본 연구에서는 쌍떡잎식물 쥐손이풀목 소태나무과에 속하는 소태나무 잎 methanol 추출물을 이용하여 항염증 및 항산화 활성을 확인해 보았다. 먼저, 소태나무 잎 methanol 추출의 항산화 활성을 알아보기 위해 폴리페놀, 플라보노이드 함량을 측정하였으며 그 결과, 소태나무 잎 추출물에서 폴리페놀과 플라보노이드의 함량은 각각 $367.52{\mu}g/mg$, $46.41{\mu}g/mg$으로 나타나 플라보노이드 보다는 다량의 폴리페놀을 함유하는 것을 확인하였다. 항염증 활성을 확인하기 위해 염증 매개물질인 NO와 염증성 cytokine인 $PGE_2$를 생성을 측정하였다. 소태나무 잎추출물을 LPS로 염증을 유도한 대식세포에 농도별로 처리한 결과 NO의 생성을 $100{\mu}g/ml$의 농도에서 80%까지 억제하는 것으로 나타났으며, 염증성 cytokine인 $PGE_2$의 생성을 $50{\mu}g/ml$, $100{\mu}g/ml$의 농도에서 각각 85%, 90%까지 생성을 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 소태나무 잎 추출물이 염증반응과 관련된 iNOS, COX-2, p-NF-${\kappa}B$, p-$I{\kappa}B$의 단백질 발현에 미치는 영향을 확인한 결과, iNOS 단백질은 농도 유의적으로 그 발현이 감소하는 것을 확인하였으며, COX-2 단백질의 경우 12.5, 25, $50{\mu}g/ml$의 농도에서는 큰 변화 나타나지 않았지만 $100{\mu}g/ml$의 농도에서 그 발현이 크게 억제되는 것을 확인하였다. 또한 iNOS와 COX-2의 발현을 조절하는 NF-${\kappa}B$ signaling을 확인해 본 결과, $I{\kappa}B$와 NF-${\kappa}B$의 인산화를 효과적으로 감소시킴으로써 항염증 활성을 나타내는 것을 확인 할 수 있었다. 이상의 결과와 같이, 소태나무 잎 추출물은 항산화 활성과 우수한 항염증 활성을 나타내는 기능성 소재로의 활용이 가능할 것이라고 사료된다.
본 연구에서는 쌍떡잎식물 쥐손이풀목 소태나무과에 속하는 소태나무 잎 methanol 추출물을 이용하여 항염증 및 항산화 활성을 확인해 보았다. 먼저, 소태나무 잎 methanol 추출의 항산화 활성을 알아보기 위해 폴리페놀, 플라보노이드 함량을 측정하였으며 그 결과, 소태나무 잎 추출물에서 폴리페놀과 플라보노이드의 함량은 각각 $367.52{\mu}g/mg$, $46.41{\mu}g/mg$으로 나타나 플라보노이드 보다는 다량의 폴리페놀을 함유하는 것을 확인하였다. 항염증 활성을 확인하기 위해 염증 매개물질인 NO와 염증성 cytokine인 $PGE_2$를 생성을 측정하였다. 소태나무 잎추출물을 LPS로 염증을 유도한 대식세포에 농도별로 처리한 결과 NO의 생성을 $100{\mu}g/ml$의 농도에서 80%까지 억제하는 것으로 나타났으며, 염증성 cytokine인 $PGE_2$의 생성을 $50{\mu}g/ml$, $100{\mu}g/ml$의 농도에서 각각 85%, 90%까지 생성을 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 소태나무 잎 추출물이 염증반응과 관련된 iNOS, COX-2, p-NF-${\kappa}B$, p-$I{\kappa}B$의 단백질 발현에 미치는 영향을 확인한 결과, iNOS 단백질은 농도 유의적으로 그 발현이 감소하는 것을 확인하였으며, COX-2 단백질의 경우 12.5, 25, $50{\mu}g/ml$의 농도에서는 큰 변화 나타나지 않았지만 $100{\mu}g/ml$의 농도에서 그 발현이 크게 억제되는 것을 확인하였다. 또한 iNOS와 COX-2의 발현을 조절하는 NF-${\kappa}B$ signaling을 확인해 본 결과, $I{\kappa}B$와 NF-${\kappa}B$의 인산화를 효과적으로 감소시킴으로써 항염증 활성을 나타내는 것을 확인 할 수 있었다. 이상의 결과와 같이, 소태나무 잎 추출물은 항산화 활성과 우수한 항염증 활성을 나타내는 기능성 소재로의 활용이 가능할 것이라고 사료된다.
This study was performed to evaluate the anti-inflammatory and antioxidant activities of methanol extract from the leaves of Picrasma quassioides BENNET (PLME). The antioxidant effects of PLME were measured based on polyphenol and flavonoid contents. PLME was found to have $367.52{\mu}g/mg$
This study was performed to evaluate the anti-inflammatory and antioxidant activities of methanol extract from the leaves of Picrasma quassioides BENNET (PLME). The antioxidant effects of PLME were measured based on polyphenol and flavonoid contents. PLME was found to have $367.52{\mu}g/mg$ and $46.61{\mu}g/mg$ high polyphenol and flavonoid contents. Cell viability was determined by MTT assay. The production of nitric oxide (NO) and prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$) was measured by Griess assay and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In order to effectively anti-inflammatory agents, we examined the inhibitory effects on the production of lipopolysaccharide (LPS)-induced NO and $PGE_2$ in RAW 264.7 cells. PLME significantly decreased the production of NO and $PGE_2$ in a dose-dependent manner, and also reduced the expression of iNOS, a COX-2 protein. In addition, PLME reduced the NF-${\kappa}B$, $I{\kappa}B$ phosphorylation in RAW 264.7 cells upon stimulation with LPS (100 ng/ml) for 24 h. These results provide evidence for the anti-inflammatory and antioxidant effects of Picrasma quassioides leaves.
This study was performed to evaluate the anti-inflammatory and antioxidant activities of methanol extract from the leaves of Picrasma quassioides BENNET (PLME). The antioxidant effects of PLME were measured based on polyphenol and flavonoid contents. PLME was found to have $367.52{\mu}g/mg$ and $46.61{\mu}g/mg$ high polyphenol and flavonoid contents. Cell viability was determined by MTT assay. The production of nitric oxide (NO) and prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$) was measured by Griess assay and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In order to effectively anti-inflammatory agents, we examined the inhibitory effects on the production of lipopolysaccharide (LPS)-induced NO and $PGE_2$ in RAW 264.7 cells. PLME significantly decreased the production of NO and $PGE_2$ in a dose-dependent manner, and also reduced the expression of iNOS, a COX-2 protein. In addition, PLME reduced the NF-${\kappa}B$, $I{\kappa}B$ phosphorylation in RAW 264.7 cells upon stimulation with LPS (100 ng/ml) for 24 h. These results provide evidence for the anti-inflammatory and antioxidant effects of Picrasma quassioides leaves.
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제안 방법
단백질이 이동된 membrane은 fast green solution으로 transfer의 유무를 확인한 후, 5% non-fat skim milk solution으로 blocking하였다. 4℃에서 일차 항체의 발현 정도를 검토하기 위하여 TBST (Tris-Buffered Saline and Tween 20) 용액에 1:1,000으로 희석하여 24시간 반응시킨 후 TBST로 3회 세척하였다. 계속하여 이차항체를 2시간 반응시키고 다시 TBST로 3회 세척하였다.
5, 25, 50, 100 μg/ml의 농도의 소태나무 추출물을 처리하였다. 그 결과, LPS에 의해 RAW 264.7 세포로부터 생성이 증가된 NO를 농도 유의적으로 저해하는 것으로 나타났으며(Fig. 1A), 이러한 NO생성 저해가 세포독성에 기인하는 것인지를 확인하기 위해 MTT assay를 이용하여 세포독성을 측정하였다. 그 결과, 소태나무 잎 추출물 100 μg/ml의 농도 까지 세포의 생존율에 영향을 미치지 않았기 때문에 RAW 264.
즉 PGE2의 생성은 혈관 확장을 일으키는 작용에 의해 일어나는 염증 전 단계로써 통증과 발열을 일으킨다[12]. 따라서 RAW 264.7 세포에 LPS와 소태나무 잎 추출물을 처리한 후, PGE2 생성량을 ELISA kit을 이용하여 측정하였다(Fig. 2). RAW 264.
폴리페놀계 물질들은 식물체에 특수한 색깔을 부여하고 산화 환원반응에서 기질로 작용하며, 한 분자 내에 2개 이상의 phenolic hydroxyl (OH)기를 가진 방향족 화합물을 가리키며 플라보노이드와 탄닌이 주성분으로 충치 예방, 고혈압 억제, 항에이즈, 항산화, 항암 등의 다양한 생리활성을 가진다[35]. 먼저 소태나무 잎 메탄올 추출물에 존재하는 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 각각 tannic acid, quercetin을 기준 물질로 하여 측정하였다(Table 1). 그 결과, 소태나무 잎 추출물의 총 폴리페놀 함량은 367.
배양 종료 후 상등액을 제거하고 각 well에 100 μl의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 microplate reader로 550 nm에서 흡광도를 측정하였고, 세포독성은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.
본 실험에서 사용한 소태나무 잎은 대구시 약령시장에서 건조 상태의 것을 구입하여 사용하였다. 시료는 불순물을 제거하기 위하여 수세한 후 건조하여 사용하였고, 무게의 10배 량(w/v)의 80% 메탄올을 가하여 24시간 동안 정치하여 총 3회 반복 추출 하였다. 추출액은 여과지(Whatman No.
이 때 tannic acid를 이용한 표준곡선은 5, 10, 25, 50, 75, 100μg/ml가 되도록 하여 위와 같은 방법으로 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.
총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법[7]을 응용하여 측정하였다. 즉 각 메탄올 추출물 시료 1 mg을 증류수 1 ml에 녹이고 10배 희석한 희석액 2 ml에 2배 희석한 Folin시약 2 ml를 첨가하고 잘 혼합한 후 3분간 방치한 후 10% Na2CO3 2 ml를 넣고 1시간 반응시킨 후 UV/Visible spectrophotometer (UVIKON 922, Kontron, Italy)를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다. 이 때 tannic acid를 이용한 표준곡선은 5, 10, 25, 50, 75, 100μg/ml가 되도록 하여 위와 같은 방법으로 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.
증류수로 세척하고 membrane에 ECL detection kit의 발색시약 Ⅰ과 Ⅱ를 1:1로 섞은 후에 혼합액을 도포하고, X-ray film에 노출하여 현상한 후 film 상에서 iNOS, COX-2 및 IκB, NF-κB의 phosphorylation을 관찰하였다.
3 ml를 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 spectrophotometer를 이용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 quercetin을 사용하였으며, 표준물질의 검량선과 비교하여 함량을 구하였다.
현재 국내·외적으로 천연물로부터 기능성 성분의 소재를 발굴하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 소태나무 잎의 생리활성에 관한 연구는 아직까지 미진한 편이며, 따라서본 연구에서는 소태나무 잎 추출물을 이용하여 총 폴리페놀, 플라보노이드 함량을 조사하고 LPS로 염증반응이 유도된 RAW 264.7 cell에 소태나무 잎 메탄올 추출물을 처리하여, 항염증 활성 효과를 알아보았다.
활성 질소종(reactive nitrogen species)의 하나이며, 최근 염증반응의 중요한 작용인자로 알려진 nitric oxide (NO) 생성 저해에 대한 소태나무 잎 추출물의 효과를 알아보기 위해 LPS 로 NO의 생성을 유도한 뒤 12.5, 25, 50, 100 μg/ml의 농도의 소태나무 추출물을 처리하였다.
활성화된 RAW 264.7 세포로부터 생성되는 염증 매개 물질인 PGE2의 양을 측정하기 위해 Commercial competitive enzyme immunoassay kit를 구입하여 실험하였다. RAW 264.
대상 데이터
1% naphthylethylendiamine in 25% phosphoric acid) 100 μl를 혼합하여 96 well plates에서 10분간 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO2- 표준곡선은 NaNO2를 농도별로 조제하여 사용하였다.
대식세포 계열(murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포주는 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양 받았으며, 10% FBS (fetal bovine serum)와 1% antibiotics (penicillin/streptomycin)를 첨가한 DMEM (Gibco-BRL, Rockville, MD, USA)배지를 이용하여 5% CO2가 존재하는 37℃ incubator에서 1주일에 2~3회 계대 배양하였다.
본 실험에서 사용한 소태나무 잎은 대구시 약령시장에서 건조 상태의 것을 구입하여 사용하였다. 시료는 불순물을 제거하기 위하여 수세한 후 건조하여 사용하였고, 무게의 10배 량(w/v)의 80% 메탄올을 가하여 24시간 동안 정치하여 총 3회 반복 추출 하였다.
데이터처리
모든 결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, 유의성 검사는 SPSS TM version 20.0 (SPSS Inc., Chicago, USA)을 이용하여 one-way ANOVA를 실시하였고, 대조구인 분화 Control에 대한 시료 처리군의 통계적 유의성은 Duncan's multiple range test로 검증하였다.
이론/모형
RAW 264.7 세포로부터 생성되는 활성 질소종인 nitric oxide (NO)의 양은 Green 등[10]의 방법을 이용하여 세포 배양액 중 존재하는 NO2-형태를 Griess Reagent와 반응시켜 측정하였다. RAW 264.
많은 염증 억제 약물들의 작용기전은 prostaglandin 합성 억제를 나타내며, 이는 COX-2의 생성 및 활성저해에 의한 것이다[28, 32]. 따라서 소태나무잎 추출물의 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Western blot 방법을 이용하여 세포질 내에서의 iNOS와 COX-2 단백질의 발현량을 조사하였다(Fig. 3). RAW 264.
시료 추출물의 총 플라보노이드 함량은 Nieva Moreno법[24]을 이용하여 측정하였다. 각 시료 추출물 0.
시료의 세포증식과 독성을 측정하기 위해 Green 등의 방법[9]에 따라 3-(3,4-dimethyl- thiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay를 실시하였다. MTT assay는 미토콘드리아의 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT가 불용성의 보라색 formazan으로 환원되는 원리를 이용한 방법으로, 생성된 formazan의 흡광도는 살아있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다.
총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법[7]을 응용하여 측정하였다. 즉 각 메탄올 추출물 시료 1 mg을 증류수 1 ml에 녹이고 10배 희석한 희석액 2 ml에 2배 희석한 Folin시약 2 ml를 첨가하고 잘 혼합한 후 3분간 방치한 후 10% Na2CO3 2 ml를 넣고 1시간 반응시킨 후 UV/Visible spectrophotometer (UVIKON 922, Kontron, Italy)를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.
성능/효과
LPS에 의해 NO의 생성이 증가한 RAW 264.7 세포에 Bulnesia sarmienti 추출물을 처리하여 100 μg/ml의 농도에서 NO의 생성을 효과적으로 억제시키는 것을 확인 하였으며 200 μg/ml의 농도까지 세포독성이 없는 것을 확인 하였다.
RAW 264.7 cell에서 LPS (100 ng/ml) 처리로 인해 iNOS 단백질의 발현이 증가하였고 소태나무 잎 추출물을 농도 별로 처리 하였을 때 12.5 μg/ml의 농도에서부터 유의적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3A).
RAW 264.7 세포에 100 ng/ml의 LPS를 처리했을 때, PGE2의 생성은 약 100배 증가 되었으며, 소태나무 잎 추출물을 각각 50, 100 μg/ml로 처리했을 때 PGE2 함량은 약 837, 577 pg/ml의 농도를 보여 소태나무 잎 추출물이 각각 85%, 90% 이상의 PGE2 생성 억제를 보였다(Fig. 2).
p-Iκ-B는 LPS에 의해 증가되었으며 소태나무 잎 추출물을 농도 별로 처리하였을 때, 100 μg/ml의 농도에서 발현을 효과적으로 억제되는 것으로 나타나 소태나무 잎 추출물이 Iκ-B의 인산화를 감소시키는 것을 알 수 있었다.
그 결과, 소태나무 잎 추출물 100 μg/ml의 농도 까지 세포의 생존율에 영향을 미치지 않았기 때문에 RAW 264.7 세포에 독성을 나타내지 않은 것을 확인하였다(Fig. 1B).
그 결과, 소태나무 잎 추출물의 총 폴리페놀 함량은 367.52 μg/mg으로 높은 폴리페놀 함량을 보였다.
또한, 염증반응에서 중요한 역할을 하는 COX-2 단백질 역시 LPS 처리로 인해 그 발현량이 증가하였으며 소태나무 잎 추출물을 농도 별로 처리하였을 때 12.5, 25, 50 μg/ml에서는 COX-2의 발현의 변화가 거의 없었지만 100 μg/ml에서는 COX-2의 발현이 크게 억제되는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 3B).
본 실험에 사용한 소태나무잎 추출물이 25 μg/ml의 농도에서부터 유의적인 NO생성 억제 효과를 나타낸 것을 보면 유창목 추출물과 비교하여 뛰어난 항염증 활성을 나타낸다고 사료된다.
소태나무 추출물의 경우 다소 낮은 50 μg/ml의 농도에서도 PGE2 생성을 85% 감소시키는 것으로 나타나 뛰어난 PGE2 생성 억제 활성을 확인 할 수 있었다.
이와 더불어 LPS에 의해 증가하는 p-NF-κB의 발현을 소태나무 잎 추출물 처리에 의하여 농도 유의적으로 감소시켰으며 이 결과는 소태나무 잎 추출물이 대식세포에서 LPS에 의해 활성화되는 NF-κB signaling을 억제할 수 있음을 시사한다.
폴리페놀 함량은 어성초, 홍화, MIX-2 ethanol 추출물이 각각 58.98, 60.79, 57.74 μg/mg으로 가장 높게 나타났으며 플라보노이드 함량은 어성초, 홍화가 각각 36.86, 19.42 μg/mg 으로 나타나 본 연구에서 나타난 소태나무 잎 추출물(폴리페놀: 367.52 μg/mg, 플라보노이드: 46.41 μg/mg)의 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 매우 높은 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
한방에서 소태나무의 잔가지와 열매는 어떤 증상의 치료제로 쓰이는가?
)는 쌍떡잎 식물 쥐손이풀목 소태나무과의 소교목으로 잎과 줄기의 속껍질에서 소의 태처럼 지독히 쓴맛이 나는 것에서 유래되었다. 건위, 조습, 살균의 효능이 있어 한방에서는 잔가지와 열매를 채취하여 소화불량, 위장염, 폐결핵, 습진, 옹종(癰腫), 개선(疥癬) 등의 증상에 치료제로 사용하며, 민간에서는 나무 전체를 솥에 넣고 끓인 물을 살충제로 이용한다. 소태나무의 주요성분으로는 quasinoids, tirucallanes, ionone, alkaloids등이 알려져 있으며[21, 26], 소태나무 열매에는 arbutin, phlorin, koaburaside, syringin, citrusin B, cnidioside B, flavaprenin 7,4-diglucoside, phenyl propanoids와 phenolic compound 등[13]이 함유되어 있는 것으로 보고되어 있다.
소태나무는 무엇인가?
DON) BENN.)는 쌍떡잎 식물 쥐손이풀목 소태나무과의 소교목으로 잎과 줄기의 속껍질에서 소의 태처럼 지독히 쓴맛이 나는 것에서 유래되었다. 건위, 조습, 살균의 효능이 있어 한방에서는 잔가지와 열매를 채취하여 소화불량, 위장염, 폐결핵, 습진, 옹종(癰腫), 개선(疥癬) 등의 증상에 치료제로 사용하며, 민간에서는 나무 전체를 솥에 넣고 끓인 물을 살충제로 이용한다.
소태나무의 잎과 줄기의 속껍질에서 어떤 맛이 나는가?
DON) BENN.)는 쌍떡잎 식물 쥐손이풀목 소태나무과의 소교목으로 잎과 줄기의 속껍질에서 소의 태처럼 지독히 쓴맛이 나는 것에서 유래되었다. 건위, 조습, 살균의 효능이 있어 한방에서는 잔가지와 열매를 채취하여 소화불량, 위장염, 폐결핵, 습진, 옹종(癰腫), 개선(疥癬) 등의 증상에 치료제로 사용하며, 민간에서는 나무 전체를 솥에 넣고 끓인 물을 살충제로 이용한다.
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