pH가 7.5 범위에 있어 배양액의 pH에 영향을 준 것으로 생각된다. 또한 McCullough(1973)는 cellulose 소화에는 pH 6.
- 05)으로 높은 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로 본 실험에 사용한 Terpenoid 함유 식물 추출물 6종 모두 소화율에 영향을 미치지 않으며 메탄저감 효과를 나타내었다. 특히 Mint 및 Pine 추출물은 총 VFA, acetic acid 및 propionic acid의 생성을 증가시켰으며 상기의 결과를 종합하였을 때, 반추위 발효성상에 악영향을 미치지 않으며 메탄 발생을 저감하는 식물 추출물로는 Mint 및 Pine이 적합하다고 생각된다.
- 메탄 발생량은 배양 3, 6, 9 및 24시간대에 전 처리구에서 메탄의 생성이 유의적으로 억제되었으며(p<0.05), 특히 배양 24시간에 모든 첨가구 Mint(25.72ml/g DM), Pine(26.83ml/g DM), Japan ceder(27.47ml/g DM), Sichuan pepper(26.06ml/g DM), Hinoki cypress(28.29ml/g DM), Japanese black pine(25.18ml/g DM)에서 대조구(43.62ml/g DM)에 비해 최대 58%의 메탄 생성을 억제하였다.
- 미생물 성장량은 배양 6시간대에 대조구에 비해 전 처리구에서 낮았으나 9시간대에 전 처리구에서 유의적으로 증가하였다(p<0.05).
- 미생물 성장량은 첨가구에 따라 각각 다른 양상을 나타냈으나 24시간대는 모든 처리구에서 유의적(p<0.05)으로 성장량이 감소하였다.
- 배양 3, 6시간대의 Mint 처리구에서 소화율이 일시적으로 증가하였으나 9~12시간대에는 전 대조구와 처리구간 유의성이 없었고, 이후 배양 48시간대에 모든 처리구가 대조구에 비해 높았다(p<0.05).
- 본 연구에서 국내 자생 식물 추출물이 반추위 발효성상과 메탄발생에 미치는 영향을 종합해 보면 대부분의 처리구에서 메탄생성 억제 효과가 있는 것으로 생각되며, 특히 Mint와 Pine 처리구에서 반추위 발효에 영향을 덜 미치면서 메탄생성을 억제하는 효과가 더 큰 것으로 생각된다. 다만, 반추위 미생물이 식물추출물의 첨가에 대한 적응력이 큰 것으로 보아 단일 추출물 보다는 메탄 생성을 억제하는 여러 추출물을 혼합하여 첨가하는 연구가 필요한 것으로 생각된다.
- , 1992) 섬유소 세포벽의 분해 정도와 미생물의 성장 그리고 휘발성 지방산과 메탄의 생성에 영향을 미치고, 두 번째로 사료 섭취량의 증가 또는 다량의 농후사료 급여로 인한 기질의 발효 속도 증가로 휘발성 지방산의 생성이 증가될 때 반추 위액은 더욱 산성이 된다. 본 연구의 결과 Terpenoid 함유 식물 추출물 첨가구에서 pH가 대조구보다 높은 것을 볼 수 있으나, 24시간대 Mint 및 Pine 처리구에서 VFA의 생성이 증가하였고 건물 소화율에도 영향을 미치지 않아 반추위 발효에 영향을 미칠 정도는 아닌 것으로 생각된다.
- 실험 결과 pH 값은 점점 감소하였으며, 전 배양시간에 걸쳐 대조구보다 유의적(p<0.05)으로 높았다.
- 05)으로 성장량이 감소하였다. 암모니아 측정량은 배양 12시간부터 첨가구에서 증가하는 경향을 보였으나 72시간대는 감소하였다. acetic acid 및 propionic acid도 대조구보다 유의적(p<0.
- 이산화탄소 발생량은 배양 12시간까지는 첨가구가 대조구 보다 적었지만, 12시간 후에는 대조구와 첨가구 간의 유의적 차이가 없는 것으로 나타났다. 이는 Terpenoid 함유 식물 추출물의 첨가로 인하여 반추 미생물의 성장이 억제된 결과라 생각된다.
- 초기 배양 시간대에는 암모니아 생성량에 약간의 유의성이 있으나(p<0.05), 12시간대 까지는 유의성이 없이 증가 하는 경향을 보였다.
- 총 가스 발생량은 배양 48시간까지 대조구에 비해 전 처리구에서 유의적(p<0.05)으로 낮았으나 배양 72시간에 Mint, Japan cedar 첨가구에서 각각 301.38ml/g DM 및 303.04ml/g DM으로 대조구(300.39ml/g DM) 보다 유의적으로 높았다(p<0.05).
- 총 가스 발생량은 전 처리구에서 유의적(p<0.05)으로 낮았으며, 이산화탄소 발생량은 배양 12시간대까지 감소하였으나, 그 이후는 유의적 차이가 없었다.
- 결과적으로 본 실험에 사용한 Terpenoid 함유 식물 추출물 6종 모두 소화율에 영향을 미치지 않으며 메탄저감 효과를 나타내었다. 특히 Mint 및 Pine 추출물은 총 VFA, acetic acid 및 propionic acid의 생성을 증가시켰으며 상기의 결과를 종합하였을 때, 반추위 발효성상에 악영향을 미치지 않으며 메탄 발생을 저감하는 식물 추출물로는 Mint 및 Pine이 적합하다고 생각된다.
후속연구
- 본 연구에서 국내 자생 식물 추출물이 반추위 발효성상과 메탄발생에 미치는 영향을 종합해 보면 대부분의 처리구에서 메탄생성 억제 효과가 있는 것으로 생각되며, 특히 Mint와 Pine 처리구에서 반추위 발효에 영향을 덜 미치면서 메탄생성을 억제하는 효과가 더 큰 것으로 생각된다. 다만, 반추위 미생물이 식물추출물의 첨가에 대한 적응력이 큰 것으로 보아 단일 추출물 보다는 메탄 생성을 억제하는 여러 추출물을 혼합하여 첨가하는 연구가 필요한 것으로 생각된다.
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