Bacillus amyloliquefaciens를 이용하여 콩 종류와 발효온도를 달리하여 제조한 청국장의 특성 Characteristics of Chungkookjang Prepared by Bacillus amyloliquefaciens with Different Soybeans and Fermentation Temperatures원문보기
본 연구에서는 가정에서 제조한 청국장으로부터 순수분리한 Bacillus amyloliquefaciens C2를 이용하여 콩 종류와 발효온도에 따른 청국장의 품질 특성 변화를 조사하였다. Protease 활성은 $35^{\circ}C$에서 배양했을 때 황태 청국장에서 854 U/g, 흑태 청국장에서 847 U/g로 가장 높았다. Amylase 활성은 황태 청국장의 경우, $40^{\circ}C$에서 3.87 U/g, 흑태 청국장은 $45^{\cricr}C$에서 4.96 U/g로 가장 높았다. 환원당 함량은 황태 청국장의 경우, $40^{\circ}C$에서 16.11 mg/g, 흑태 청국장은 $45^{\circ}C$에서 19.08 mg/g으로 가장 높았다. 아미노태 질소 함량의 경우, 황태 청국장은 $40^{\circ}C$에서 420 mg%/g, 흑태 청국장은 194 mg%/g로 가장 높았다. pH의 경우, 황태 청국장은 $40^{\circ}C$에서 7.92, 흑태 청국장은 $45^{\circ}C$에서 7.59로 가장 높았다. 황태 및 흑태 청국장의 생균수는 각각 $40^{\circ}C$ 및 $35^{\circ}C$에서 9.3 log CFU/g로 가장 높았다. 반면에 암모니아태 질소 함량은 황태 청국장의 경우, $45^{\circ}C$에서 225 mg%/g, 흑태 청국장은 $40^{\circ}C$에서 80 mg%/g로 가장 낮았다. 황태 청국장은 높은protease 활성, pH 및 아미노태 질소함량을 나타내었다. 반면에, 흑태 청국장은 높은 amylase 활성과 환원당 함량 및 낮은 암모니아태 질소 함량을 나타내었다.
본 연구에서는 가정에서 제조한 청국장으로부터 순수분리한 Bacillus amyloliquefaciens C2를 이용하여 콩 종류와 발효온도에 따른 청국장의 품질 특성 변화를 조사하였다. Protease 활성은 $35^{\circ}C$에서 배양했을 때 황태 청국장에서 854 U/g, 흑태 청국장에서 847 U/g로 가장 높았다. Amylase 활성은 황태 청국장의 경우, $40^{\circ}C$에서 3.87 U/g, 흑태 청국장은 $45^{\cricr}C$에서 4.96 U/g로 가장 높았다. 환원당 함량은 황태 청국장의 경우, $40^{\circ}C$에서 16.11 mg/g, 흑태 청국장은 $45^{\circ}C$에서 19.08 mg/g으로 가장 높았다. 아미노태 질소 함량의 경우, 황태 청국장은 $40^{\circ}C$에서 420 mg%/g, 흑태 청국장은 194 mg%/g로 가장 높았다. pH의 경우, 황태 청국장은 $40^{\circ}C$에서 7.92, 흑태 청국장은 $45^{\circ}C$에서 7.59로 가장 높았다. 황태 및 흑태 청국장의 생균수는 각각 $40^{\circ}C$ 및 $35^{\circ}C$에서 9.3 log CFU/g로 가장 높았다. 반면에 암모니아태 질소 함량은 황태 청국장의 경우, $45^{\circ}C$에서 225 mg%/g, 흑태 청국장은 $40^{\circ}C$에서 80 mg%/g로 가장 낮았다. 황태 청국장은 높은protease 활성, pH 및 아미노태 질소함량을 나타내었다. 반면에, 흑태 청국장은 높은 amylase 활성과 환원당 함량 및 낮은 암모니아태 질소 함량을 나타내었다.
This study was carried out to investigate the characteristics of Chungkookjang depending on different soybeans and fermentation temperatures using Bacillus amyloliquefaciens C2 isolated from homemade Chungkookjang. The highest protease activity was 854 U/g in yellow soybean Chungkookjang and 847 U/g...
This study was carried out to investigate the characteristics of Chungkookjang depending on different soybeans and fermentation temperatures using Bacillus amyloliquefaciens C2 isolated from homemade Chungkookjang. The highest protease activity was 854 U/g in yellow soybean Chungkookjang and 847 U/g in black soybean Chungkookjang at $35^{\circ}C$. The highest amylase activity was 3.87 U/g at $40^{\circ}C$ in yellow soybean Chungkookjang and 4.96 U/g at $45^{\circ}C$ in black soybean Chungkookjang. The highest reducing sugar content was 16.11 mg/g at $40^{\circ}C$ in yellow soybean Chungkookjang and 19.08 mg/g at $45^{\circ}C$ in black soybean Chungkookjang. The highest amino type nitrogen content was 420 mg%/g in yellow soybean Chungkookjang and 194 mg%/g in black soybean Chungkookjang at $40^{\circ}C$. The highest pH was 7.92 at $40^{\circ}C$ in yellow soybean Chungkookjang and 7.59 at $45^{\circ}C$ in black soybean Chungkookjang. The highest number of viable cell was 9.3 log CFU/g at $40^{\circ}C$ in yellow soybean Chungkookjang and at $35^{\circ}C$ in black soybean Chungkookjang. On the other hand, the lowest ammonia type nitrogen content was 225 mg%/g at $45^{\circ}C$ in yellow soybean Chungkookjang and 80 mg%/g at $40^{\circ}C$ in black soybean Chungkookjang. Yellow soybean Chungkookjang showed high protease activity, pH and amino type nitrogen, whereas black soybean Chungkookjang showed high amylase activity and reducing sugar.
This study was carried out to investigate the characteristics of Chungkookjang depending on different soybeans and fermentation temperatures using Bacillus amyloliquefaciens C2 isolated from homemade Chungkookjang. The highest protease activity was 854 U/g in yellow soybean Chungkookjang and 847 U/g in black soybean Chungkookjang at $35^{\circ}C$. The highest amylase activity was 3.87 U/g at $40^{\circ}C$ in yellow soybean Chungkookjang and 4.96 U/g at $45^{\circ}C$ in black soybean Chungkookjang. The highest reducing sugar content was 16.11 mg/g at $40^{\circ}C$ in yellow soybean Chungkookjang and 19.08 mg/g at $45^{\circ}C$ in black soybean Chungkookjang. The highest amino type nitrogen content was 420 mg%/g in yellow soybean Chungkookjang and 194 mg%/g in black soybean Chungkookjang at $40^{\circ}C$. The highest pH was 7.92 at $40^{\circ}C$ in yellow soybean Chungkookjang and 7.59 at $45^{\circ}C$ in black soybean Chungkookjang. The highest number of viable cell was 9.3 log CFU/g at $40^{\circ}C$ in yellow soybean Chungkookjang and at $35^{\circ}C$ in black soybean Chungkookjang. On the other hand, the lowest ammonia type nitrogen content was 225 mg%/g at $45^{\circ}C$ in yellow soybean Chungkookjang and 80 mg%/g at $40^{\circ}C$ in black soybean Chungkookjang. Yellow soybean Chungkookjang showed high protease activity, pH and amino type nitrogen, whereas black soybean Chungkookjang showed high amylase activity and reducing sugar.
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제안 방법
환원당은 DNS법을 사용하여 정량하였으며, glucose를 표준물질로 사용하였다. pH 측정은 pH meter를 이용하여 측정하였다.
청국장 발효균주를 분리하기 위하여 사용한 시료는 밀양지역 각 가정에서 전통적으로 제조된 청국장 20점, 된장 23점 및 밀양의 논에서 수집한 볏짚 47점이었다. 각 시료는 멸균수를 이용하여 단계별로 희석하였다. 이때, Bacillus 균주만을 선별하기 위해 항온수조를 이용하여 90℃에서 5분 동안 방치했다.
Bacillus amyloliquefaniens C2를 Luria-Bertani 배지를 이용하여 30℃에서 200 rpm으로 20시간 동안 배양한 배양액을 starter로 이용하였다. 대두(황태 및 흑태)는 autoclave를 이용하여 121℃에서 30분간 증자하였다. 증자한 대두에 상기 균주 배양액을 1% (w/v) 접종했다.
따라서 본 연구에서는 순수분리된 발효균주를 이용하여 발효 온도(35℃, 40℃, 45℃)를 달리하여 제조한 황태 및 흑태 청국장의 발효 중 이화학성분 및 효소활성 변화를 조사하였다.
장류 제품의 발효와 함께 발생하는 불쾌취는 단백질 분해과정에서 탈아민에 의하여 생성되는 암모니아태 질소가 식품 내에 과량으로 축적될 때 나타나는 현상이다. 따라서 장류의 소비기피를 유발하는 물질인 암모니아태 질소 함량을 측정하였다(Fig. 6). 35℃에서는 황태 및 흑태에서 각각 487 mg%/g, 634 mg%/g의 함량을 나타내었으며, 40℃, 45℃와 비교시 2배 이상 차이가 나타났다.
분석된 염기서열을 NCBI GenBank의 데이터베이스를 이용하여 유사균주와 상동성을 비교하였다. 또한 염기서열을 Clustal X program을 이용하여 정렬한 후, MEGA 5 프로그램을 이용하여 분리균주의 계통분류학적 위치를 결정하였다.
4 M trichloroacetic acid (TCA) 용액 1 ml를 가하여 30분간 방치하여 반응을 중지시켰다. 반응 중지액을 원심분리한 후, 상등액을 취하여 UV/VIS spectrophotometer를 이용하여 280 nm에서 흡광도를 측정하였다(Shon et al., 2001). 효소 1 unit는 0.
발효온도 및 콩 종류에 따른 청국장의 pH를 측정하였다(Fig. 7). 황태 청국장은 발효 초기 6.
발효온도 및 콩의 종류에 따른 청국장의 구수한 맛 성분인 아미노산과 polypeptide 등을 생성하는 protease 활성을 측정하였다(Fig. 2). 황태 청국장은 35℃에서 배양했을 경우, 42시간에 854 U/g로 가장 높은 활성을 나타내었다.
본 연구에서는 가정에서 제조한 청국장으로부터 protease 활성이 우수하고 점성 콜로니를 형성하는 Bacillus amyloliquefaciens C2를 분리 및 동정하였다. 이 균주를 이용하여 청국장을 제조한 결과 황태 청국장은 amylase 활성, 환원당, 아미노태 질소 함량, pH 및 생균수 등이 40℃에서 가장 높게 나타났으며, 발효 최적 조건은 발효온도 40℃, 발효 시간 48시간이었다(Table 1).
본 연구에서는 가정에서 제조한 청국장으로부터 순수분리한 Bacillus amyloliquefaciens C2를 이용하여 콩 종류와 발효온도에 따른 청국장의 품질 특성 변화를 조사하였다. Protease 활성은 35℃에서 배양했을 때 황태 청국장에서 854 U/g, 흑태 청국장에서 847 U/g로 가장 높았다.
분리균주는 16S rRNA gene 염기서열을 분석하여 동정하였다. 16S rRNA gene을 증폭하는데 사용된 primer는 E.
Clear zone의 크기가 크고, 명확하고, 성장속도가 빠른 colony만을 1차 선별하여 순수분리하였다. 순수분리 된 각 균주를 skim milk 액체배지에서 배양하면서 일정 시간 간격으로 protease 활성을 측정하여 높은 protease 활성을 보인 균주를 공시균주로 선택하였다.
Skim milk 배지상에서 clear zone의 크기가 크고, 성장속도가 빠른 26균주를 선정하였다(자료 미제시). 이들의 protease 활성을 측정하여 protease 생성능과 점질물 생성능이 우수한 C2를 최종 선정하여 분류학적 위치를 조사하였다.
증자한 대두에 상기 균주 배양액을 1% (w/v) 접종했다. 접종 후, 35℃, 40℃, 45℃에서 48시간 동안 발효시켜 청국장을 제조하였다. 청국장과 증류수를 1:6 (w/v)의 비율로 혼합하여 분쇄 및 원심분리(10,000×g, 15분)한 후, 상등액을 회수하여 효소활성 및 이화학적 특성 분석에 사용하였다.
청국장의 기능성을 강화하고 발효를 촉진시킬 수 있는 균주를 분리할 목적으로 가정에서 제조한 청국장, 된장 및 볏짚을 수거하여 균주 분리를 수행하였다. 청국장 발효과정 중에서 단백질의 분해속도가 가장 중요한 발효 인자로 보고되어 있기 때문에 protease의 활성을 중심으로 균주 분리를 실시하였다. Skim milk 배지상에서 clear zone의 크기가 크고, 성장속도가 빠른 26균주를 선정하였다(자료 미제시).
청국장 발효에 따른 각 변수의 해석은 얻어진 결과 중 가장 높은 활성을 기준으로 비교하였으며, 또한 배양시간 경과에 따른 활성의 변화 패턴도 비교하였다.
청국장 발효에서는 단백질 뿐만 아니라 전분의 분해도 중요한 인자인 것으로 알려져 있어 청국장 발효 중 amylase 활성을 측정하였다(Fig. 3). 황태 청국장은 40℃에서 배양했을 때 6시간에 3.
청국장과 증류수를 1:6 (w/v)의 비율로 혼합하여 분쇄 및 원심분리(10,000×g, 15분)한 후, 상등액을 회수하여 효소활성 및 이화학적 특성 분석에 사용하였다.
청국장의 기능성을 강화하고 발효를 촉진시킬 수 있는 균주를 분리할 목적으로 가정에서 제조한 청국장, 된장 및 볏짚을 수거하여 균주 분리를 수행하였다. 청국장 발효과정 중에서 단백질의 분해속도가 가장 중요한 발효 인자로 보고되어 있기 때문에 protease의 활성을 중심으로 균주 분리를 실시하였다.
청국장의 미생물 생육 정도를 분석하기 위해 생균수를 측정 하였다(Fig. 8). 황태 청국장은 35℃에서 발효 12시간까지 급격하게 증가하였다가 감소하였고, 40℃와 45℃에서는 발효시간이 경과함에 따라 꾸준히 증가하였다.
청국장 발효과정 중, 콩의 전분은 Bacillus 등이 분비하는 효소의 작용으로 가수분해되어 청국장 단맛 성분의 주체인 당류가 생성된다. 콩에 있는 전분이 glucose로 전환되는 양을 조사하기 위하여 발효시간에 따른 환원당의 양을 측정하였다(Fig. 4). 황태 청국장은 40℃에서 배양했을 경우, 16.
대상 데이터
청국장 발효균주를 분리하기 위하여 사용한 시료는 밀양지역 각 가정에서 전통적으로 제조된 청국장 20점, 된장 23점 및 밀양의 논에서 수집한 볏짚 47점이었다. 각 시료는 멸균수를 이용하여 단계별로 희석하였다.
데이터처리
coli 16S rRNA gene의 보존염기순서에 근거하여 합성된 27F (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′) primer와 1492R (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′) primer였다. 분석된 염기서열을 NCBI GenBank의 데이터베이스를 이용하여 유사균주와 상동성을 비교하였다. 또한 염기서열을 Clustal X program을 이용하여 정렬한 후, MEGA 5 프로그램을 이용하여 분리균주의 계통분류학적 위치를 결정하였다.
이론/모형
1. Phylogenetic tree constructed using 16S rRNA gene sequences, available in the GenBank database, employing the Neighbour-joining method. The bar indicates a Jukes-Cantor distance of 0.
4 M TCA 1 ml를 첨가하여 30분간 방치하여 반응을 중지시켰다(Oh and Eom, 2008). 반응 중지액을 원심분리하여 회수한 상등액을 dinitrosalicylic acid (DNS)법으로 maltose의 양을 측정하였다(Miller, 1959). 이 때 표준곡선은 maltose를 이용하여 작성하였다.
생균수는 청국장 1 g을 멸균수 9 ml에 첨가하여 계단희석한 후, 표준평판법에 의하여 배양하여 계수하였다.
아미노태 질소 함량(AOAC, 1990)은 formol 적정법을 사용하여 정량하였고, 암모니아태 질소 함량(AOAC, 1990)은 indophenol blue법을 사용하여 정량하였으며, NH4Cl을 표준물질로 사용하였다. 환원당은 DNS법을 사용하여 정량하였으며, glucose를 표준물질로 사용하였다.
Cl을 표준물질로 사용하였다. 환원당은 DNS법을 사용하여 정량하였으며, glucose를 표준물질로 사용하였다. pH 측정은 pH meter를 이용하여 측정하였다.
성능/효과
Nutrient agar plate에서 부정형(irregular)의 볼록한 콜로니를 형성하였으며, 콜로니의 색깔은 흰색이었다. 16S rRNA gene 염기서열 분석 결과, 실험균주는 Bacillus amyloliquefaciens와 98%의 상동성을 나타내었다. 또한 16S rRNA gene의 구조에 근거하여 기존 균주들과의 분자계통학적 유연관계를 파악하기 위하여 계통수를 작성한 결과, C2 균주는 B.
, 2006). 따라서 35℃에서 암모니아태 질소함량이 높으므로 단백질 분해산물인 질소성분은 아미노태 질소보다 암모니아태 질소로 전환이 많이 된 것이고, 40℃에서는 암모니아태 질소보다는 아미노태 질소 함량이 더 높으므로 아미노태 질소로 전환이 많이 된 것으로 보인다. 45℃에서는 암모니아태 질소보다는 아미노태 질소 함량이 더 높으므로 아미노태 질소로 전환이 많이 된 것으로 보이지만, 모든 온도에서 protease 활성에서 큰 차이가 없었기 때문에 단백질이 수용성 질소, peptide를 거쳐 아미노태 질소와 암모니아태 질소로까지 분해되는 과정이 천천히 이루어지거나 polyglutamate 대사에 이용된 것으로 사료된다.
1). 따라서 실험균주는 Bacillus amyloliquefaciens C2로 명명하였다.
16S rRNA gene 염기서열 분석 결과, 실험균주는 Bacillus amyloliquefaciens와 98%의 상동성을 나타내었다. 또한 16S rRNA gene의 구조에 근거하여 기존 균주들과의 분자계통학적 유연관계를 파악하기 위하여 계통수를 작성한 결과, C2 균주는 B. amyloliquefaciens와 가장 가깝게 나타났다(Fig. 1). 따라서 실험균주는 Bacillus amyloliquefaciens C2로 명명하였다.
흑태 청국장의 발효 최적 조건은 발효 온도 45℃, 발효 시간은 48시간이었다. 또한 40℃와 45℃에서 발효한 황태 및 흑태 청국장은 암모니아태 질소의 생성량이 적어 불쾌취를 감소시키는 측면에서 위에 언급한 발효온도에서 발효하는 것이 적당함을 알 수 있다. 결론적으로 청국장 발효균주의 순수분리 및 사용으로 청국장 제조 최적조건을 확립하였으며, 이러한 결과는 청국장의 품질 향상, 섭취 및 이용에 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.
5). 모든 청국장에서 발효시간이 경과함에 따라 증가하였고, 특히 황태 청국장에서 높은 함량을 나타내었다. 황태 청국장의 경우, 40℃에서 420 mg%/g로 가장 높았고, 45℃, 35℃에서 각각 287 mg%/g, 189 mg%/g의 함량을 나타내었다.
이 균주를 이용하여 청국장을 제조한 결과 황태 청국장은 amylase 활성, 환원당, 아미노태 질소 함량, pH 및 생균수 등이 40℃에서 가장 높게 나타났으며, 발효 최적 조건은 발효온도 40℃, 발효 시간 48시간이었다(Table 1). 반면, 흑태 청국장은 모든 온도에서 효소 활성 및 이화학적 성분이 높게 나타났으며, 특히 amylase 활성 및 환원당 함량이 황태 청국장보다 높게 나타났다. 흑태 청국장의 발효 최적 조건은 발효 온도 45℃, 발효 시간은 48시간이었다.
흑태 청국장의 경우, 35℃에서 배양했을 때 48시간에 847 U/g로 가장 높은 활성을 나타내었으며, 40℃에서는 48시간에 796 U/g, 45℃에서는 36시간에 778 U/g의 활성을 나타내었다. 발효온도에 따라서는 낮은 온도에서 높은 protease 활성을 나타내었고, 콩 종류에 따라서는 황태가 흑태보다 높은 활성을 나타내었지만, 발효온도 및 콩 종류에 따라 최고함량에서 큰 차이는 나타나지 않았다.
본 연구에서는 가정에서 제조한 청국장으로부터 protease 활성이 우수하고 점성 콜로니를 형성하는 Bacillus amyloliquefaciens C2를 분리 및 동정하였다. 이 균주를 이용하여 청국장을 제조한 결과 황태 청국장은 amylase 활성, 환원당, 아미노태 질소 함량, pH 및 생균수 등이 40℃에서 가장 높게 나타났으며, 발효 최적 조건은 발효온도 40℃, 발효 시간 48시간이었다(Table 1). 반면, 흑태 청국장은 모든 온도에서 효소 활성 및 이화학적 성분이 높게 나타났으며, 특히 amylase 활성 및 환원당 함량이 황태 청국장보다 높게 나타났다.
후속연구
또한 40℃와 45℃에서 발효한 황태 및 흑태 청국장은 암모니아태 질소의 생성량이 적어 불쾌취를 감소시키는 측면에서 위에 언급한 발효온도에서 발효하는 것이 적당함을 알 수 있다. 결론적으로 청국장 발효균주의 순수분리 및 사용으로 청국장 제조 최적조건을 확립하였으며, 이러한 결과는 청국장의 품질 향상, 섭취 및 이용에 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
청국장 발효는 어떤 요인에 영향을 받는가?
청국장 발효는 대두의 종류, 사용균주, 발효온도, 습도 등에 의해 큰 영향을 받는 것으로 보고되어 있다(Kim et al., 2006).
콩은 어떤 기능성 물질을 함유하고 있는가?
청국장의 맛과 품질을 좌우하는 콩은 오랫동안 쌀 다음으로 많이 사용되고 있는데 필수아미노산과 필수지방산의 함량이 높아 단백질과 지방의 공급원으로 이용되어 왔으며, isoflavone, saponin, phytic acid, oligosaccharides 등 다양한 생리활성을 가진 기능성 물질들을 함유하고 있다(Eom et al., 2009; Yoo, 2012).
청국장 발효는 일반적으로 어떤 온도에서 이뤄집니까?
, 2006). 일반적으로 청국장은 40–42℃에서 발효시킨다고 알려져 있지만, 발효온도를 달리하여 제조한 청국장에 관한 연구는 거의 이루어지지 않았다.
참고문헌 (16)
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