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문제 정의
- 따라서 본 연구는 삼백초 n-hexane 분획물이 항균 및 항바이러스 효능이 있는 것으로 판단하고 추후 항생제 대체 물질로서의 이용 가능성을 확인하였다.
- 적송수피 추출물의 항생제 대체효과에 관한 연구(Park, 2010), 복합 생균제에 유기산과 β-glucan을 이용해 항생제를 대체할 수 있는 혼합급여 연구(Lee 등, 2011), 비육 사료에 한방 부산물 등을 복합 처리한 항생제 대체 물질 연구(Kang 등, 2007) 등 여러 연구가 진행되고 있는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 삼백초의 분획별 추출물을 이용하여 대표적인 Gram (＋)와 Gram (－)에 대한 항균 효과와 소설사병 유발 바이러스(BVD)에 대한 항바이러스 효과를 알아보았다.
- 본 연구에서는 예로부터 민간에서 사용해온 삼백초를 이용하여 항균 효과 및 BVD 바이러스에 대한 항바이러스 효과를 동시에 나타낼 수 있는 물질탐색을 목적으로 하였으며 그 실험 결과 삼백초 n-hexane 분획물이 항균 및 항바이러스 양쪽에 효능이 관찰되었다. 따라서 삼백초 추출 분획물은 항균 및 항바이러스 효능을 동시에 지닌 천연소재로서 이용 가능함을 확인할 수 있었으며 가축 질병 예방 및 치료를 위한 기본 연구자료로 이용될 수 있는 동시에 화학적 항생제를 대체할 수 있는 천연소재 개발을 위한 자료로서 활용이 가능할 것으로 사료된다.
- 또한 MDBK (Madin-darby bovine kidney) 세포와 BVD (Bovine viral diarrhea) 바이러스에 대한 세포독성 및 항바이러스 활성을 측정하였다. 이를 통해 삼백초 추출물에서 항균 효과와 항바이러스 효과를 최대화 할 수 있는 추출 조건과 적정 농도를 통해 기존 항생제를 대체할 수 있는 천연 항균 및 항바이러스 사료 첨가 물질 개발 가능성을 확인하고자 한다.
제안 방법
- 20 mg/ml 농도로 DMSO에 녹인 추출물은 disc당 10 μl씩 paper disc (Whatman, 6 mm)에 흡수-건조시킨 후 각각의 균이 도말 된 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 37℃에서 12시간 배양한 후 disc 주변에 생성된 clear zone (mm) 을 계측하여 항균활성을 측정하였다.
- 72시간 후 세포병변효과(CPE, cytopathic effect)에 의해 세포가 바닥에서 떨어지면, freezing– thawing을 3회 반복한 후 2000 RPM에서 15분 원심분리 하였다.
- 삼백초 추출물에 대한 항바이러스 시험은 end-point dilution assay인 50% tissue culture infectious dose (TCID 50)를 이용하여 측정하였다. MDBK cell toxicity가 나타나지 않는 삼백초 분획물의 최대적정농도를 설정하여, 그 이하의 농도에서부터 항바이러스 시험에 이용하였다. 바이러스 감염가 측정은 바이러스 감염 후 5일째 50% 이상의 CPE가 발생한 well의 희석단계를 Reed-Muench method로 설정하고 log TCID 50/ml 로 표기하였다(Hierholzer와 Killington, 1996).
- 항균시험용 평판배지는 Mueller-Hinton Agar (MHA, Difco/USA) 배지를 사용하였다. 각각의 균을 106으로 희석한 후 면봉도 말법을 이용하여 MHA배지에 도말하였다. 20 mg/ml 농도로 DMSO에 녹인 추출물은 disc당 10 μl씩 paper disc (Whatman, 6 mm)에 흡수-건조시킨 후 각각의 균이 도말 된 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 37℃에서 12시간 배양한 후 disc 주변에 생성된 clear zone (mm) 을 계측하여 항균활성을 측정하였다.
- 각각의 삼백초 분획물 농도에 따라 BVD virus에 대한 항바이러스 활성을 알아보기 위하여 각 분획물을 농도별로 10진법으로 희석하여 BVD virus 부유액과 반응시킨 후 MDBK 세포에 감염시켰다. 그 후 BVD virus에 감염된 세포를 5일 배양 후, 나타난 희석단계를 삼백초 분획물의 항바이러스 log TCID 50/ml값으로 표시하였다(Table 3).
- 건조된 잎 10 g을 분쇄기(DCM-5500, 퀸즈메이트, Korea)로 분쇄시켜 methyl alcohol (DAEJUNG, Korea)과 1：10 (w/v)의 비율로 혼합하여 추출하였다. 그 후 여과진액여두장치(Pulse meter 220)로 교반 후 membrane filter (Whatman, 47 mm, USA)로 여과하여 rotary vacuum evaporator (61112455, EYELA, CHINA)로 45℃ 수욕상에서 회전감압 농축하였다.
- 계대 배양된 MDBK 세포를 회수하여 3.5×103 cell/ml로 96 well plate에 부유시킨 다음, DMSO를 50, 25, 12.5, 6.25, 3.1, 1.5, 0.7, 0.3, 0.1%로 희석하여 넣고 3일간 배양하여 세포병변효과 (CPE, cytopathic effect)를 관찰하였다.
- 각각의 삼백초 분획물 농도에 따라 BVD virus에 대한 항바이러스 활성을 알아보기 위하여 각 분획물을 농도별로 10진법으로 희석하여 BVD virus 부유액과 반응시킨 후 MDBK 세포에 감염시켰다. 그 후 BVD virus에 감염된 세포를 5일 배양 후, 나타난 희석단계를 삼백초 분획물의 항바이러스 log TCID 50/ml값으로 표시하였다(Table 3). 대조군으로는 천연물을 넣지 않은 BVD virus에 감염된 MDBK 세포(N.
- 삼백초 추출물에 대한 세포 독성시험은 DMSO의세포독성을 일으키지 않는 적정 %로 각각의 삼백초 분획물을 녹였다. 그 후 동일한 방법으로 삼백초 추출물의 농도를 10, 5, 2.5, 1.25, 0.62, 0.31, 0.15, 0.07 mg/ml로 하여, MDBK 세포에 대한 삼백초 분획물의 MNCC를 알아보았다.
- 그 후 여과진액여두장치(Pulse meter 220)로 교반 후 membrane filter (Whatman, 47 mm, USA)로 여과하여 rotary vacuum evaporator (61112455, EYELA, CHINA)로 45℃ 수욕상에서 회전감압 농축하였다. 농축된 추출물에 n-hexane과 D.W를 동량으로 맞춘 후 위 과정을 반복하여 농축하였으며 chloroform, ethyl acetate, butyl alcohol 순으로 극성에 따라 분획하였다(Fig. 1). 각각의 추출물 및 분획물을 20 mg/ml의 농도로 DMSO (dimethyl sulfoxide, BioShop, Canada)에 녹인 다음 0.
- 25 mg/ml 농도의 추출물을 첨가하였다. 대조군으로 균과 천연물을 넣지 않은 Mueller-Hinton broth를 음성대조군(N.C)으로 사용하였고, 각각의 균만 접종된 MuellerHinton broth를 양성대조군(P.C)으로 사용하였다. 균주를 접종하고 37℃에서 배양하였다.
- 그 후 BVD virus에 감염된 세포를 5일 배양 후, 나타난 희석단계를 삼백초 분획물의 항바이러스 log TCID 50/ml값으로 표시하였다(Table 3). 대조군으로는 천연물을 넣지 않은 BVD virus에 감염된 MDBK 세포(N.C)와 BVD virus와 천연물을 넣지 않고 MDBK 세포만 배양(P.C)한것을 대조군으로 설정하였다. 대조군과 비교하였을때 MDBK 세포에 대한 항바이러스 활성은 삼백초 methyl alcohol 추출물에서뿐만 아니라 chloroform, ethyl acetate, butyl alcohol, D.
- 3 mg/ml (Park 등, 1998), 동백 추출물에서 의 최소저해농도가 5 mg/ml (Kang 등, 1998)으로 보고된 것으로 보아 삼백초 추출물의 최소저해농도가 가장 낮은 것으로 판단된다. 두 번째로 삼백초의 BVD바이러스에 대한 항바이러스 능력을 평가하기 위해 우선 세포독성을 실험한 결과, methyl alcohol, n-hexane, butyl alcohol, D.W로 추출한 분획물은 0.62 mg/ml에서 세포 성장에 영향을 미치지 않아 MNCC로 정하였다. 각각의 MNCC는 chloroform 분획물은 0.
- 7%에서 cell toxicity가 적음을 알 수 있다. 따라서 DMSO 0.7%에서 각각의 삼백초 분획물을 녹여 세포독성 실험을 진행한 결과, Table 2에서와 같이 methyl alcohol, n-hexane, butyl al-cohol, D.W 분획물은 0.62 mg/ml에서 세포 성장에 영향을 미치지 않아 MNCC로 정하였다.
- 상기의 실험 결과, Gram (＋)에서 n-hexane 분획물이 뛰어난 항균 활성을 보였다. 따라서 삼백초 n-hexane 분획물을 대상으로 10, 5, 2.5, 1.25, 0.6, 0.3, 0.15 mg/ml의 농도로 24시간 동안 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정하였다. 그 결과 Fig.
- W의 용매로 추출해 대표적인 그람 양성, 음성 세균에 대한 항균활성을 확인하고, 각 용매 추출물별 최소저해농도(MIC)를 측정하였다. 또한 MDBK (Madin-darby bovine kidney) 세포와 BVD (Bovine viral diarrhea) 바이러스에 대한 세포독성 및 항바이러스 활성을 측정하였다. 이를 통해 삼백초 추출물에서 항균 효과와 항바이러스 효과를 최대화 할 수 있는 추출 조건과 적정 농도를 통해 기존 항생제를 대체할 수 있는 천연 항균 및 항바이러스 사료 첨가 물질 개발 가능성을 확인하고자 한다.
- 본 연구에서는 삼백초 잎을 methyl alcohol, chloroform, n-hexane, ethyl acetate, butyl alcohol, D.W의 용매로 추출해 대표적인 그람 양성, 음성 세균에 대한 항균활성을 확인하고, 각 용매 추출물별 최소저해농도(MIC)를 측정하였다. 또한 MDBK (Madin-darby bovine kidney) 세포와 BVD (Bovine viral diarrhea) 바이러스에 대한 세포독성 및 항바이러스 활성을 측정하였다.
- 삼백초 추출물을 녹인 dimethyl sulfoxide (DMSO)에대한 세포독성시험은 세포 부착성 시험(cell attachment test)을 이용하였다. 계대 배양된 MDBK 세포를 회수하여 3.
- 삼백초의 용매 별 추출 및 분획물에 따른 효과를 알아보기 위하여 극성에 따라 용매 별로 분획하여, 항균활성 및 최소저해농도를 측정하였다. 그 결과, Gram (＋)에서는 n-hexane 분획물이 항균 활성을 보인 반면 Gram (－)에서는 항균 효과가 나타나지 않았으며, 최소저해농도는 Gram (＋)에서 1.
대상 데이터
- 세포독성 시험 및 항바이러스 시험에 사용한 MDBK 세포와 MDBK 세포를 숙주세포로 자라는 BVD virus 는 ATCC로부터 분양 받아 사용하였다. MDBK 세포의 유지 배양용 배지는 5% fetal bovine serum (FBS, GIBCO/BRL, USA)과 Anti (Antibiotic-Antimycotic, GIBCO/USA) 1% (GIBCO, USA)가 포함된 minimum essential medium alpha (MEMA, Thermo, USA)을 사용 하였으며, 90% 이상의 monolayer 층을 형성시킨 후, 계대 배양하여 사용하였다.
- 대조군으로는 1 ml의 D.W에 amoxicillin 10 μg을 녹여 그람양성균 Staphylococcus aureus와 Bacillus subtilis 양성대조군으로서 사용하였고, colistin sulfate 역시 같은 농도로 녹여 그람음성균 Escherichia coli와 Salmonella typhimurium에 사용하였다.
- 삼백초 추출물의 항균활성에 사용한 균주는 Table 1에 나타낸 바와 같이 그람양성균 2종 Bacillus subtilis (KCCM 11774), Staphylococcus aureus (KCCM1335)과 그람음성균 2종 Escherichia coli (KCCM 12181), Salmonella typhimurium (KCCM11862)을 선정하여 한국미생물보존센터(KCCM)에서 분양 받아 사용하였다. 사용 배지로는 Mueller Hinton Broth (Difco, USA), Agar (Difco, USA)를 사용하였다.
- 삼백초 추출물의 항균활성에 사용한 균주는 Table 1에 나타낸 바와 같이 그람양성균 2종 Bacillus subtilis (KCCM 11774), Staphylococcus aureus (KCCM1335)과 그람음성균 2종 Escherichia coli (KCCM 12181), Salmonella typhimurium (KCCM11862)을 선정하여 한국미생물보존센터(KCCM)에서 분양 받아 사용하였다. 사용 배지로는 Mueller Hinton Broth (Difco, USA), Agar (Difco, USA)를 사용하였다.
- 삼백초는 경상남도 하동군 화개면 탑리 화개장터에서 건조된 잎을 구입하여 사용하였다.
- 세포독성 시험 및 항바이러스 시험에 사용한 MDBK 세포와 MDBK 세포를 숙주세포로 자라는 BVD virus 는 ATCC로부터 분양 받아 사용하였다. MDBK 세포의 유지 배양용 배지는 5% fetal bovine serum (FBS, GIBCO/BRL, USA)과 Anti (Antibiotic-Antimycotic, GIBCO/USA) 1% (GIBCO, USA)가 포함된 minimum essential medium alpha (MEMA, Thermo, USA)을 사용 하였으며, 90% 이상의 monolayer 층을 형성시킨 후, 계대 배양하여 사용하였다.
- W에 amoxicillin 10 μg을 녹여 그람양성균 Staphylococcus aureus와 Bacillus subtilis 양성대조군으로서 사용하였고, colistin sulfate 역시 같은 농도로 녹여 그람음성균 Escherichia coli와 Salmonella typhimurium에 사용하였다. 음성대조군으로는 DMSO를 사용하였다.
- 각 추출물의 항균활성은 각 균주를 대상으로 Paper disc diffusion assay로 측정하였다. 항균시험용 평판배지는 Mueller-Hinton Agar (MHA, Difco/USA) 배지를 사용하였다. 각각의 균을 106으로 희석한 후 면봉도 말법을 이용하여 MHA배지에 도말하였다.
- 항균효과를 알아보기 위해 B. subtilis, S. aureus, E. coli, S. typhimurium를 이용하였으며, 항바이러스 효과를 알아보기 위해 소 설사병 바이러스인 BVD virus를 이용하였다. 항균효과는 n-hexane 분획물에서 Gram (＋)인 B.
이론/모형
- 각 추출물의 항균활성은 각 균주를 대상으로 Paper disc diffusion assay로 측정하였다. 항균시험용 평판배지는 Mueller-Hinton Agar (MHA, Difco/USA) 배지를 사용하였다.
- MDBK cell toxicity가 나타나지 않는 삼백초 분획물의 최대적정농도를 설정하여, 그 이하의 농도에서부터 항바이러스 시험에 이용하였다. 바이러스 감염가 측정은 바이러스 감염 후 5일째 50% 이상의 CPE가 발생한 well의 희석단계를 Reed-Muench method로 설정하고 log TCID 50/ml 로 표기하였다(Hierholzer와 Killington, 1996).
- 삼백초 추출물에 대한 항바이러스 시험은 end-point dilution assay인 50% tissue culture infectious dose (TCID 50)를 이용하여 측정하였다. MDBK cell toxicity가 나타나지 않는 삼백초 분획물의 최대적정농도를 설정하여, 그 이하의 농도에서부터 항바이러스 시험에 이용하였다.
성능/효과
- 15 mg/ml의 농도로 24시간 동안 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정하였다. 그 결과 Fig. 2와 같이 B. subtilis에서는 1.25 mg/ml에서 최소 저해농도를 나타내었으며, S. aureus에서는 2.5 mg/ml 에서 최소저해농도를 나타내었다.
- 그 결과, Gram (＋)에서는 n-hexane 분획물이 항균 활성을 보인 반면 Gram (－)에서는 항균 효과가 나타나지 않았으며, 최소저해농도는 Gram (＋)에서 1.25∼2.5 mg/ml 로 나타났다.
- W에서도 나타내지 않았다. 그러나 n-hexane 분획물에서는 0.6 mg/ml에서 1.4 log가 감소한 것으로 보아, 항바이러스 효과가 다른 분획물에 비해 상대적으로 뛰어난 것으로 나타났다.
- W에 따른 삼백초(Saururus chinensis)의 건조된 잎 추출물을 이용한 미생물에 대한 항균활성을 나타낸 결과는 Table 1에 나타내었다. 디스크 확산법에 의해 삼백초의 항균활성을 측정한 결과, Gram (－) 2종은 항균활성이 나타나지 않은 반면에 Gram (＋)에서는 항균활성이 나타나는 것을 알 수 있었다. 특히, 항균활성이 가장 높게 나타난 것은 n-hexane 분획물로 Gram (＋)인 B.
- 삼백초 분획물의 수용성 상태를 만들기 위한 DMSO의 MDBK에 대한 세포독성을 알아보기 위하여, DMSO를 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.7, 0.3%로 실험한 결과 Fig. 3에서와 같이 0.7%에서 cell toxicity가 적음을 알 수 있다. 따라서 DMSO 0.
- 삼백초 추출 및 분획물의 세포 독성과 항바이러스 효능을 확인한 결과, 삼백초 분획물은 세포가 부착및 증식하면서 독성을 일으키지 않는 농도는 각 용매별로 다른 값을 나타냈으며, TCID 50을 이용하여 BVD 바이러스에 대한 항바이러스 활성 측정 결과, n-hexane 분획물에서만 0.6 mg/ml에서 1.4 log가 감소한 것으로 보아 n-hxane 분획물에서만 항바이러스 효능이 있는 것으로 나타내었다.
- 상기의 실험 결과, Gram (＋)에서 n-hexane 분획물이 뛰어난 항균 활성을 보였다. 따라서 삼백초 n-hexane 분획물을 대상으로 10, 5, 2.
- 25 mg/ml로 정하였다. 정해진 MNCC 값을 이용하여 BVD 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 실험한 후 TCID 50을 이용한 결과, 0.6 mg/ml에서 1.4 log가 감소함을 보이며 n-hexane 분획물에서 항바이러스 활성이 있다는 것을 나타내었다. 그러나 n-hexane을 제외한 다른 분획물에서는 항바이러스 효과가 나타나지 않았다.
- typhimurium를 이용하였으며, 항바이러스 효과를 알아보기 위해 소 설사병 바이러스인 BVD virus를 이용하였다. 항균효과는 n-hexane 분획물에서 Gram (＋)인 B. subtilis와 S. aureus에서 높은 항균력이 관찰되었으며 농도별 최소저해농도(MIC)를 측정한 결과, B. subtilis에서는 1.25 mg/ml이 관찰되었다. 이는 B.
후속연구
- 본 연구에서는 예로부터 민간에서 사용해온 삼백초를 이용하여 항균 효과 및 BVD 바이러스에 대한 항바이러스 효과를 동시에 나타낼 수 있는 물질탐색을 목적으로 하였으며 그 실험 결과 삼백초 n-hexane 분획물이 항균 및 항바이러스 양쪽에 효능이 관찰되었다. 따라서 삼백초 추출 분획물은 항균 및 항바이러스 효능을 동시에 지닌 천연소재로서 이용 가능함을 확인할 수 있었으며 가축 질병 예방 및 치료를 위한 기본 연구자료로 이용될 수 있는 동시에 화학적 항생제를 대체할 수 있는 천연소재 개발을 위한 자료로서 활용이 가능할 것으로 사료된다.
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