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문제 정의
- 15 이를 위해 여러 농도의 각 화학물질 표준용액들을 제조하고, 분석을 실시하여 검정곡선을 구한 후, 시판되는 10종의 벌꿀을 sampling한 시료들에 대해 HPLC 분석을 실시하여 그 속에 포함된 동물성 의약품의 정성분석과 정량분석을 실시하였다. 그리고 그 결과를 5년여 전에 HPLC-UV 방법으로 행한 분석결과15와 비교하여 국내에서 판매되는 벌꿀에 대한 안정성을 판단하는데 도움이 되고자 하였다.
- 현재도 많은 양봉 농가에서 꿀벌의 질병 방지를 위해 항생제와 살충제와 같은 다양한 유해 물질들을 사용하고 있다. 벌꿀 속에 동물성 의약품의 잔류 여부를 조사하기 위해 최근 생산된 벌꿀 10종에 대해 양봉용 동물성 의약품 4종-amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole-의 잔류 여부를 조사하였다. 먼저, 벌꿀 속의 동물성 의약품을 추출하기 위해 5.
- 본 연구에서는 국내에서 양봉용 동물성의약품에 대해 설정한 최대잔류허용기준을 참고로 하여 2011년 1월과 2월, 국내에서 시판된 벌꿀 10종을 대상으로 잔류가능성이 있는 동물성 의약품 4종-amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole-의 잔류 실태를 조사하였다.15 이를 위해 여러 농도의 각 화학물질 표준용액들을 제조하고, 분석을 실시하여 검정곡선을 구한 후, 시판되는 10종의 벌꿀을 sampling한 시료들에 대해 HPLC 분석을 실시하여 그 속에 포함된 동물성 의약품의 정성분석과 정량분석을 실시하였다.
- 혼합표준용액에서 amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole 각각에 해당하는 피이크의 최대흡광도는 각 물질이 단독으로 존재했을 때와 동일하게 나타났으며, 이는 여러 물질이 포함된 벌꿀 시료를 정성분석 할 때 동일 물질 여부를 판단하기 위해 유용하게 이용될 수 있다. 즉, 시료에서 amitraz, bromopropylate, coumaphos, 그리고 cymiazole의 머무름 시간과 동일한 시간에 나타나는 피이크가 발견되면 그 피이크의 최대흡광도를 4가지 성분의 최대흡광도와 비교하여 동일 물질 여부를 확인하는데 이용하였다.
제안 방법
- 그러나 cymiazole로 의심되는 피이크는 10종의 벌꿀에서 발견되었다. 10종의 벌꿀에서 cymiazole로 의심되는 피이크들에 대해 최대흡광도와 spiking 실험을 실시하여 확인하였다. 그 결과 10종의 벌꿀에서 5~6분 사이에 나타나는 피이크 모두 cymiazole라 다른 물질임을 확인하였다.
- 15 이를 위해 여러 농도의 각 화학물질 표준용액들을 제조하고, 분석을 실시하여 검정곡선을 구한 후, 시판되는 10종의 벌꿀을 sampling한 시료들에 대해 HPLC 분석을 실시하여 그 속에 포함된 동물성 의약품의 정성분석과 정량분석을 실시하였다. 그리고 그 결과를 5년여 전에 HPLC-UV 방법으로 행한 분석결과15와 비교하여 국내에서 판매되는 벌꿀에 대한 안정성을 판단하는데 도움이 되고자 하였다.
- Cymiazole로 의심되는 피이크들을 좀 더 정확히 판별하기 위해 해당 시료에 spiking 실험을 추가로 실시하였다. 순수한 cymiazole 500 ppb 표준 용액을 시료 용액과 1:1로 섞어서 이것을 주입하여 의심되는 피이 크의 변화를 살펴보았다.
- Coumaphos를 확인하기 위해 313 nm에서의 크로마토그램을 관찰하였더니 의심되는 피이크가 발견되지 않았다. Fig. 4에서 5.5분대 부근에 cymiazole로 의심되는 피이크들을 확인하기 위해 시료의 크로마토그램의 스케일을 확대하였으며(Fig. 5) cymiazole로 의심되는 피이크들의 최대흡광도를 조사한 다음 순수한 cymiazole의 최대흡광도와 비교하였다(Fig. 6).
- 벌꿀 속에 잔류하는 amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole에 대한 검정곡선을 작성하기 위하여 각 화합물의 예상 잔류 허용치를 100 ppb로 하고 그 농도 부근의 표준용액(25, 50, 100, 250, 1000 ppb)을 이용해 HPLC 분석을 실시하였다. 각 농도별로 4회씩 분석하여 각각에 대한 chromatogram을 얻었다. 이 때 예상 잔류허용치를 100 ppb로 한 이유는 조사 대상 물질 중 가장 독성이 강한 coumaphos에 대한 미국과 유럽연합에서 동물성의약품의 최대잔류허용기준을 근거로 하였다.
- 시료 주입량은 20 µL 주입했으며, 이 때 autosampler를 20 µL로 설정하여 주입량을 조절하였다. 동일한 시료 들을 각각 4회씩을 분석하였고, 각 chromatogram의 피이크 면적을 정규화된 내부표준물질의 피이크 면적을 이용하여 표준화 하였다.
- 벌꿀 속에 잔류하는 amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole에 대한 검정곡선을 작성하기 위하여 각 화합물의 예상 잔류 허용치를 100 ppb로 하고 그 농도 부근의 표준용액(25, 50, 100, 250, 1000 ppb)을 이용해 HPLC 분석을 실시하였다. 각 농도별로 4회씩 분석하여 각각에 대한 chromatogram을 얻었다.
- 벌꿀 속에 잔류하는 amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole에 대한 정량분석을 위해 시판되는 시료 10종에 대해 내부 표준물이 포함된 유기용매로 추출을 실시하였고, 추출된 시료들을 HPLC로 정성분석을 실시하였다. 정성분석을 위해 먼저 내부표준물질이 포함된 amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole 각각의 표준용액의 chromatogram을 찍어서 머무름 시간을 확인하였다.
- Cymiazole로 의심되는 피이크들을 좀 더 정확히 판별하기 위해 해당 시료에 spiking 실험을 추가로 실시하였다. 순수한 cymiazole 500 ppb 표준 용액을 시료 용액과 1:1로 섞어서 이것을 주입하여 의심되는 피이 크의 변화를 살펴보았다. 표준 용액의 농도가 너무 진하면 다른 피이크와 섞여 구별하기 힘들고 농도가 너무 묽으면 피이크의 변화를 관찰하기 힘들기 때문에 500 ppb의 농도로 실험하였다.
- 안지름이 4.6 mm이고, 길이가 250 mm인 스텐레스 관의 C18컬럼을 사용하였으며 column oven을 25℃로 설정하여 HPLC 분석을 실시하였다. Amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole의 표준용액으로 동시 분석 시에는 이동상으로 70% acetonitrile in H20 용액을 사용하였고, 유속은 1.
- 앞서 제조한 amitraz (A), bromopropylate (B), coumaphos (C) 및 cymiazole (Cy)가 함께 들어있는 100.0 ppm 저장용액을 내부 표준물질인 benzoinmethylether가 1.0 ppm 포함된 2% acetone in hexane 용액으로 희석하여 각각 25, 50, 100, 200, 1000 ppb 혼합 표준 용액을 제조하였다.
- 이 후 발견된 물질에 대해서는 정량분석을 위해 내부표준물질로 normalization 후 검정곡선을 통하여 해당물질의 정량을 계획하였다. 10개의 실제 시료를 233 nm, 289 nm, 313 nm에서 파장별로 분석하였고, 233nm에서 분석한 결과를 Fig.
- 3에 나타내었다. 정량분석을 하는 중에 벌꿀시료의 chromatogram에서 조사대상 4개의 화합물과 동일한 머무름 시간의 피이크가 발견되면 최대흡광도가 같은지를 통해 동일 물질 여부를 확인할 수 있도록 하였다.
- 벌꿀 속에 잔류하는 amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole에 대한 정량분석을 위해 시판되는 시료 10종에 대해 내부 표준물이 포함된 유기용매로 추출을 실시하였고, 추출된 시료들을 HPLC로 정성분석을 실시하였다. 정성분석을 위해 먼저 내부표준물질이 포함된 amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole 각각의 표준용액의 chromatogram을 찍어서 머무름 시간을 확인하였다.
- 파장별로 amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole이 혼합된 25 ppb, 50 ppb, 100 ppb, 200 ppb, 1000 ppb의 표준용액의 chromatogram을 비교하였으며, 혼합용액 속에서 각각의 물질이 단독으로 존재할 때와 동일한 머무름 시간을 가지는지 또한 그 피이크의 최대흡광도가 동일한지를 확인하였다. 파장별로 혼합 표준용액의 크로마토그램을 비교했을 때 233 nm에서 bromopropylate와 cymiazole의 피크가 가장 크게 나타났고, 289 nm에서는 amitraz가, 313 nm에서는 coumaphos가 가장 큰 피크를 보였다.
대상 데이터
- 이 후 발견된 물질에 대해서는 정량분석을 위해 내부표준물질로 normalization 후 검정곡선을 통하여 해당물질의 정량을 계획하였다. 10개의 실제 시료를 233 nm, 289 nm, 313 nm에서 파장별로 분석하였고, 233nm에서 분석한 결과를 Fig. 4에 나타내었다.
- 6 mm이고, 길이가 250 mm인 스텐레스 관의 C18컬럼을 사용하였으며 column oven을 25℃로 설정하여 HPLC 분석을 실시하였다. Amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole의 표준용액으로 동시 분석 시에는 이동상으로 70% acetonitrile in H20 용액을 사용하였고, 유속은 1.2 mL/min으로 하였다. 불순물이 많이 들어 있는 벌꿀 시료를 실험할 때도 같은 이동상으로 유속을 1.
- HPLC 전개용매는 J.T. Baker (Phllipsburg, USA)에서 구입한 HPLC급의 acetonitrile을 사용하였으며, H2O는 3차 증류수를 사용하였고, column은 Waters사 (Milford, USA)에서 구입한 C-18 칼럼인 Sunfire (내경 4.6 mm, 길이 250 mm, 입자 크기 5 µm)을 사용하였다.
- HPLC기기는 Waters사 (Milford, USA)의 Waters 996 photodiode array detector를 장착한 Waters 2690 Separation Module을 사용하였다. HPLC 전개용매는 J.
- 추출이 끝난 후 농축된 시료를 묽히는데 사용한 아세톤과 헥산은 HPLC급 용매를 사용하였다. 또한, 내부 표준물로 ALDRICH SIGMA사 (St. Louis, USA)의 benzoinmethylether (순도 99%)를 사용했다. 추출한 용액을 건조시키기 위해 사용한 MgSO4는 SHINHO PURE CHEMICALS CO.
- 정제된 화합물을 NMR, IR 등으로 cymiazole 임을 확인하여 실험에 사용하였다. 벌꿀시료로부터 각 유기물을 추출 시 전체 수용액의 액성을 염기성으로 하기 위해 사용된 NH4OH는 순도가 25%이며, Duksan Pure Chemical CO. (Ansan, Korea)에서 구입하였다. 추출이 끝난 후 농축된 시료를 묽히는데 사용한 아세톤과 헥산은 HPLC급 용매를 사용하였다.
- 추출된 시료를 HPLC-DAD방법으로 조사하였다. 이 때, 이동상으로 30% H2O in ACN을 이용하였고, 내부 표준물질로는 benzoinmethylether를 사용하였다. 4종의 동물성의약품의 표준용액으로 검정곡선을 만든 결과, 각각의 검정곡선은 직선성이 0.
- 표준용액을 만드는데 사용한 amitraz와 bromopropylate, coumaphos는 CHEMICAL SERVICE (West Chester, USA)에서 구입한 순도 99%의 것을 사용하였고, cymiazole의 경우는 국내 제조사인 일진 에프 엔 비(Seoul, Korea)에서 제조한 “바로킬”로부터 cymiazole의 HCl 염 형태로 있는 것을 입수하여 1M NaOH로 추출한 후에 잔유물을 소량의 CH2Cl2에 녹여 실리카겔을 통과시켜 정제하였다. 정제된 화합물을 NMR, IR 등으로 cymiazole 임을 확인하여 실험에 사용하였다. 벌꿀시료로부터 각 유기물을 추출 시 전체 수용액의 액성을 염기성으로 하기 위해 사용된 NH4OH는 순도가 25%이며, Duksan Pure Chemical CO.
- (Ansan, Korea)에서 구입하였다. 추출이 끝난 후 농축된 시료를 묽히는데 사용한 아세톤과 헥산은 HPLC급 용매를 사용하였다. 또한, 내부 표준물로 ALDRICH SIGMA사 (St.
- Louis, USA)의 benzoinmethylether (순도 99%)를 사용했다. 추출한 용액을 건조시키기 위해 사용한 MgSO4는 SHINHO PURE CHEMICALS CO. (Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 실험에 사용된 벌꿀 시료 10종은 모두 국내에서 시판되는 것으로 제조사와 구입처 등의 정보는 Table 2와 같다.
- 표준용액을 만드는데 사용한 amitraz와 bromopropylate, coumaphos는 CHEMICAL SERVICE (West Chester, USA)에서 구입한 순도 99%의 것을 사용하였고, cymiazole의 경우는 국내 제조사인 일진 에프 엔 비(Seoul, Korea)에서 제조한 “바로킬”로부터 cymiazole의 HCl 염 형태로 있는 것을 입수하여 1M NaOH로 추출한 후에 잔유물을 소량의 CH2Cl2에 녹여 실리카겔을 통과시켜 정제하였다.
이론/모형
- 25% NH4OH가 포함된 증류수와 2% acetone/hexane 용액을 이용하였다. 추출된 시료를 HPLC-DAD방법으로 조사하였다. 이 때, 이동상으로 30% H2O in ACN을 이용하였고, 내부 표준물질로는 benzoinmethylether를 사용하였다.
- 추출은 식품의약품 안전청에서 고시한 추출방법을 따랐다.7 벌꿀 5.
성능/효과
- 이 때, 이동상으로 30% H2O in ACN을 이용하였고, 내부 표준물질로는 benzoinmethylether를 사용하였다. 4종의 동물성의약품의 표준용액으로 검정곡선을 만든 결과, 각각의 검정곡선은 직선성이 0.999이상으로 분석물질의 농도를 결정하는데 적합하였다. 실제 벌꿀 시료의 분석 시 4종의 동물성의약품은 30분 이내에 잘 분리되었다.
- Amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole 모두 직선성이 0.999이상으로 나타났으며, 검정곡선으로 사용하기에 적합하였다.
- 4에서 볼 수 있듯이 몇몇 시료들에서 5~6분 사이에 cymiazole로 의심되는 피이크가 발견되었으나 15~16분 사이에서 bromopropylate로 의심되는 피이크는 발견되지 않았다. Amitraz를 확인하기 위해 10개의 시료들에 대해 289 nm에서 분석한 결과, 21~24분 사이에서 amitraz로 의심되는 피이크를 UV-Vis 스펙트럼의 최대흡광파장(max) 비교를 통해 확인하였고, 시료 중에 amitraz가 없음을 확인하였다. Coumaphos를 확인하기 위해 313 nm에서의 크로마토그램을 관찰하였더니 의심되는 피이크가 발견되지 않았다.
- 결론적으로 본 연구에서 조사한 10종의 벌꿀에서는 살충제로 사용되는 amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole의 성분이 25 ppb 이상으로는 검출되지 않았다. 시료수가 적기 때문에 본 연구의 결과로부터 시판되는 벌꿀 속에 동물성의약품의 포함유무를 단언하기는 쉽지 않지만 무작위로 선택한 벌꿀시료에서 amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole의 성분이 25 ppm 이상 발견되지 않은 것은 나름 가치가 있는 결과로 생각된다.
- 10종의 벌꿀에서 cymiazole로 의심되는 피이크들에 대해 최대흡광도와 spiking 실험을 실시하여 확인하였다. 그 결과 10종의 벌꿀에서 5~6분 사이에 나타나는 피이크 모두 cymiazole라 다른 물질임을 확인하였다.
- 파장별로 혼합 표준용액의 크로마토그램을 비교했을 때 233 nm에서 bromopropylate와 cymiazole의 피크가 가장 크게 나타났고, 289 nm에서는 amitraz가, 313 nm에서는 coumaphos가 가장 큰 피크를 보였다. 따라서 amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole를 분석하기 위해서는 233 nm, 289 nm, 313 nm에서 나타나는 각각 시료들의 크로마토그램을 확인하는 것이 효과적임을 알 수있었다.
- 35분의 피크는 면적이 줄어들었기 때문에 cymiazole로 볼 수 없었다. 따라서 특정 피이크의 UV-Vis 스펙트럼 상의 최대흡광도를 비교하여 얻은 정성 분석의 결과는 신뢰할 수 있다고 판단되었다. 앞에서의 방법으로 분석한 모든 벌꿀 시료들의 정성 분석 결과들을 Table 4에 정리하였다.
- 벌꿀 시료 10개에 대한 HPLC 분석 결과 amitraz, bromopropylate, coumaphos로 의심되는 피이크는 발견되지 않았다. 그러나 cymiazole로 의심되는 피이크는 10종의 벌꿀에서 발견되었다.
- 분석한 10종의 벌꿀 시료 모두 cymiazole과 비슷한 머무름 시간을 가지는 피이크가 발견되었다. 좀 더 정확한 확인을 위해 해당 피이크들의 최대흡광도를 조사하였으나 순수한 cymiazole의 최대흡광도와 일치하는 피이크는 관찰되지 않았다.
- 결론적으로 본 연구에서 조사한 10종의 벌꿀에서는 살충제로 사용되는 amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole의 성분이 25 ppb 이상으로는 검출되지 않았다. 시료수가 적기 때문에 본 연구의 결과로부터 시판되는 벌꿀 속에 동물성의약품의 포함유무를 단언하기는 쉽지 않지만 무작위로 선택한 벌꿀시료에서 amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole의 성분이 25 ppm 이상 발견되지 않은 것은 나름 가치가 있는 결과로 생각된다. 그러나 각 벌꿀 시료의 크로마토그램에서 볼 수 있었듯이 관심을 가졌던 동물성의약품 피이크 이외의 다른 유기화합물들이 우리가 먹는 벌꿀 속에 적잖게 포함되어 있음을 확인할 수 있었으므로 차후에는 이들에 대한 정성 및 정량 분석이 요구된다.
- 실험결과 내부표준물(IS)은 2.38분 경에 나타났고, 분석시료들의 피이크와 중복되지 않은 위치에서 큰 피이크 크기를 보여 내부표준물로서 효과적으로 사용할 수 있었다. 각 chromatogram의 면적비의 평균을 토대로 분석대상 4개 물질의 검정곡선을 작성하여 Fig.
- 분석한 10종의 벌꿀 시료 모두 cymiazole과 비슷한 머무름 시간을 가지는 피이크가 발견되었다. 좀 더 정확한 확인을 위해 해당 피이크들의 최대흡광도를 조사하였으나 순수한 cymiazole의 최대흡광도와 일치하는 피이크는 관찰되지 않았다. Cymiazole 이외에 amitraz, bromopropylate, coumaphos도 25 ppb 이상의 농도 범위에서는 발견되지 않았으나 Fig.
- 파장별로 amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole이 혼합된 25 ppb, 50 ppb, 100 ppb, 200 ppb, 1000 ppb의 표준용액의 chromatogram을 비교하였으며, 혼합용액 속에서 각각의 물질이 단독으로 존재할 때와 동일한 머무름 시간을 가지는지 또한 그 피이크의 최대흡광도가 동일한지를 확인하였다. 파장별로 혼합 표준용액의 크로마토그램을 비교했을 때 233 nm에서 bromopropylate와 cymiazole의 피크가 가장 크게 나타났고, 289 nm에서는 amitraz가, 313 nm에서는 coumaphos가 가장 큰 피크를 보였다. 따라서 amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole를 분석하기 위해서는 233 nm, 289 nm, 313 nm에서 나타나는 각각 시료들의 크로마토그램을 확인하는 것이 효과적임을 알 수있었다.
후속연구
- 시료수가 적기 때문에 본 연구의 결과로부터 시판되는 벌꿀 속에 동물성의약품의 포함유무를 단언하기는 쉽지 않지만 무작위로 선택한 벌꿀시료에서 amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole의 성분이 25 ppm 이상 발견되지 않은 것은 나름 가치가 있는 결과로 생각된다. 그러나 각 벌꿀 시료의 크로마토그램에서 볼 수 있었듯이 관심을 가졌던 동물성의약품 피이크 이외의 다른 유기화합물들이 우리가 먹는 벌꿀 속에 적잖게 포함되어 있음을 확인할 수 있었으므로 차후에는 이들에 대한 정성 및 정량 분석이 요구된다.
- 이들 결과를 5년 전에 분석한 결과와 비교하였을 때 분석 대상 물질인 amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole의 경우는 5년 전과 유사하게 잘 관리되고 있음을 알 수 있었으나 Fig. 4를 비롯한 모든 벌꿀 시료관련 크로마토그램에서 볼 수 있듯이 벌꿀 속에 amitraz, bromopropylate, coumaphos, cymiazole이 아닌 유기 화합물들이 포함되어 있어서 이들에 대한 정성분석과 정량분석이 진행되어야 할 것으로 생각된다.
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