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문제 정의
- 그리고 독도 자생식물 Sv로부터 Eurotiales목의 Aspergillus속과 Penicillium속이 확인되었으며, Hypocreales목에 속하는 Fusarium속이 확인되었다. 본 연구에서는 내생진균류들 간의 유연관계를 확인하기 위하여 계통수를 작성하였다(Fig. 1). 그리고 독도에 자생하는 다른 식물들과 비교하였을 때[22, 23], 자낭균문(Ascomycota)에 속하는 내생진균류의 비율이 높은 것으로 확인이 되었으며, 본 연구에서도 분리 동정된 내생진균류가 대부분 자낭균문에 속하는 것을 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서는 대한민국 천연기념물 및 특정도서 제1호로 지정된 독도의 동도와 서도에서 자생하고 있는 비짜루, 갯괴불주머니, 왕김의 털, 땅채송화, 갯강아지풀의 뿌리내부 내생진균류들을 분리 및 동정을 수행하였다. 그리고 이들 내생진균류들이 가지고 있는 식물생장촉진활성을 확인하였고, 분리된 균주들간의 다양성을 분석하였으며, 식물과 균류들간의 다양성 지수를 분석하였다.
- 본 연구에서는 우리나라 독도에 자생하는 식물과 공생하는 내생진균류의 분포 및 다양성을 확인하였고, 이들 균류의 식물생장촉진활성을 검정하였다. 그리고 본 연구를 토대로 다른 응용 연구 및 분류체계가 명확하지 않은 내생진균류의 연구가 필요할 것으로 생각되며, 염 농도가 높은 환경을 가지는 독도환경에 대한 균류연구에 기초자료가 되고자 한다.
제안 방법
- 그리고 PCR반응을 위하여 universal primer인 ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')과 ITS4 (5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3')를 이용하여 rDNA-ITS 영역을 증폭하였다[8, 23, 24]. PCR 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동 후, ethidium bromide (EtBr)을 사용하여 20분 염색 후, UV transilluminator로 전기영동밴드를 확인하여 분석하였다[22, 24]. 그리고 전기영동 단편들은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen Inc.
- 그리고 PCR반응을 위하여 universal primer인 ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')과 ITS4 (5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3')를 이용하여 rDNA-ITS 영역을 증폭하였다[8, 23, 24].
- 1 프로그램의 neighbor-joining (NJ) 방법으로 분석하였다[19, 24]. 그리고 내생진균류의 blast결과를 확인하기 위하여 rDNA-ITS 영역의 염기서열을 NCBI의 nucleotide blast 정보와 비교 분석하였다. 그리고 내생진균류의 다양성 분석을 위하여 균주들의 목(Order)과 속(Genus)을 확인하였고, 다양성분석을 확인하기 위하여 다양성지수를 나타내는 Shannon's diversity index (H’)를 적용하였으며[14, 24], 독도 자생식물군에 대한 내생진균류의 다양성지수를 분석 및 확인하였다.
- 본 연구에서는 독도에 자생하고 있는 비짜루(Asparagus schoberioides), 갯괴불주머니(Corydalis platycarpa), 왕김의 털(Festuca rubra), 땅채송화(Sedum oryzifolium), 그리고 갯강아지풀(Setaria viridis)의 뿌리에 공생 및 상호작용하고 있는 내생진균류를 분리하고, rDNA-ITS 영역을 이용하여 동정하였다[7, 22]. 그리고 독도 자생식물들의 뿌리로부터 분리된 내생진균류들이 가지는 식물생장촉진활성을 검정하고, 이들 내생진균류들에 대한 유연관계를 확인하여 계통수를 작성하였으며, 유전학적 다양성을 분석하였다[7, 9, 10, 14].
- 내생진균류의 분리와 배양을 위하여 스트렙토마이신(Streptomycin, 80 ppm)이 포함되어 있는 hagem minimal (HM)배지를 사용하였고[19, 20], 식물의 뿌리를 25℃ 조건에서 배양하였다[19, 21, 24]. 그리고 배양된 식물시료 뿌리의 끝 단면에서 내생진균을 HM배지에 획선도말법(Streaking)을 이용하여 다시 25℃ 조건에서 배양하였다. 그리고 potato dextrose agar (PDA)에 계대배양하여 순수 분리하였다[9, 11, 23, 24].
- 본 연구에서는 대한민국 천연기념물 및 특정도서 제1호로 지정된 독도의 동도와 서도에서 자생하고 있는 비짜루, 갯괴불주머니, 왕김의 털, 땅채송화, 갯강아지풀의 뿌리내부 내생진균류들을 분리 및 동정을 수행하였다. 그리고 이들 내생진균류들이 가지고 있는 식물생장촉진활성을 확인하였고, 분리된 균주들간의 다양성을 분석하였으며, 식물과 균류들간의 다양성 지수를 분석하였다. 그리고 본 연구에서는 식물생장촉진활성이 우수한 D-So-1-1균주를 발굴하였으며, D-So-1-1 균주를 이용하여 훼손된 해안지역에 적용하여 식물의 녹화 및 식생의 복원에 응용될 수 있을 것이라 생각된다.
- 5% agarose gel에서 전기영동 후, ethidium bromide (EtBr)을 사용하여 20분 염색 후, UV transilluminator로 전기영동밴드를 확인하여 분석하였다[22, 24]. 그리고 전기영동 단편들은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen Inc., Germany)를 사용하여 정제하였고, 염기서열 결정을 위하여 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (PE Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하였으며, DNA 단편들은 ABI 310 DNA sequencer (Perkin Elmer, Foster City, CA, USA)를 사용하여 내생진균류들의 염기서열을 결정하였다[16, 23].
- 독도에 자생하고 있는 5종의 식물의 뿌리로부터 형태적으로 다른 내생진균류 33주를 분리하였다. 독도 자생식물 Ask로부터 5주, Cp로부터 6주, Fr로부터 3주, So로부터 11주, Sv로부터 8주의 염기서열을 분석하여 동정을 수행하였으며, NCBI의 GenBANK로부터 accession No. [JX220188-JX220198, JX220204-JX220206, JX220213-JX220231]를 제공받았다(Table 3).
- 동결건조로 인하여 균체에 수분이 승화된 내생진균류의 시료는 DNeasy Plant mini kit (QIAgen)를 사용하여 genomic DNA를 분리 및 추출하였다[5, 10]. 그리고 Polymerase Chain Reaction (PCR) 수행을 위한 templete 조건은 10 mM Tris-HCl (pH 8.
- 본 연구에서는 독도에 자생하고 있는 비짜루(Asparagus schoberioides), 갯괴불주머니(Corydalis platycarpa), 왕김의 털(Festuca rubra), 땅채송화(Sedum oryzifolium), 그리고 갯강아지풀(Setaria viridis)의 뿌리에 공생 및 상호작용하고 있는 내생진균류를 분리하고, rDNA-ITS 영역을 이용하여 동정하였다[7, 22]. 그리고 독도 자생식물들의 뿌리로부터 분리된 내생진균류들이 가지는 식물생장촉진활성을 검정하고, 이들 내생진균류들에 대한 유연관계를 확인하여 계통수를 작성하였으며, 유전학적 다양성을 분석하였다[7, 9, 10, 14].
- 식물생장촉진활성을 위하여 난장이벼 유묘의 이엽기 엽액 부분에 내생진균류의 배양여과액(30배 농축) 10 μl를 처리하여 7일간 유묘의 생장을 확인하여 지상부길이(Shoot length)와 식물전체길이(Plant length)를 확인하였다[11, 12, 13, 19, 24].
- 식물생장촉진활성을 확인하기 위하여 난장이벼를 사용하였고, 난장이벼 체내에서의 GA 생합성발현을 억제하기 위하여 uniconazol 20 ppm과 스포탁을 24시간 처리하였다. 그리고 발아한 난장이벼를 water agar (0.
- 식물의 뿌리에서 순수 분리한 내생진균류들을 Czapek's broth (CB) 배지에 7일 동안, 180 rpm, 28℃조건으로 진탕배양(Shake culture) 하였고[22, 24], 내생진균류의 균체(Mycobiont)를 여과하여 5일 동안 동결건조하여 동정을 위한 시료로 사용하였다.
대상 데이터
- 독도 자생식물 Ask로부터 5주, Cp로부터 6주, Fr로부터 3주, So로부터 11주, Sv로부터 8주의 염기서열을 분석하여 동정을 수행하였으며, NCBI의 GenBANK로부터 accession No. [JX220188-JX220198, JX220204-JX220206, JX220213-JX220231]를 제공받았다(Table 3).
- ). 그리고 독도에 자생하는 5종의 식물뿌리로부터 내생진균류를 분리하여 미생물시료로 준비하였고, 한국미생물보존센터(KCCM)로부터 분양받은 Gibberella fujikuroi (KCCM 12329) 균주를 대조구로 사용하였으며, 식물생장촉진활성검정(Bioassay)을 위하여 식물시료는 GA1생합성이 결핍된 난장이벼 (Waito-c)를 사용하였다.
- 식물생장촉진활성을 확인하기 위하여 난장이벼를 사용하였고, 난장이벼 체내에서의 GA 생합성발현을 억제하기 위하여 uniconazol 20 ppm과 스포탁을 24시간 처리하였다. 그리고 발아한 난장이벼를 water agar (0.6%)에 파종하여 식물생장촉진활성 식물재료로 사용하였다[3,24]. 식물생장촉진활성을 위하여 난장이벼 유묘의 이엽기 엽액 부분에 내생진균류의 배양여과액(30배 농축) 10 μl를 처리하여 7일간 유묘의 생장을 확인하여 지상부길이(Shoot length)와 식물전체길이(Plant length)를 확인하였다[11, 12, 13, 19, 24].
- 그리고 과염소산(Perchloric acid) 1%를 5분간 2 회 처리한 후에 멸균증류수로 세척하였고, 3~4 cm 길이로 절단하여 수분을 제거하였다[17]. 내생진균류의 분리와 배양을 위하여 스트렙토마이신(Streptomycin, 80 ppm)이 포함되어 있는 hagem minimal (HM)배지를 사용하였고[19, 20], 식물의 뿌리를 25℃ 조건에서 배양하였다[19, 21, 24]. 그리고 배양된 식물시료 뿌리의 끝 단면에서 내생진균을 HM배지에 획선도말법(Streaking)을 이용하여 다시 25℃ 조건에서 배양하였다.
- 독도에서 채집한 식물시료의 뿌리에 토양을 제거하고, 계면활성제(Tween 80)를 54 분간 2회 처리한 후에 멸균증류수(Sterile distilled water)로 세척하였다. 그리고 과염소산(Perchloric acid) 1%를 5분간 2 회 처리한 후에 멸균증류수로 세척하였고, 3~4 cm 길이로 절단하여 수분을 제거하였다[17].
- 본 연구에서 사용된 식물시료는 독도의 동도와 서도에 자생하는 비짜루(Asparagus schoberioides, plant code: Ask), 갯괴불주머니(Corydalis platycarpa, Cp), 왕김의 털(Festuca rubra, Fr), 땅채송화(Sedum oryzifolium, So), 그리고 갯강아지풀(Setaria viridis, Sv)을 식물시료로 사용하였다(Table 1.). 그리고 독도에 자생하는 5종의 식물뿌리로부터 내생진균류를 분리하여 미생물시료로 준비하였고, 한국미생물보존센터(KCCM)로부터 분양받은 Gibberella fujikuroi (KCCM 12329) 균주를 대조구로 사용하였으며, 식물생장촉진활성검정(Bioassay)을 위하여 식물시료는 GA1생합성이 결핍된 난장이벼 (Waito-c)를 사용하였다.
데이터처리
- 그리고 식물생장촉진활성 검정의 실험 결과는 평균±표준편차로 나타내어 결과를 도출하였다.
- 그리고 통계처리는 실험으로부터 얻어진 결과를 SPSS version 18.0을 이용하여 일원배치분산분석(ANOVA: one-way analysis of variance)을 이용하여 기술통계 값을 확인하였고, 사후검정은 Duncan’s multiple range test (DMRT)의 방법을 사용하여 유의확률 p<0.05 수준에서 비교 분석하도록 하였다[3, 23, 24].
- 독도 자생식물의 뿌리로부터 분리된 내생진균류의 염기서열을 ClustalX 프로그램을 사용하여 다중정렬을 수행하였고, Lasergene 7 프로그램과 BioEdit 프로그램을 사용하여 염기서열을 정리 및 분석하였다. 내생진균류의 유연관계 분석은 MEGA 4.
- 독도에서 분리된 내생진균류에 의한 식물생장촉진활성검정은 난장이벼 유묘의 지상부길이와 식물체길이로 확인하였고, 통계처리는 실험으로부터 얻은 결과를 SPSS program을 이용하였으며, 평균비교분석은 일원배치분산분석을 통하여 결과를 도출하였으며, 사후검정은 DMRT를 통하여 유의확률 p<0.05 수준에서 분석되었다.
이론/모형
- 그리고 내생진균류의 다양성 분석을 위하여 균주들의 목(Order)과 속(Genus)을 확인하였고, 다양성분석을 확인하기 위하여 다양성지수를 나타내는 Shannon's diversity index (H’)를 적용하였으며[14, 24], 독도 자생식물군에 대한 내생진균류의 다양성지수를 분석 및 확인하였다.
- 독도 자생식물의 뿌리로부터 분리된 내생진균류의 염기서열을 ClustalX 프로그램을 사용하여 다중정렬을 수행하였고, Lasergene 7 프로그램과 BioEdit 프로그램을 사용하여 염기서열을 정리 및 분석하였다. 내생진균류의 유연관계 분석은 MEGA 4.1 프로그램의 neighbor-joining (NJ) 방법으로 분석하였다[19, 24]. 그리고 내생진균류의 blast결과를 확인하기 위하여 rDNA-ITS 영역의 염기서열을 NCBI의 nucleotide blast 정보와 비교 분석하였다.
- 독도에 자생하는 식물들로부터 분리된 내생진균류의 유전학적 다양성을 확인하기 위하여 Shannon’s diversity index를 확인하였다.
성능/효과
- 자생식물 Cp로부터 Eurotiales목의 Penicillium속이 확인되었고, Fr에서는 Eurotiales목의 Penicillium속이 확인되었다. So로부터는 Eurotiales목의 Aspergillus속, Eurotium속, Penicillium속이 확인되었고, Capnodiales목에 속하는 Cladosporium속을 확인하였으며, Hypocreales목의 Fusarium속과 분류체계가 명확하지 않은 Incertae sedis에 속하는 Microsphaeropsis속을 확인하였다. 그리고 독도 자생식물 Sv로부터 Eurotiales목의 Aspergillus속과 Penicillium속이 확인되었으며, Hypocreales목에 속하는 Fusarium속이 확인되었다.
- fujikuroi와 D-So-1-1균주를 비교하였을 때, 통계적으로 대조구와 같이 a에 해당하는 결과를 확인 할 수 있었다. 그리고 대조구와 처리구에서는 DMRT의 사후분석을 확인 하였고, 같은 a그룹에 해당하는 것으로 볼 때, G. fujikuroi와 D-So-1-1균주는 비슷한 식물생장촉진활성을 가지는 것으로 생각된다.
- So로부터는 Eurotiales목의 Aspergillus속, Eurotium속, Penicillium속이 확인되었고, Capnodiales목에 속하는 Cladosporium속을 확인하였으며, Hypocreales목의 Fusarium속과 분류체계가 명확하지 않은 Incertae sedis에 속하는 Microsphaeropsis속을 확인하였다. 그리고 독도 자생식물 Sv로부터 Eurotiales목의 Aspergillus속과 Penicillium속이 확인되었으며, Hypocreales목에 속하는 Fusarium속이 확인되었다. 본 연구에서는 내생진균류들 간의 유연관계를 확인하기 위하여 계통수를 작성하였다(Fig.
- 1). 그리고 독도에 자생하는 다른 식물들과 비교하였을 때[22, 23], 자낭균문(Ascomycota)에 속하는 내생진균류의 비율이 높은 것으로 확인이 되었으며, 본 연구에서도 분리 동정된 내생진균류가 대부분 자낭균문에 속하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 분류체계가 명확하지 않은 내생진균류가 확인 되었고, 추가적으로 이들 균류의 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 000으로 가장 낮은 수치인 것을 알 수 있었다. 그리고 독도에 자생하는 식물 5종으로부터 미생물 다양성지수를 확인 하였을 때, So (1.642)에서 내생진균류의 다양성지수가 가장 높은 지수로 나타났으며, 분리식물 중에서 So의 뿌리 내생진균류가 미생물의 다양성이 가장 풍부하다는 것을 확인 할 수 있었다.
- 내생진균류는 자낭균문의 Capnodiales목, Eurotiales목, H ypocreales목에 속하는 다양한 내생진균류들이 분포하는 것을 확인 할 수 있었고, 분리된 모든 균류는 3목6속으로 확인되었다. 독도에서 분리된 내생진균류의 다양성 지수는 So에서 분리된 내생진균류의 다양성 지수가 1.
- 내생진균류의 계통학적 분석하였을 때, 독도 자생식물인 Ask에서 Eurotiales목(Order)의 Aspergillus속과 Penicillium속이 확인되었고, Hypocreales목에 속하는 Fusarium속이 확인되었다. 자생식물 Cp로부터 Eurotiales목의 Penicillium속이 확인되었고, Fr에서는 Eurotiales목의 Penicillium속이 확인되었다.
- 분리된 내생진균류는 Ask에서 3속 5종, Cp에서 1속 5종, Fr에서 1속 3종, So에서 6속 8종, Sv에서 3속 7종이 확인되었고, 독도에서 분리된 내생진균류의 목과 속으로 분류하여 각 분류군에 대한 구성비(%)를 나타내었다(Table 4). 독도 자생식물로부터 분리된 내생진균류의 다양성지수는 Ask (1.055), Cp (0.000), Fr (0.410), So (1.642), 그리고 Sv (0.736)으로 확인되었다(Table 5).
- 내생진균류는 자낭균문의 Capnodiales목, Eurotiales목, H ypocreales목에 속하는 다양한 내생진균류들이 분포하는 것을 확인 할 수 있었고, 분리된 모든 균류는 3목6속으로 확인되었다. 독도에서 분리된 내생진균류의 다양성 지수는 So에서 분리된 내생진균류의 다양성 지수가 1.642로 가장 높았고, Cp에서 분리된 내생진균류의 다양성 지수가 0.000으로 가장 낮은 수치인 것을 알 수 있었다. 그리고 독도에 자생하는 식물 5종으로부터 미생물 다양성지수를 확인 하였을 때, So (1.
- 본 연구에서는 내생진균류의 식물생장촉진활성을 검정하기 위하여 bioassay를 5반복 수행하였고, 땅채송화에서 분리된 D-So-1-1 [Fusarium culmorum: JX220213]의 내생진균이 Waito-c 유묘생장을 많이 촉진하는 것을 확인 할 수 있었다(Table 2). 땅채송화의 뿌리내부에서 분리된 So-1-1균주의 경우, 지상부길이는 평균 10.95 cm와 식물체길이는 평균 19.53 cm로 확인되었다. 그리고 처리구인 G.
- 본 연구에서는 내생진균류의 식물생장촉진활성을 검정하기 위하여 bioassay를 5반복 수행하였고, 땅채송화에서 분리된 D-So-1-1 [Fusarium culmorum: JX220213]의 내생진균이 Waito-c 유묘생장을 많이 촉진하는 것을 확인 할 수 있었다(Table 2). 땅채송화의 뿌리내부에서 분리된 So-1-1균주의 경우, 지상부길이는 평균 10.
- 독도에 자생하는 식물들로부터 분리된 내생진균류의 유전학적 다양성을 확인하기 위하여 Shannon’s diversity index를 확인하였다. 분리된 내생진균류는 Ask에서 3속 5종, Cp에서 1속 5종, Fr에서 1속 3종, So에서 6속 8종, Sv에서 3속 7종이 확인되었고, 독도에서 분리된 내생진균류의 목과 속으로 분류하여 각 분류군에 대한 구성비(%)를 나타내었다(Table 4). 독도 자생식물로부터 분리된 내생진균류의 다양성지수는 Ask (1.
- 내생진균류의 계통학적 분석하였을 때, 독도 자생식물인 Ask에서 Eurotiales목(Order)의 Aspergillus속과 Penicillium속이 확인되었고, Hypocreales목에 속하는 Fusarium속이 확인되었다. 자생식물 Cp로부터 Eurotiales목의 Penicillium속이 확인되었고, Fr에서는 Eurotiales목의 Penicillium속이 확인되었다. So로부터는 Eurotiales목의 Aspergillus속, Eurotium속, Penicillium속이 확인되었고, Capnodiales목에 속하는 Cladosporium속을 확인하였으며, Hypocreales목의 Fusarium속과 분류체계가 명확하지 않은 Incertae sedis에 속하는 Microsphaeropsis속을 확인하였다.
후속연구
- 그리고 독도에 자생하는 다른 식물들과 비교하였을 때[22, 23], 자낭균문(Ascomycota)에 속하는 내생진균류의 비율이 높은 것으로 확인이 되었으며, 본 연구에서도 분리 동정된 내생진균류가 대부분 자낭균문에 속하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 분류체계가 명확하지 않은 내생진균류가 확인 되었고, 추가적으로 이들 균류의 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 본 연구에서는 우리나라 독도에 자생하는 식물과 공생하는 내생진균류의 분포 및 다양성을 확인하였고, 이들 균류의 식물생장촉진활성을 검정하였다. 그리고 본 연구를 토대로 다른 응용 연구 및 분류체계가 명확하지 않은 내생진균류의 연구가 필요할 것으로 생각되며, 염 농도가 높은 환경을 가지는 독도환경에 대한 균류연구에 기초자료가 되고자 한다.
- 그리고 이들 내생진균류들이 가지고 있는 식물생장촉진활성을 확인하였고, 분리된 균주들간의 다양성을 분석하였으며, 식물과 균류들간의 다양성 지수를 분석하였다. 그리고 본 연구에서는 식물생장촉진활성이 우수한 D-So-1-1균주를 발굴하였으며, D-So-1-1 균주를 이용하여 훼손된 해안지역에 적용하여 식물의 녹화 및 식생의 복원에 응용될 수 있을 것이라 생각된다.
- 우리나라의 다른 해안지역이며 람사르습지로 알려진 무안갯벌에 자생하는 염생식물의 내생진균류들과 비교하였을 때[25], 무안갯벌은 Acremonium속, Alternaria속, Aspergillus속, Aureobasidium속, Cephalosporium속, Chaetomium속, Cladosporium속, Colletotrichum속, Cryptococcus속, Didymella속, Dothideomycete속, Emericellopsis속, Epicoccum속, Eupenicillium속, Fusarium속, Gibberella속, Gongronella속, Macrophoma속, Microsphaeropsis속 등의 다양한 내생진균류들이 확인이 되었으며[25], 독도와는 지리적인 환경 차이에 때문에 다른 미생물상이 나타나는 것을 확인 할 수 있었으며, 독도의 내생진균류에 대한 정보를 보다 더 많이 확인 할 필요가 있다고 생각된다[23].
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